穿膜肽修飾紫杉醇和他莫昔芬脂質體中主藥含量測定

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1.北京石油化工學院制藥工程系，北京 102617；2.遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 116600

穿膜肽修飾紫杉醇和他莫昔芬脂質體中主藥含量測定

居瑞軍1程嵐2彭效明1王騰1李翠清1王嬌2李學濤2*

1.北京石油化工學院制藥工程系，北京 102617；2.遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 116600

目的測定穿膜肽(TAT)修飾的紫杉醇和他莫昔芬脂質體中的主藥含量。方法采用薄膜分散法和硫酸銨梯度法制備穿膜肽修飾紫杉醇和他莫昔芬脂質體；通過高效液相色譜法測定脂質體中紫杉醇和他莫昔芬的含量。結果TAT修飾的空白脂質體對主藥含量的測定無干擾；TAT修飾的紫杉醇和他莫昔芬脂質體中紫杉醇和他莫昔芬分別在0.13～1.3μg和0.16～1.6μg范圍內線性關系良好，回收率均在97%以上，RSD均小于1.0%，精密度的相對標準偏差均小于2.0%；脂質體中紫杉醇的平均含量為23.6μg/mL，他莫昔芬的平均含量為8.6μg/mL。結論所建立的HPLC方法準確可靠、簡便快速、重復性好，可用于TAT修飾紫杉醇和他莫昔芬脂質體的質量控制。

穿膜肽；紫杉醇；他莫昔芬；脂質體；高效液相色譜法；含量測定

脂質體具有類似生物細胞的結構，作為藥物載體進入體循環后，可通過其粒徑效應進入血管通透性顯著增強的腫瘤病灶處，進而提高抗腫瘤藥物的治療指數，降低藥物的治療劑量，減少藥物的毒副作用[1]。紫杉醇(Paclitaxel，PTX)提取于紅豆杉科短葉紅豆杉(TaxusBrevifolia)，屬二萜類生物堿，為白色結晶性粉末，不溶于水，易溶于氯仿、丙酮等有機溶劑[2-3]。其抗癌作用機理是在細胞增殖期的G2期，抑制紡錘體和紡錘絲的形成，從而抑制有絲分裂，阻止癌細胞的增殖。目前紫杉醇除了治療乳腺癌、卵巢癌、非小細胞肺癌等惡性腫瘤以外，其臨床適應證還擴大到子宮癌、肺癌、食管癌、前列腺癌及直腸癌等十幾種癌癥，被認為是迄今人類發現的最有效的抗癌藥物[4]。有些腫瘤在經歷化療后，仍難免復發，其中一個重要的原因就是腫瘤細胞對化療藥物產生了多藥耐藥性(Multidrug Resistance, MDR)，是指腫瘤細胞接觸一種抗腫瘤藥物后，產生對多種結構不同的、作用機制各異的其他抗腫瘤藥的耐藥性[5]。他莫昔芬(Tamoxifen, TAM)又名三苯氧胺，是第一代選擇性雌激素受體調節劑[6]，臨床上常用其來抑制腫瘤細胞的多藥耐藥，并且具有毒副作用小、能透過血腦屏障的優點[7]。穿膜肽(Transcription Activator,TAT)是一類不超過30個氨基酸，并能夠穿透細胞膜進入細胞質甚至細胞核而不損壞細胞膜結構的小分子多肽[8]。TAT具有能夠透過腫瘤細胞，降低不良反應、提高利用率等特點，常用于提高治療腫瘤藥物的靶向性[9-10]。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Y220電子分析天平(日本島津公司)；電熱恒溫水浴鍋(上海醫療器械五廠)；RE-52AA旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)；DF2101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(河南鞏義予華儀器廠)；KQ3200超聲波清洗器(江蘇昆山超聲設備公司)；JY92-2D超聲波細胞搗碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；MD34透析袋(上海百賽生物技術有限公司，截留分子量12000～14000)；PHS-25型pH計(上海精密科學儀器公司雷磁儀器廠)；島津20AT液相色譜儀(日本島津公司，UV檢測器，島津色譜工作站)。

1.2 材料 卵磷脂(EPC，日本NOF公司)；膽固醇(Chol，日本NOF公司)；聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG2000-DSPE，相對分子質量2800.5，批號：B10206，日本精化株式會社NFC)；聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-N-羥基琥珀酰亞胺-穿膜肽(PEG2000-DSPE-TAT，遼寧中醫藥大學藥劑實驗室合成)；他莫昔芬(批號：MB5257，大連美侖生物技術有限公司)；紫杉醇(批號：SO802A，大連美侖生物技術有限公司)；Sephadex G-50(上海華藍化學科技有限公司)。

2 方法與結果

2.1 脂質體的制備[11]精密稱取卵磷脂(EPC)、膽固醇(Chol)、PEG2000-DSPE、PEG2000-DSPE-TAT、紫杉醇和他莫昔芬適量，溶解于氯仿-甲醇(3∶1)中，40 ℃水浴旋轉蒸發，減壓干燥除去有機試劑，在圓底燒瓶底部及內壁形成一層薄薄的均勻脂膜。加入適量硫酸銨溶液水化，設置超聲工作時間為10 s，間歇時間為10 s，全程時間為10 min，保護溫度為20 ℃，功率為200 W，超聲結束后逐漸形成帶有微弱藍色熒光的半透明液體。然后將超聲波粉碎后的脂質體溶液通過孔徑為400nm，200nm的聚碳脂膜各擠壓3次，制得TAT修飾紫杉醇和他莫昔芬脂質體。

2.2 TAT修飾紫杉醇和他莫昔芬脂質體中主藥含量測定

2.2.1 供試品溶液的制備 精密量取TAT修飾紫杉醇和他莫昔芬脂質體樣品溶液1mL，置10mL容量瓶中，加入甲醇超聲破乳，并定容至刻度，過0.45μm的微孔濾膜1次，取續濾液即得。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取PTX對照品1.30mg，置10mL容量瓶中，加乙腈定容至刻度，超聲使溶解，制備成0.13mg/mL的紫杉醇對照品溶液。精密稱取他莫昔芬對照品1.60mg，加甲醇定容至刻度，超聲使溶解，制備成0.16mg/mL的他莫昔芬對照品溶液。

2.2.3 空白溶液的制備 制備方法見“2.1”，不加入紫杉醇和他莫昔芬即得空白脂質體。精密量取空白脂質體1mL，置10mL容量瓶中，加入甲醇超聲使溶解，并定容至刻度，過0.45μm的微孔濾膜一次，取續濾液即得。

2.2.4 色譜條件[12]及系統適應性 紫杉醇測定色譜條件：色譜柱：C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm，月旭科技(上海股份有限公司))；流動相：A：乙腈-甲醇(26∶23)，B：水，A：B(70∶30)；流速：1.0mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：20μL；檢測波長：233nm。

他莫昔芬測定色譜條件：色譜柱：迪馬公司C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：甲醇-0.5 %三乙胺水溶液(92∶8)；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；進樣量：20μL；檢測波長：254nm。

取紫杉醇對照品溶液，空白脂質體溶液和TAT修飾紫杉醇和他莫昔芬脂質體溶液，按照上述色譜條件分別進樣分析，用HPLC法檢測，記錄色譜圖見圖1。由圖知空白脂質體中的輔料和試劑對主藥的含量測定無影響。

2.2.5 方法學考察

2.2.5.1 標準曲線的建立 分別取紫杉醇與他莫昔芬的對照品溶液，按照上述色譜條件測定紫杉醇與他莫昔芬的色譜峰面積A值，并以質量M(ng)為橫坐標，對其相應的色譜峰面；積A值進行線性回歸，求得標準曲線。得到紫杉醇的回歸方程為Y=116.78X+4150.8(r2=0. 9996)，表明紫杉醇在0.13～1.3 μg范圍內線性關系良好；他莫昔芬的回歸方程為Y=2971.8X+17099(r2=0.9999)，表明他莫昔芬在0.16～1.6 μg范圍內線性關系良好。

2.2.5.2 精密度實驗 取濃度為0.13 mg/mL的紫杉醇對照品溶液，按照上述色譜條件，進行5次分析。同法測得他莫昔芬的峰面積。計算得紫杉醇峰面積的RSD為0.14 %，他莫昔芬峰面積的RSD為0.10 %，表明儀器的精密度良好。

2.2.5.3 重復性實驗 取同一樣品，按“2.2.1”項下方法制備，進行5次分析，結果紫杉醇重復性試驗的RSD為0.06 %，他莫昔芬重復性試驗的RSD為0.20 %，表明該方法重復性良好。

2.2.5.4 穩定性實驗 取同一樣品，按照上述色譜條件，室溫下放置，在0、2、4、8、12、24h進行測定，分別進行6次分析并計算相應的RSD值，結果紫杉醇穩定性試驗的RSD為0.20 %，他莫昔芬穩定性試驗的RSD為0.11 %，表明樣品溶液在24 h內穩定性良好。

2.2.5.5 加樣回收率實驗 精密量取空白脂質體1 mL置10mL容量瓶中，分別加入0.020、0.026、0.031mg/mL的紫杉醇對照品溶液1mL，每種濃度平行操作3次，加入甲醇超聲破乳，并定容至刻度。按照上述的色譜條件，用HPLC法檢測，測定并記錄紫杉醇的峰面積，脂質體中紫杉醇的平均加樣回收率符合要求。同法精密量取空白脂質體1mL置10mL容量瓶中，分別加入0.006、0.008、0.010mg/mL的他莫昔芬對照品溶液1mL，每種濃度平行操作3次，測定并記錄他莫昔芬的峰面積，脂質體中他莫昔芬的平均加樣回收率符合要求。結果見表1。

表1 加樣回收率考察結果 (n=3)

2.2.6 主藥含量測定 精密量取TAT修飾紫杉醇和他莫昔芬脂質體1.0 mL，按“2.2.1”項下制備方法進行操作，照上述色譜條件，用HPLC法檢測，記錄色譜峰面積，分別計算紫杉醇和他莫昔芬的樣品含量和RSD值。結果見表2。

表2 脂質體中藥物含量

3 討論

為了增強藥物的靶向性、延長藥物在體內滯留時間、增強療效、降低毒副作用，將TAT作為靶向配體修飾在脂質體表面，提高脂質體的靶向作用；將TAM包裹在脂質體雙分子層中，起到抑制腫瘤細胞的多藥耐藥作用，以提高抗腫瘤藥物的敏感度；PTX作為抗腫瘤藥物被包封在脂質體雙分子層中，起到抑制腫瘤細胞增殖的作用。

實驗系統適應性的高效液相色譜圖顯示，在高效液相色譜法測定脂質體中紫杉醇和他莫昔芬的含量過程中，應用的輔料對實驗結果無干擾，方法專屬性強。方法學考察的實驗結果表明采用此法測定脂質體中紫杉醇和他莫昔芬的含量，分別在0.13～1.3μg和0.16～1.6μg范圍內線性關系良好，回收率均在98%以上，RSD均小于1%，精密度的相對標準偏差均小于2%，符合要求。

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DeterminationofContentofTATModifiedPaclitaxelPlusTamoxifenLiposomes

JU Ruijun1CHENG Lan2PENG Xiaoming1WANG Teng1LI Cuiqing1WANG Jiao2LI Xuetao2*

1.Department of Pharmaceutical Engineering, Beijing Institute of Petrochemical Technology，Beijing 102617,China; 2.School of Pharmacy, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116600,China

ObjectiveTo measure main component contents of TAT modified paclitaxel plus tamoxifen liposomes.MethodsThe TAT modified paclitaxel plus tamoxifen liposomes were prepared by a thin-film dispersion method followed by an ammonium sulfate gradient method. The contents of paclitaxel and tamoxifen in the liposomes were measured via a HPLC method.ResultsUnder the established chromatographic condition, the TAT modified blank liposomes had no interference on the determination of drugs. The paclitaxel and tamoxifen were 0.13～1.3 μg and 0.16～1.6 μg in good linear ranges; recovery rates were over 97%,RSDof recovery rates were less than 1.0%,RSDof precision tests were less than 2.0%. The average content of paclitaxel and tamoxifen in the TAT modified paclitaxel plus tamoxifen liposomes were 23.6 μg/mL and 8.6 μg/mL, respectively.ConclusionThe established HPLC method was simple, precise, replicable, and can be used for the quality control of TAT modified paclitaxel plus tamoxifen liposomes.

TAT; Paclitaxel; Tamoxifen; Liposomes; HPLC; Content Determination

國家自然基金(81673603, 81541081)；遼寧省自然基金(2014020046)；遼寧省教育廳重點實驗室項目(LZ2015053)。

居瑞軍(1986-),男，漢族，博士研究生，講師，研究方向為藥物新制劑與新劑型。E-mail:juruijun@bipt.edu.cn

李學濤(1979-)，男，漢族，博士研究生，教授，研究方向為新型給藥系統。 E-mail: lixuetao1979@163.com

R284.1

A

1007-8517(2017)21-0013-03

2017-09-18 編輯：鄧佳麗)