內皮抑素30肽抑制HepG2細胞侵襲轉移的機制

郭紅艷 李淑艷 衣同輝 張春晶

(齊齊哈爾醫學院生物化學教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

內皮抑素30肽抑制HepG2細胞侵襲轉移的機制

郭紅艷 李淑艷 衣同輝 張春晶

(齊齊哈爾醫學院生物化學教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目的探討RGD修飾的人內皮抑素30肽抑制HepG2細胞侵襲轉移的機制。方法以人內皮抑素27肽作為對照，采用細胞增殖實驗和Transwell實驗分別檢測30肽對HepG2細胞增殖和侵襲能力的影響，同時篩選與侵襲作用相關的整合素；免疫熒光檢測30肽對HepG2細胞表面αvβ3整合素的聚集作用；RT-PCR及Western印跡檢測30肽對細胞誘導型環氧合酶(iCOX-2)、基質金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9 mRNA和蛋白表達的影響。結果30肽能明顯抑制HepG2細胞增殖、侵襲，對侵襲作用的影響與整合素αvβ3相關，同時30肽能下調HepG2細胞中iCox-2、MMP-2 和MMP-9 mRNA及蛋白表達，30肽加入αvβ3抗體后，上述作用明顯增強。結論30肽可通過整合素αvβ3發揮其抗腫瘤侵襲轉移作用。

內皮抑素；RGD序列；細胞侵襲；基質金屬蛋白酶；環氧合酶

內皮抑素是一種內源性血管生成抑制劑〔1〕，由膠原蛋白ΧⅧ羧基端的184個氨基酸殘基組成，近年發現其具有抑制腫瘤生長、改善肺纖維化作用，且與其他多種疾病相關〔2,3〕。已有研究證實，內皮抑素活性區主要在N端的27個氨基酸上，且30肽具有比內皮抑素更強的抑制血管生成和抑制腫瘤細胞增殖的活性〔4〕，前期研究證明，30肽具有抑制人SGC-7901細胞增殖、侵襲的能力〔5〕，本文擬在前期研究的基礎上，研究其發揮抑制腫瘤侵襲與轉移的作用機制。

1 材料與方法

1.1試劑 RPMI1640細胞培養基(Gibco)、新生牛血清(PAA)、胰酶(DIFCO)購于Invitrogen (USA)公司。Matrigel(E1270)、葡聚糖凝膠G15(Pamacia)購買于Sigma公司，幾丁質親和層析樹脂(NEB)購買于NEB公司，WST-1細胞增殖試劑盒購于瑞士Roche公司，抗體(抗-α5、抗-β1、抗-β3及抗-αvβ3)、抗基質金屬蛋白酶(MMP)-2抗體、抗環氧合酶(Cox-2)、抗β-actin抗體及二抗購自美國Santa Cruz公司，抗MMP-9購自美國cell signaling公司。Transwell小室購自美國Corning Costar公司，RNA提取試劑盒購于美國Promega公司，RT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1.230肽對HepG2細胞生長和活力的影響 人肝癌細胞株HepG2(購于中國上海細胞生物所)，常規方法培養。取HepG2細胞，調整細胞密度為1×104個/ml，每孔100 μl分別加到96孔培養板中，培養24 h細胞貼壁后向各孔中分別加入30肽和27肽(濃度分別為0，20，40，60，80和100 μg/ml，每個濃度設5個復孔)。分別培養24和48 h后棄去加肽培養基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，每孔加入100 μl無血清培養基，10 μl WST-1，繼續在5%CO237℃孵箱中培養1 h，用酶標儀(Bio-Rad)測定各孔光吸收值，選擇450 nm為測定波長，630 nm為參考波長，以肽濃度為橫坐標，吸光度值(%)為縱坐標繪制曲線。

1.330肽對HepG2細胞侵襲能力的影響 30肽分離及純化方法見參考文獻〔5〕。設立對照組、27肽組和30肽組，對照組細胞未經肽處理，27肽組和30肽組細胞分別經50 μg/ml 27肽和30肽處理24 h。將細胞懸液加到Transwell小室中(1×105個)，孔板下室加入含20%FBS的RPMI1640培養液，37℃，5%CO2培養箱內孵育24 h，吸棄上室中的溶液，用棉簽輕輕擦去小室內側壁未轉膜的細胞，用0.1%結晶紫染小室膜20 min，晾干，在100倍顯微鏡下計數侵襲細胞數，拍照保存，每膜計數5個不同視野的穿膜細胞數，計算平均值，每組設3個平行孔。同時，我們選用幾種常見的整合素α5、β1、β3和αvβ3，以單獨30肽為對照組，30肽分別加入整合素為實驗組，檢測整合素對30肽作用的影響。

1.4免疫熒光檢測30肽對αvβ3整合素的聚集作用 設立對照組、27肽組和30肽組。取對數生長期HepG2細胞，5×105個細胞/孔接種24孔培養板，孵育24 h，給藥組分別加入終濃度為50 μg/ml的27肽和30肽，對照組加入相同體積PBS，繼續培養24 h，PBS沖洗2次，4%多聚甲醛固定20 min，5%BSA封閉30 min，每孔加入αvβ3一抗，置于4℃濕盒內過夜，PBS振洗3次，每孔加入FITC標記的二抗，37℃1 h，PBS沖洗3次，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5RT-PCR檢測30肽對誘導型Cox(iCox)-2、MMP-2和MMP-9 mRNA表達的影響 用RT-PCR方法檢測：iCox-2、MMP-2和MMP-9 mRNA在30肽及27肽作用下的變化，終濃度為50 μg/ml 30肽和27肽分別作用HepG2細胞0、12、24、48 h后，提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，PCR引物序列見表1，PCR反應條件如下：94℃預變性2 min，94℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸60 s，循環次數為35個循環(β-actin為30個循環)；擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外線下凝膠置于成像系統下進行拍照，記錄。另外分別用50 μg/ml 30肽、50 μg/ml αvβ3抗體和50 μg/ml 30肽+50 μg/ml αvβ3抗體作用于HepG2細胞24 h，后續處理同上，分別檢測細胞中iCox-2、MMP-2和MMP-9 mRNA。

表1 引物序列、產物長度和退火溫度

1.6Western印跡檢測30肽對iCox-2、MMP-2和MMP-9蛋白表達的影響 用Western印跡方法檢測iCox-2、MMP-2和MMP-9蛋白在30肽及27肽作用下表達的變化。終濃度為50 μg/ml 30肽和27肽分別作用HepG2細胞0、12、24、48 h后，分別收集細胞800 r/min，離心5 min，提取蛋白，檢測細胞總蛋白濃度。取50 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，封閉液中室溫封閉2 h，加入相應稀釋倍數的一抗，4℃孵育過夜，洗膜后，加入1∶5 000的辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗室溫孵育2 h，采用化學發光法(ECL)曝光膠片，沖洗顯色檢測相應的蛋白條帶，GPS8000型凝膠成像分析系統掃描分析蛋白條帶。另外設立30肽組和30肽+αvβ3抗體組，分別用50 μg/ml 30肽和30肽+αvβ3抗體作用于HepG2細胞24 h，后續處理同上，分別檢測細胞中iCox-2、MMP-2 和MMP-9蛋白表達。

1.7統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析及t檢驗。

2 結 果

2.130肽對HepG2細胞增殖的影響 不同濃度的30肽和27肽(0～100 μg/ml)，培養24和48 h，細胞的增殖均明顯受到抑制，呈時間劑量依賴性，30肽的抑制作用顯著強于27肽。應用線性回歸分析計算出30肽對HepG2細胞生長半數抑制濃度為49.7 μg/ml，見表2。

表2 30肽對HepG2細胞增殖活性的影響

與同時間點前一濃度比較：1)Plt;0.05；與同濃度前一時間點比較：2)Plt;0.05；與同時間點同濃度27肽比較：3)Plt;0.05

2.230肽對HepG2細胞侵襲能力的影響 對照組、27肽組和30肽組的穿膜細胞數分別是(205.6±20.13)個，(132.9±13.55)個，(71.25±9.45)個。肽處理組的穿膜細胞數均明顯低于對照組，30肽組穿膜細胞數顯著低于27肽組(Plt;0.05)。30肽分別加入α5、β1、β3、αvβ3整合素抗體后，穿膜細胞數分別為(80±8.02)個，(79.17±8.12)個，(82.5±8.19)個，(39.99±4.35)個?？梢?0肽加入αvβ3抗體后，HepG2細胞的侵襲能力得到進一步抑制(Plt;0.05)，其余抗體對 30肽抑制HepG2細胞侵襲能力的作用不明顯(Pgt;0.05)。見圖1。

圖1 30肽和整合素對HepG2細胞侵襲能力的影響(×100)

2.330肽對αvβ3整合素的聚集作用 與對照組及27肽組相比，30肽組HepG2細胞表面αvβ3明顯聚集成簇，見圖2。

2.4RT-PCR檢測iCox-2、MMP-2 和MMP-9 mRNA表達 iCox-2、MMP-2 和MMP-9 mRNA表達量隨著27肽和30肽作用時間的延長而下調，30肽在24 h開始iCox-2、MMP-2和MMP-9 mRNA的表達較27肽組明顯降低(Plt;0.05)。與30肽組和αvβ3抗體組相比，30肽+αvβ3抗體組明顯下調iCox-2、MMP-2 和MMP-9 mRNA表達量(Plt;0.05)，見表3，圖3，表4。

圖2 30肽對αvβ3整合素的采集作用(免疫熒光，×400)

組別iCOX-2/β-actin0h12h24h48hMMP-2/β-actin0h12h24h48hMMP-9/β-actin0h12h24h48h27肽組1.73±0.131.67±0.161.58±0.251.52±0.112.07±0.311.90±0.211.78±0.291.56±0.232.12±0.281.93±0.271.77±0.291.62±0.2930肽組1.71±0.171.64±0.201.44±0.161)1.18±0.231)1.99±0.251.82±0.271.45±0.251)1.29±0.221)2.08±0.291.76±0.171.58±0.271)1.27±0.281)

與27肽組比較：1)Plt;0.05

圖3 30肽及整合素αvβ3對HepG2細胞iCox-2、MMP-2 和MMP-9 mRNA表達的影響

組別iCOX-2/β-actinMMP2/β-actinMMP9/β-actin30肽組2.80±0.301)1.98±0.191)1.88±0.181)αvβ3組2.78±0.241)1.97±0.221)1.83±0.151)30肽+αvβ3組2.43±0.281.51±0.151.66±0.14

與30肽+2vβ3組比較：1)Plt;0.05

2.5Western印跡檢測iCOX-2、MMP-2 和MMP-9蛋白表達 iCOX-2、MMP-2 和MMP-9蛋白表達量隨27肽和30肽作用時間的延長而下調，與27肽組相比，30肽組在24 h開始降低iCox-2、MMP-2 和MMP-9蛋白表達(Plt;0.05)。與30肽組和αvβ3抗體組相比，30肽+αvβ3抗體組明顯下調iCox-2、MMP-2和MMP-9蛋白表達量。見圖4，表5，表6。

圖4 30肽及整合素αvβ3對HepG2細胞iCox-2、MMP-2 和MMP-9蛋白表達的影響

組別iCOX-2/β-actin0h12h24h48hMMP-2/β-actin0h12h24h48hMMP-9/β-actin0h12h24h48h27肽組1.77±0.171.66±0.161.56±0.151.48±0.221.70±0.171.68±0.161.63±0.191.53±0.121.74±0.271.68±0.241.63±0.251.57±0.1930肽組1.76±0.211.59±0.161.37±0.151)1.14±0.161)1.73±0.171.67±0.191.25±0.151)0.92±0.111)1.70±0.291.67±0.161.46±0.151)1.20±0.131)

與27肽組比較：1)Plt;0.05

表6 整合素αvβ3對HepG2細胞iCox-2、MMP-2 和MMP-9蛋白表達的影響

與30肽+αvβ3組比較：1)Plt;0.05

3 討 論

在腫瘤轉移過程中，腫瘤細胞侵襲基底膜是重要環節，重組基底膜侵襲實驗能較好地反映腫瘤細胞的侵襲能力〔6,7〕。30肽比27肽多出一個RGDRGD序列，30肽抑制腫瘤細胞增殖、侵襲能力強于27肽，必定與其中的RGDRGD序列相關。RGD序列是指包含Arg-Gly-Asp 三肽的序列，細胞外基質中的蛋白質借助其中的RGD序列識別并結合不同亞型的整合素，將細胞外信息傳入細胞內，引發一系列病理生理變化，調節腫瘤細胞黏附，影響腫瘤細胞的增殖、轉移及凋亡。

整合素在體內大多數細胞表面廣泛表達,在多種生命活動中發揮關鍵作用〔8〕,與腫瘤等疾病密切相關〔9〕，具有RGD序列的小分子多肽會和細胞外基質蛋白質競爭與整合素的結合，產生去整合素效應。有文獻報道，Cox-2與腫瘤的浸潤、轉移、發生、發展、分化及預后過程密切相關〔10〕。Cox-2表達量與癌癥的惡性程度呈正相關〔11,12〕。Elzagheid等〔13〕研究認為αvβ3整合素信號通路參與了對Cox-2表達的調節，同時Cox-2對腫瘤細胞轉移的調節又與其下游MMPs等的表達和活性密切相關，Cox-2以前列腺素(PGs)依賴方式調節肝癌細胞分泌MMPs，繼而影響肝癌細胞的黏附和移行〔14，15〕。

本研究表明，RGD序列修飾的內皮抑素30肽不僅能顯著抑制腫瘤細胞的生長與增殖，還能有效地抑制肝癌細胞HepG2的侵襲與轉移。30肽抑制腫瘤細胞侵襲、轉移的能力明顯大于內皮抑素27肽，其機制可能是30肽通過RGDRGD序列與αvβ3整合素結合，下調iCox-2、MMP-2和MMP-9的表達，進而降低腫瘤細胞降解細胞外基質的能力，抑制腫瘤細胞的體外黏附、侵襲和遷移能力。

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〔2016-10-08修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

R735.2

A

1005-9202(2017)21-5261-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.019

齊齊哈爾醫學院博士專項科研項目(No.QY2016B-20)

李淑艷(1968-)，女，教授，博士，主要從事腫瘤分子治療研究。

郭紅艷(1979-)，女，講師，博士，主要從事腫瘤分子生物學機制研究。