HPLC法測定貴州不同地區番石榴葉中兩種黃酮苷的含量

1.貴州省安順市食品藥品檢驗所，貴州 安順 561000；2.貴州省安順市中醫院，貴州 安順 561000；3.貴州省安順市人民醫院，貴州 安順561000；4.貴陽中醫學院，貴州 貴陽 550025；5.中央民族大學，北京 100081

HPLC法測定貴州不同地區番石榴葉中兩種黃酮苷的含量

李開斌1孫剛1鄭宗華2楊文1宴晨3馬四補4，5*

1.貴州省安順市食品藥品檢驗所，貴州 安順 561000；2.貴州省安順市中醫院，貴州 安順 561000；3.貴州省安順市人民醫院，貴州 安順561000；4.貴陽中醫學院，貴州 貴陽 550025；5.中央民族大學，北京 100081

目的對貴州不同地區番石榴葉藥材中金絲桃苷和異槲皮苷變化進行研究，探討番石榴葉藥材有效成分與產地相關性變化，為番石榴葉藥材生產和質量保障提供數據支撐。方法采用高效液相色譜法，色譜柱Agilent XDB-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動相為乙腈-0.1%甲酸(13∶87)，柱溫為25℃，檢測波長為257nm；流速1.0mL/min，測定貴州不同地區番石榴葉藥材中金絲桃苷和異槲皮苷含量。結果通過方法學考察，HPLC檢測番石榴葉中兩種黃酮苷含量，實驗準確可靠，方法簡便易行；在同一時段內，不同產地番石榴葉中兩種黃酮苷變化較大，不同產地藥材質量差異明顯。結論建立了番石榴葉藥材兩種黃酮苷的檢測方法，方法準確可靠、簡便易行；貴州不同區域產番石榴葉藥材中兩種黃酮苷的含量差異明顯，靠近河谷的羅甸溝亭鄉所產番石榴葉藥材品質較好。

番石榴葉；金絲桃苷；異槲皮苷

番石榴(PsidiumguajavaL.)為桃金娘科番石榴屬植物，為常綠多年生灌木或小喬木[1]，在我國的廣西、廣東、海南等均有人工栽培[1],貴州民間多有習用，番石榴葉別名“雞矢茶”、“番桃葉”、“番石榴心”、“麻里桿”等，是番石榴的干燥葉及帶葉嫩莖。在貴州多為野生品種。本品質脆易碎，氣微，揉之有香氣，味澀，微苦，性平。具有健胃消食、澀腸止瀉、收斂止血、抗氧化的作用。主要含黃酮類、揮發油、鞣質、植物固醇、多糖等化學成分[2]。結合貴州民間用藥習慣，研究選擇與療效相關的兩種黃酮苷作為控制指標對貴州不同區域的番石榴葉藥材含量相關性進行探索，測定了采收時間和方式相同條件下的不同地區番石榴葉藥材兩種黃酮苷的變化趨勢，建立了準確可靠、簡便易行的檢測方法，為番石榴葉藥材質量控制和藥材生產提供科學的數據支撐。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀(安捷倫液相色譜工作站，美國安捷倫公司)；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；AY-120型島津托盤電子天平；KQ3200DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑 乙腈為色譜純，甲醇、甲酸、乙醇均為分析純，水為超純水。金絲桃苷對照品由中國藥品生物制品檢定所提供，批號:111521-201507，含量94.3%，異槲皮苷對照品由中國藥品生物制品檢定所提供，批號:111809-201403，含量92.9%。

1.3 樣品 樣品采自貴州省黔西南州安龍縣坡腳鄉坡腳村、望謨蔗香鎮移民村、望謨桑朗鎮、冊亨縣巧馬鎮、黔南州羅甸溝亭鄉，均由貴陽中醫學院藥學院生藥教研室魏升華教授鑒定為番石榴(PsidiumguajavaL.)的干燥葉。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent XDB-C18柱(4.6×250mm，5μm)；流動相：乙腈-0.1%甲酸水溶液(13∶87)；柱溫：25 ℃；檢測波長：257 nm；流速1.0 mL/min；進樣體積：10 μL。

2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取金絲桃苷對照品10.61 mg和異槲皮苷對照品10.78 mg，分別置100 mL量瓶中，加60 %甲醇溶解并稀釋至刻度，作為對照品貯備液。分別精密量取對照品貯備液各3 mL于同一25 mL容量瓶中，加60 %甲醇溶液稀釋至刻度，制成每1 mL含金絲桃苷、異槲皮苷分別為12.01 ug、12.02 ug的混合對照品溶液即得。

2.3 供試品的制備 取番石榴葉粉末(過四號篩)約0.2 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加入60%甲醇20 mL，超聲提取(功率500 W，頻率40 kHz)40 min，取出放冷，用60%甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液即得。

2.4 系統適用性試驗 分別取金絲桃苷，異槲皮苷對照品溶液、供試品溶液以及甲醇溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖。從圖中可見空白無干擾，對照品與供試品圖譜金絲桃苷，異槲皮苷的保留時間一致，金絲桃苷，異槲皮苷與其相近的峰分離完全(分離度gt;1.5)。對照品色譜中金絲桃苷，異槲皮苷峰的理論塔板數分別為8261和8644，供試品溶液的色譜中金絲桃苷，異槲皮苷峰的理論塔板數分別為7503和4131，即理論板數以異槲皮苷計算應不低于2000。結果如圖1、圖2所示。

2.5 線性關系考察 精密量取“2.2”項下的對照品貯備液各3 mL于同一10 mL容量瓶中，加60%甲醇稀釋至刻度，精密吸取該混合對照品溶液1、3、5、10、20、40 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積A對質量數X(μg)進行線性回歸計算，得線性回歸方程為：金絲桃苷：A=28.245X-13.341(R2=0.9999)異槲皮苷：A=27.243X+31.685(R2=0.9998),結果表明金絲桃苷在3.0016～120.0627μg，異槲皮苷在3.0044～120.1754μg范圍內與峰面積呈現良好的線性關系。

將“2.2”項下的混合對照品溶液(濃度分別為0.01201 mg/mL，0.01202 mg/mL)所測得的金絲桃苷峰面積322.453代入上述線性回歸方程得C=0.01189 mg/mL，與0.01201 mg/mL相比，相對標準偏差(RSD)為0.92%；再將異槲皮苷峰面積363.122代入回歸方程得C=0.01217 mg/mL，與0.01202 mg/mL相比，相對標準偏差(RSD)為0.88%，均較小。所以該濃度的混合對照品在此線性范圍內呈良好的線性關系。

2.6 儀器精密度、穩定性、重復性考察 取同一對照品連續進樣6次，計算金絲桃苷和異槲皮苷峰面積的RSD值，分別為0.74%，0.65%；取同一對照品和同一樣品分別于0、4、8、12、16、24 h進樣測定金絲桃苷與異槲皮苷峰面積，對照品RSD值為0.44%和0.54%，樣品RSD值為0.72%和0.96%，說明對照品和樣品在24 h穩定性均較好；取同一批次樣品6份，平行制備6份供試品溶液，測定金絲桃苷與異槲皮苷的含量，所得含量RSD值為1.8%和1.1%，說明該方法重復性強。

2.7 加樣回收率試驗 取貴州黔西南安龍縣坡腳鄉坡腳村樣品(粉碎，過4號篩)6份，每份約0.1 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加入金絲桃苷與異槲皮苷(濃度分別為0.006003 mg/mL，0.008012 mg/mL)的混合對照品溶液20mL，按2.3項下方法制備供試品溶液，測定含量，計算金絲桃苷與異槲皮苷的平均回收率分別為96.16%，100.03%，RSD分別為 1.2%，0.4%，表明該方法測定準確度較高。結果見表1。

表1 番石榴葉中金絲桃苷與異槲皮苷的加樣回收試驗結果

2.8 樣品測定 取貴州南盤江流域內不同地區的番石榴葉藥材粉末，照“2.3”項下方法提取供試品溶液，測定含量，按干燥品計算藥材中金絲桃苷與異槲皮苷的總量。結果見表2。

表2 不同產地番石榴葉藥材中金絲桃苷與異槲皮苷含量測定結果

3 討論

實驗采用HPLC法同時測定了番石榴葉藥材中兩種黃酮苷類成分，待測組分互不干擾，控制指標成分法定可得，兩種黃酮苷結構相似，其中金絲挑苷具有較好活性。通過檢測兩種槲皮素苷對番石榴藥材質量進行評價，較單一用槲皮素評價藥材有很強的優勢。槲皮素作為質量控制指標之一涉及水解過程，在藥典和報道中多采用酸水解，提取條件控制較苛刻，操作要求較高，而黃酮苷作為指標控制成分，實驗操作性強，簡便卻準確可靠。多組分活性物質作為藥材質量控制指標，可以更全面地評價藥材的質量，由于番石榴葉藥材特異性和檢測可追溯性，選擇金絲桃苷與異槲皮苷的總量作為番石榴葉藥材控制方式較為合適。

由表2可知貴州省不同產地的番石榴葉藥材中金絲桃苷與異槲皮苷的含量差異較大，金絲桃苷在1.0～3.8 mg/g，異槲皮苷在1.7～2.7 mg/g，金絲桃苷波動較大，而異槲皮苷的波動較平穩，兩者的總量波動也較大，且有伴隨緯度降低而升高的一致性。通過對貴州省番石榴葉不同地區藥材質量的對比研究，結合民族用藥與中藥質量控制特點[7]，以看出該藥材隨地域環境不同的質量變化趨勢，為更好應用和開發貴州民族醫藥提供實驗數據支撐。

[1]鐘思強,黃樹長.番石榴的營養價值及其高效栽培技術[J].中國南方果樹，2008,37(1)：41-43.

[2]歐陽文，朱曉艾，邵祥輝，等.番石榴葉乙酸醋萃取化學成分研究[J].食品科學，2014,35(15)：30-37.

[3]Gutié rrez R M P，Mitchell S，Solis R V.Psidium guajava：A review of its traditional uses，phytochemistry and pharmacology[J].Journal of Ethnopharmacology，2008，117(1)：1-27.

[4]Makino T,KanemaruM,Okuyama S,et al.Anti-allergic effects of enzymatically modified isoquercitrin(alpha-oligoglucosyl quercetin3-O-glucoside),quercetin3-O-glucoside,alpha-oligoglucosyl rutin,and quercetin,when administered orally to mice[J]. Nat Med,2013,67(4):881-886.

[5]黃凱，楊新波，黃正明.金絲桃苷藥理作用研究進展[J].醫藥導報，2009,28(8)：1046-1048.

[6]林萍，易宏偉，張裴.金絲挑著藥理作用研究進展[J].中國現代中藥，2012,14(10):23-26.

[7]李志勇，李彥文，樸香蘭，等.論中藥與民族藥的關系[J].貴陽中醫學院學報，2012,34(1):26-28.

李開斌(1979-)，男，漢族，本科，主管中藥師。研究方向為藥材質量控制與檢驗檢測。E-mail：826735176@qq.com

馬四補(1979-)，男，回族，博士研究生在讀，副教授。研究方向為中藥、民族藥物質基礎研究。E-mail：453175568@qq.com

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1007-8517(2017)21-0019-03

2017-09-13 編輯：鄧佳麗)