一例羊源肺炎克雷伯菌和大腸桿菌混合感染的診斷

費中杰 揚州大學獸醫學院 225001

一例羊源肺炎克雷伯菌和大腸桿菌混合感染的診斷

費中杰 揚州大學獸醫學院 225001

2016年11月，泰州市某畜主送2只病羊到揚州某動物醫院就診。病羊主要表現為精神沉郁、眼睛紅腫、咳嗽。從病羊中分離出一株肺炎克雷伯菌和一株大腸桿菌。藥敏試驗結果表明，兩種菌株對諾氟沙星和氧氟沙星等藥物高敏，對青霉素和紅霉素等藥物耐藥。根據藥敏試驗結果及時調整用藥方案，從而使病情迅速得到控制。

羊；肺炎克雷伯菌；大腸桿菌

肺炎克雷伯菌廣泛分布于動物的呼吸道和消化道中，是一種條件致病菌。該菌在韓國、歐洲和非洲等地都有報道，并呈現增多的趨勢[1]。近年來由于抗生素的濫用，導致肺炎克雷伯菌的耐藥性普遍存在，給治療帶來困難[2]。本研究從病死湖羊的組織中分離培養出一株肺炎克雷伯菌和一株大腸桿菌，通過實驗室診斷和藥敏試驗，為病羊的診斷與治療提供依據。

1 材料

（1）病料來源。泰州某養殖場2只湖羊。

（2）主要試劑。血平板培養基、麥康凱瓊脂培養基、腸桿菌科細菌生化鑒定管 （杭州微生物）、16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit（寶生物工程有限公司）和大腸桿菌診斷血清（杭州微生物）等。

2 方法

（1）剖檢病變。剖檢可見肺淤血、壞死，心外膜增厚，肝臟腫大、壞死，腸道出血，其他組織器官無特征病變。

（2）細菌分離培養。用接種環挑取病變臟器內部組織，在麥康凱平板劃線，放入37°C恒溫箱中培養18小時，觀察結果。

（3）革蘭氏染色鑒定。挑取疑似菌落進行固定，滴加結晶紫初染1分鐘、碘液1分鐘、乙醇脫色0.5分鐘、沙黃水溶液復染30秒，吸干，鏡檢[3]。

（4）生化試驗。菌株1和菌株2均屬于腸桿菌科，用腸桿菌科細菌生化鑒定管鑒定。

（5）血清型鑒定。將菌株1和菌株2用大腸桿菌診斷血清做玻板凝集試驗進行鑒定。

（6）16S rRNA基因序列測定。將純化好的菌液煮沸法提取DNA作為PCR模板，用16SrDNA Bacterial PCR Kit試劑盒中的通用引物進行擴增。將擴增產物送去金斯瑞公司進行測序，測序結果在NCBI數據庫進行BLAST分析。

（7）藥敏試驗。取純化好的菌液滅菌棉簽在LB培養基上涂抹均勻，再用滅菌鑷子將藥敏紙片貼于培養基上。然后將培養基置于37℃培養箱中，經18～24小時用尺測量抑菌圈直徑。

3 結果

（1）細菌形態。分別挑取單菌落進行純化培養，分離到2種菌株。菌株1在麥康凱培養基上形成圓形隆起、光滑、濕潤、邊緣整齊、偏大的紅色菌落，在血培養基上形成圓形隆起、光滑、濕潤、較大的灰白色菌落。菌株2與菌株1相似，顏色偏淡，形態較小。

（2）革蘭氏染色結果。菌株1在光學顯微鏡下可以觀察到粉紅色的直桿菌，菌體較大，兩端鈍圓，散在或成對。菌株2與1相似，形態較小。

（3）生化試驗結果。菌株1對照伯杰氏細菌手冊，鑒定結果該菌株為大腸桿菌。菌株2鑒定結果該菌株為肺炎克雷伯菌（見表1）。生化特性與楊紅軍等研究一致[4]。

表1 生化試驗結果

（4）血清型鑒定結果。將菌株1和菌株2分別進行血清型鑒定，通過大腸桿菌診斷血清，玻板凝集試驗確定菌株1是大腸桿菌，血清型是020。

（5）16S rDNA序列測定。菌株2PCR擴增的產物條帶為1800bp（見圖1）。序列與肺炎克雷伯菌的序列同源性達到99%以上（見圖1）。

圖1 1%瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 序列比對圖

（6）藥敏試驗結果。菌珠1和2分別選用24種藥物做藥敏試驗。結果表明大腸桿菌對頭孢唑啉等13種藥物高敏，對頭孢氨芐等4種藥物中敏，對苯唑西林等7種藥物耐藥；肺炎克雷伯菌對頭孢唑啉等8種藥物高敏，頭孢氨芐等4種藥物中敏，對紅霉素等12種藥物耐藥（見表2）。

表2 藥敏試驗結果（單位：mm）

4 小結與討論

（1）肺炎克雷伯菌是羊腸道中的一種常在菌，在飼養管理不善的養殖場，肺炎克雷伯菌病經常發生，從而給養殖場造成嚴重的經濟損失。

（2）在觀察疑似菌落時注意大腸桿菌，大腸桿菌和肺炎克雷伯菌的顏色、形態相似，而且少數大腸桿菌對羊具有致病性。通過血清型鑒定，分離出大腸桿菌的血清型是020，結合相關文獻研究，確定血清型020對羊沒有致病性[5]，從而確認肺炎克雷伯菌是致病菌，需要開展動物試驗進一步確認。

（3）藥敏實驗結果顯示，大腸桿菌和肺炎克雷伯菌均對喹諾酮類藥物高敏，用諾氟沙星對羊群進行預防治療，使疫情得到了控制。在臨床用藥過程中，我們應當選擇敏感性高的藥物治療。

[1]Shon AS，Bajwa RP，Russo TA， Hypervirulent（hypermucoiscous）Klebsiella pneumoniae：a new and dangerous breed.[J]Virulence.2013，4（2）：107-118.肺炎克雷伯菌的分離與鑒定[J].中國獸醫雜志，2012，48（2）:1-2.

[2]張智，李再新，曾光菊，李丙超，胡衛東，趙志平，劉章琴，陳欲云.一株兔源耐藥性肺炎克雷伯菌的分離與鑒定[J].中國畜牧獸醫，2013，40（9）:1-5.

[3]李超，王玉英，王冬冬，范丹丹，王平，紀鴻翔，尹燕博.引起幼貂大量死亡的肺炎克雷伯菌的分離和鑒定 [J].中國獸醫雜志，2015，11（51）:1-4.

[4]楊紅軍，陳海華，孫鳳青，王豪舉，彭遠義，張建明.雞肺炎克雷伯菌的分離鑒定[J].中國獸醫雜志.2009，7（45）:1-2.

[5]黃青云.畜牧微生物學[M].北京：中國農業出版社，2009，5:220-221.