光學顯微系統的圖像質量優化方法

崔長彩， 張勇貞， 易定容， 孔令華， 劉志群

(1. 華僑大學 制造工程研究院， 福建 廈門 361021；2. 華僑大學 機電及自動化學院， 福建 廈門 361021；3. 福建工程學院 機械與汽車工程學院， 福建 福州 350118)

光學顯微系統的圖像質量優化方法

崔長彩1， 張勇貞1， 易定容2， 孔令華3， 劉志群2

(1. 華僑大學 制造工程研究院， 福建 廈門 361021；2. 華僑大學 機電及自動化學院， 福建 廈門 361021；3. 福建工程學院 機械與汽車工程學院， 福建 福州 350118)

為了改善顯微成像系統的照明均勻度和光照度，對透射式顯微鏡照明裝置中的聚光鏡進行優化設計.首先，分析由雙透鏡組成的阿貝聚光鏡光軸不對中、通光孔徑小等問題對成像質量帶來的負面影響.然后，提出用單一非球面透鏡替代雙透鏡聚光鏡來改善成像質量的方法.最后，實測聚光鏡改進前后的照明裝置對顯微鏡照明均勻度和光照度等關鍵性能指標的影響.實驗結果表明：在20X，40X物鏡下，使用單個非球面透鏡組成的聚光鏡的照明裝置的照明均勻度分別達到0.50%和0.66%，比改進前的雙透鏡聚光鏡的均勻度提高5倍；同時，優化聚光鏡后的照明裝置光照度比優化前分別提高了15%和17%.實際樣本實驗也表明，使用單個非球面鏡聚光鏡的照明裝置能有效提高照明均勻度和光照度，可以改善透射式光學顯微鏡的成像質量.

照明均勻度； 光照度； 非球面透鏡； 阿貝聚光鏡； 光學顯微成像方法

隨著全自動數字掃描顯微成像技術的發展，光學顯微成像技術在病理診斷上的應用越來越廣泛.病理診斷和生物檢測的成像過程中對圖像質量要求越來越高[1-2]，圖像的好壞直接影響光學顯微系統的評定、自動對焦精度等問題[3].照明裝置是光學顯微成像系統的重要組成部分，其照明均勻度和光照度是影響顯微成像系統圖像質量的兩個重要因素.光學顯微系統的性能直接受照明均勻度和光照度的影響，文獻提出分別采用軟件和硬件的方法來提升照明均勻度和光照度的性能.李慶忠等[4]運用小波變換算法增強圖像照度；梁琳等[5]闡述了圖像增強算法對不同領域的圖像均勻性提升；朱珂漢等[6]采用掩膜法對透射顯微鏡的照明均勻度進行了有效校正.軟件算法雖在一定程度上提高圖像質量，但往往容易受背景與樣本的對比度影響，改善效果并不明顯.硬件優化則是在成像前對照明光路做了改進.朱曉萌等[7]在基于鹵素燈光源的基礎上研制了一套FF-OCT成像系統，使用改進型科勒照明裝置在提升圖像質量方面取得了不錯的效果；Deng等[8]早期將近百個復眼透鏡陣列植入聚光裝置內，顯著地改善了成像均勻性；王沛沛等[9]利用雙排復眼透鏡實現大面積均勻照明.由于復眼透鏡太小加工難度大、成本高且工作環境要求嚴格，較少在普通生物顯微鏡上應用.本文采用只包含單個非球面透鏡的聚光鏡來同時提升照明均勻度和光照度，實驗結果證明該方法可行.

1 顯微鏡照明裝置的原理與優化分析

1.1顯微鏡的照明裝置

圖1 科勒照明原理Fig.1 Principle of Kohler illumination system

常用顯微鏡的照明裝置有臨界照明和科勒照明.臨界照明實際上就是把光源(比如燈絲)直接成像到被照物體上的一種照明方法.這種照明方法容易實現且光能利用率高，相當于在物平面上放置光源，但容易受光源表面亮度不均勻或細小的結構影響.觀測生物標本一般采用比臨界照明裝置具有更高均勻度的科勒照明.常規科勒照明的原理，如圖1所示.由圖1可知：燈絲產生的鹵素光源經集光鏡在光闌2成像，再由聚光鏡將光闌2得到的光在物鏡的入口成像(一般為無窮遠處)；同時，聚光鏡還將光闌1進入的光成像于標本面上；光闌1，2可以分別調整光源的入光孔徑和視場成像光闌，分別稱為孔徑光闌和視場光闌.因此，科勒照明能夠獲得均勻的照明效果.

在科勒照明中，聚光鏡在孔徑光闌和視場光闌的成像時都扮演重要的作用，可以保證系統的照明均勻度.因此，對聚光鏡具有非常高的要求.聚光鏡通常是由多個透鏡組成，多透鏡軸向是否對中是影響聚光鏡性能的主要因素.透射光照明成像系統結構簡圖，如圖2所示.通過改進多透鏡組是提高照明裝置的光照度和均勻性的方法之一.

圖2 透射光照明成像系統結構簡圖Fig.2 Framework of illumination imaging system

1.2顯微成像系統的照明均勻度和光照度

采用均勻度和光照度指標分析顯微成像質量.由光照度的定義[10-11]可知，光照度(E)、光強值(I)、光源與受照面積之間的距離(R)、光源通過照明裝置的孔徑角(γ)之間的關系為

由此可知：光照度和點光源的光強成正比，與光照距離平方成反比，與孔徑角γ的余弦值成正比.當γ=0(即垂直照明)時，光照度達到最大.

由光照度可得照明均勻度的定義[12]為

1) 光照度的度量.光照度的度量采用平均灰度值的比率(η)度量，計算式為

2) 均勻度的度量.均勻度表示圖像每個像素點與整體均值的偏離程度，可用變異系數cV表示，即

表1 聚光鏡的類型Tab.1 Type of condensers

點處的灰度值；M,N分別代表圖像的行、列數.

2 聚光鏡的原理與優化分析

2.1阿貝聚光鏡的工作原理

聚光鏡的分類根據畸變修正程度和使用的領域如明場、暗場、相位相反等不同而有所不同. 按畸變修正程度分類是一種較為常用的分類方法，如表1所示.

圖3 阿貝聚光鏡光路圖Fig.3 Abbe condenser optical pathway

文中的生物顯微鏡采用的是沒有對球差和色差進行畸變修正的雙透鏡阿貝聚光鏡.它由若干個光學透鏡組按軸線方向的位置關系排列組成，如圖3所示.其工作原理：從點光源發出的發散光聚集成平行光束進入聚光鏡的孔徑光闌，根據對應物鏡的數值孔徑值調整孔徑光闌保證入射的平行光以一定半徑的光通量進入聚光鏡的透鏡組中；然后，經過多次折射以光錐的形式匯聚到樣本面上；最后，由樣本面上的光以最佳的孔徑角α入射到物鏡，最終在相機成像的過程.

光線經過孔徑光闌進入阿貝聚光鏡的雙透鏡組，經過多次折射進入到物鏡的入瞳孔內.在多次折射過程中，對雙透鏡組的軸線對中要求是非常嚴格的.然而，實際工廠的組裝環境不具備光軸對中檢驗設備，難以保證透鏡組光軸的一致性.另外，光源也是影響照明均勻性的因素之一.理想點光源不具有方向性，是實現理想均勻照明的條件之一，但實際光源并非理想點光源，均勻照明時難免會受到具有方向性光源的影響.

為了盡可能地減少影響，可以通過選擇數值孔徑大的物鏡來利用系統的光通量，但光通量的增大會加劇亮度的方向選擇性.因此，由修正的不同視場β(光線范圍與光軸中心的夾角)處的照度公式可知

式(5)中：Bi為某一角度βi對應亮度值；B0為沿光軸方向的亮度值，B0值大于等于Bi；E0為沿光軸方向的照度值；Ei為某一角度βi對應的照度值，同樣地，E0值大于等于Ei.不同的βi會引起不同的光照度值變化，由此可知，光源亮度的方向性會造成視場的不均勻照明.

另外，阿貝聚光鏡的通光孔徑不能太大，否則,球差變大會導致照明均勻度變差，從而限制了光通量，影響了光照度的大小.因此，通過調整孔徑大小無法同時提高均勻度和光照度.在物鏡數值孔徑值高于0.60時，阿貝聚光鏡色差、球差容易顯現出來.因此，阿貝聚光鏡多用于普通顯微鏡上，不滿足具有高倍數且高數值孔徑的高端光學顯微成像系統的要求.

2.2非球面單透鏡聚光鏡的設計

圖4 非球面單透鏡聚光鏡仿真設計Fig.4 Single lens of aspherical condenser

阿貝聚光鏡透鏡組的光軸不對中和光源等因素會影響照明裝置的均勻度和光照度，且標本照明難以同時獲得高的均勻度和光通量.采用單透鏡聚光鏡解決光軸不對中問題，而為同時提高光通量和均勻度，采用非球面設計，即采用由單個非球面透鏡組成的聚光鏡設計方案.雖然非球面透鏡的加工復雜，但現代精準微納加工技術可以實現非球面光學透鏡加工.圖 4為非球面單透鏡聚光鏡設計，通過仿真設計得到最佳面型尺寸.圖4中：W為聚光鏡的通光孔徑，取值為49 mm；h為透鏡的最大厚度，取值為21 mm；非球面透鏡的1，2面半徑大小分別為30，60 mm的球面，球心均在X坐標軸上.

3 實驗結果與分析

3.1聚光鏡軸向高度的選取

圖5 聚光鏡的不同軸向高度成像實驗Fig.5 Experiments of condenser imaging under different axial height

由圖5可知：位置1到位置16的曲線反映隨著聚光鏡逐漸靠近樣本，圖像的灰度值越大.由此可知，聚光鏡的軸向高度對成像質量的影響是不可忽視的.因此，在對比實驗和測試樣過程中，可將聚光鏡調整為統一的軸向高度.

3.2透明樣本的對比實驗

分別選取20X和40X物鏡對樣品的照明均勻度和光照度進行測試，實驗條件,如表2所示.為了減少相機的曝光時間對成像亮度值的影響，以及保證對比實驗條件一致，滿足成像要求，在20X/NA=0.65物鏡下，選取曝光時間為5 ms，而在40X/NA=0.75物鏡下，選取曝光時間為4 ms.無樣本載玻片更有利于評價照明均勻度和光照度，因此,選用透明載玻片作為觀測樣本.為了達到聚光的最佳效果，調整聚光鏡NA值和相應放大倍數物鏡的NA值相同.

由表2可知:在20X/NA=0.65的物鏡下，測試得到采用由單個非球面透鏡組成的新聚光鏡的比率η為1.15，相比于使用雙球面透鏡的舊聚光鏡提高了15%的照度值;而在40X/NA=0.75的物鏡下，測試得到新聚光鏡的比率η為1.17，相比于舊聚光鏡提高了17%的照度值.

表2 透明樣本對比實驗條件Tab.2 Transient sample comparison experimental conditions

為了比較新舊聚光鏡的光照度，令舊聚光鏡的光照度比率(η)為1.00，新舊聚光鏡的性能對比，如表3所示.顯微鏡相機采集到的透明樣本圖片按分塊方式處理，即求取每一列像素的平均灰度值，繪制曲線如圖6所示.由圖6可知：舊聚光鏡評價曲線中心區域的灰度值大于兩側，即照明光場分布呈現余弦分布，圖像邊緣的光強約為中心光強的97%.優化后，由于光通量的增加，有效地減少了余弦分布的趨勢，即新聚光鏡的評價曲線趨勢基本趨于水平.

表3 新舊聚光鏡的性能對比Tab.3 Comparison of performance between old and new condenser

(a) 20X物鏡 (b) 40X物鏡圖6 不同倍數物鏡下透明樣本圖像處理結果Fig.6 Image processing results of transparent samples under different multiplier

測試數據表明：文中所設計的非球面單透鏡聚光鏡在20X，40X物鏡的條件下均實現了光照度的提升；不同放大倍數的數據偏差主要是在不同條件下相機曝光時間參數設置不同引起的.

3.3照明均勻度的對比實驗

分別在20X，40X物鏡條件下對透明載玻片樣本采集圖像，并計算不同條件下新舊聚光鏡獲得的圖像的cV值.在20X/NA=0.65的物鏡下，測試得到舊聚光鏡的cV值為2.22%，而采用由一個非球面單透鏡組成的聚光鏡獲取的圖像cV值可達到0.50%.在40X/NA=0.75的物鏡下，測試得到舊聚光鏡的cV值為2.86%，而采用非球面單透鏡的新聚光鏡獲取的圖像cV值可達到0.66%.cV值越小表示圖像均勻度越好，表明系統的照明均勻度越高.綜上，與傳統的雙透鏡聚光鏡相比，非球面單透鏡聚光鏡對照明裝置的均勻度有較明顯的改善.

表4 實物樣本成像條件Tab.4 Physical sample imaging experiment conditions

3.4實物樣本圖像質量對比實驗

在同樣條件下對實物樣本做成像實驗，采用Motic BA410E顯微鏡和Motic Pro285A相機,以染色細胞樣本1和標準線對板樣本2 (ready optics extreme group 11)作為觀察對象,實驗條件如表4所示.

采集的樣本優化前后聚光鏡在Motic 20X和40X物鏡下的對比結果,分別如圖7，8所示.由圖7，8可知： 由于照明均勻度受樣本干擾嚴重， 無法對測試實驗均勻度做評價.

(a) 傳統雙透鏡阿貝 (b) 單個非球面透鏡 (c) 傳統雙透鏡阿貝 (d) 單個非球面透鏡 聚光鏡下染色細胞圖 聚光鏡下染色細胞圖 聚光鏡下標準線對板圖 聚光鏡下標準線對板圖圖7 20X物鏡下新舊聚光鏡對比實驗Fig.7 Comparison between two condensers under 20X objective

(a) 傳統雙透鏡阿貝 (b) 優化后單個非球面 (c) 傳統雙透鏡阿貝 (d) 優化后單個非球面透鏡聚光鏡下染色細胞圖 透鏡聚光鏡下染色細胞圖 聚光鏡下標準線對板圖 聚光鏡下標準線對板圖圖8 40X物鏡下聚光鏡優化前后對比測試實驗Fig.8 Comparison between two condensers under 40X objective

實物測試的光照度計算方法和對比實驗的方法一致，處理數據結果如表5所示.由表5可知：同一樣本在不同放大倍數下成像對照明光照度的影響略有不同，相比于40X物鏡的視場，20X物鏡的視場范圍更大，反映更多樣本信息，優化前后的灰度值相差較大.從透明樣本對比結果(表3)顯示，在20X和40X物鏡的成像系統及相同的攝像條件下，優化后平均灰度值分別提升了28.5和26.9，而染色細胞測試的灰度差值均小于透明樣本對比的實驗結果.這是由于染色細胞的透光性較差，優化前后的差值在一定程度上有所減少，均小于對比實驗的結果差值.由表5還可知：20X物鏡下單個非球面透鏡聚光鏡的染色細胞和分辨率板的比率分別為1.15，1.15；40X物鏡下單個非球面透鏡聚光鏡的染色細胞和分辨率板的比率分別為1.18，1.17.綜合不同生物樣本的測試情況，20X和40X物鏡下新聚光裝置對光照度分別提升了15%和17%.

表5 實物光照度計算與實驗方法對比Tab.5 Comparison of physical illumination calculation and experimental method

4 結論

根據高端生物顯微鏡成像質量要求高的特點，提出使用單個非球面透鏡的聚光鏡代替傳統雙透鏡阿貝聚光鏡的方法，用于改善數字顯微成像系統的照明均勻度和光照度.實驗結果證明，在生物顯微鏡常用的20X和40X物鏡觀察下，新聚光鏡在照明均勻度方面的提升將近5倍(即cV值降低大約5倍).優化后的聚光裝置在20X物鏡下光照度的提升約為15%，40X物鏡下光照度的提升約為17%.

在不同實際觀察樣本下，相比傳統雙透鏡阿貝聚光鏡下觀察效果，單個非球面透鏡的聚光裝置能有效地改善顯微成像系統數字照明均勻度和光照度，為成像系統提供高質量圖像.與已有雙排復眼透鏡均勻照明裝置相比，兩者都能提高照明均勻度.但是，文中方法的優勢在于造價相對較低，不存在雙排復眼透鏡對準問題，因而具有更高的性價比，更適合先進生物醫學光學顯微鏡.

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(責任編輯： 陳志賢英文審校： 崔長彩)

ImageQualityOptimizationMethodofOpticalMicroscopySystem

CUI Changcai1， ZHANG Yongzhen1， YI Dingrong2， KONG Linghua3， LIU Zhiqun2

(1. Institute of Manufacturing Engineering， Huaqiao University， Xiamen 361021， China；2. College of Mechanical Engineering and Automation， Huaqiao University， Xiamen 361021， China；3. College of Mechanical and Automotive Engineering， Fujian University of Technology， Fuzhou 350118， China)

The condenser of a transmissive optical microscope was optimized for improving its illumination uniformity and intensity. First， the adverse impact on the image quality resulting from potential misalignment of optical axes and small aperture of a multi-lens Abbe condenser was discussed. Then， an optimized design was proposed by using a single aspheric lens to replace the multi-lens Abbe condenser to improve the uniformity and intensity of illumination system. Finally， experiments were conducted to investigate the effects of the single aspheric lens condenser on image quality. The experimental results showed that the illumination uniformity of the microscope with the optimized condenser reached 0.50% and 0.66% under objectives with 20X and 40X magnifications respectively which were about 5 times better than those of the two-spherical lens condenser. Meanwhile， the intensity of the microscope with the new condenser increased over 15% and 17% under 20X and 40X objective lenses respectively as compared to those of the two-lensed system. Therefore， the optimized illumination system with a single aspheric lens can effectively improve the image uniformity and the intensity of the microscope， which results in an image of better quality.

illumination uniformity； illumination intensity； aspheric lens； abbe condenser； optical microscope imaging method

10.11830/ISSN.1000-5013.201703056

TP 394.1； TH 691.9

A

1000-5013(2017)06-0768-06

2017-03-24

崔長彩(1972-)，女，教授，博士，主要從事表面形貌評定技術、表面形貌測量技術及自動測量儀器的研究.E-mail:cuichc@hqu.edu.cn.

國家自然科學基金資助項目(51235004， 51475176)