基于PCR-反向點雜交法對江西地區分枝桿菌感染狀況分析

呂小林 聶益軍 林慧 肖婕

基于PCR-反向點雜交法對江西地區分枝桿菌感染狀況分析

呂小林 聶益軍 林慧 肖婕

目的了解江西地區分枝桿菌感染流行現狀，為臨床防治提供科學依據。方法運用PCR-反向點雜交法對345例可疑分枝桿菌感染患者不同標本進行分枝桿菌核酸檢測。結果345份標本中共檢出68例陽性(陽性率為19.7%)，其中結核分枝桿菌復合群(MTC)59例(占86.76%)，非結核分枝桿菌(NTM)8例(占11.77%)，混合感染(MTC/MIN)1例(1.47%)；NTM感染中檢測出5種，分別為偶發/豬分枝桿菌(MFO)、戈登分枝桿菌(MGO)、胞內分枝桿菌(MIN)、龜分枝桿菌膿腫亞腫(MAB)、蟾蜍分枝桿菌(MXE)，其中以MIN為主，占5.88%；不同標本中分枝桿菌檢出率不同，痰液、灌洗液、分泌物、胸水中分枝桿菌檢出率分別為：31.5%、20.3%、16.0%、4.7%。結論江西地區分枝桿菌感染主要以MTC為主，且多為單一感染。

分枝桿菌；感染；PCR-反向點雜交

分枝桿菌感染引起的結核病和非結核病是嚴重危害人類健康的慢性傳染病，在全球范圍內流行，是全球重點控制的傳染病之一。全球每年新發病例超過900萬，約200萬人死于結核病[1]。我國2009年的結核病年發病患者約為130萬，僅次于印度，為世界第二大結核病高發國家[2]。近年來，非結核分枝桿菌(NTM)感染呈快速增長趨勢，并已成為威脅人類健康的重要公共衛生問題[3]。由于結核分枝桿菌感染及非結核分枝桿菌病在臨床特點上極其相似，但其治療方案存在明顯差異。2012年我國制訂的有關分枝桿菌感染的專家共識示，在診斷及治療分枝桿菌病前需進行分枝桿菌菌種鑒定，以便對不同分枝桿菌感染進行對癥治療[4]。因此菌種鑒定對分枝桿菌感染診治極其重要。本研究應用PCR-反向點雜交法對我院345例疑似非分枝桿菌感染患者不同標本進行菌種鑒定，旨在報道江西地區非分桿菌流行狀況，為臨床診治及制訂相關防控措施提供實驗室依據。

資料與方法

一、一般資料

收集2015年7月至2016年5月期間于江西省南昌大學第一附屬醫院就診的疑似分枝桿菌感染的門診及住院患者共345例，其中男性220例，女性125例，年齡1-88歲，平均年齡55.4歲。標本類型有灌洗液、痰液、胸水、腹水等。

二、儀器與試劑

ABI2700定性PCR擴增儀、水浴箱、分子雜交箱及分枝桿菌菌種鑒定基因檢測試劑(亞能生物技術有限公司原裝試劑)等。

三、方法

應用PCR-反向點雜交法檢測22個分枝桿菌，包括恥垢分枝桿菌(MSM)、胞內分枝桿菌(MIN)、堪薩斯分枝桿菌(MKA)、龜分枝桿菌龜亞種(MCH)、海/潰瘍分枝桿菌(MMA)、偶發/豬分枝桿菌(MFO)、土分枝桿菌(MTE)、不產色分枝桿菌(MNO)、結核分枝桿菌復合群(MTC)、鳥分枝桿菌(MAV)、瘰疬分枝桿菌(MSC)、龜分枝桿菌膿腫亞腫(MAB)、蟾蜍分枝桿菌(MXE)、淺黃分枝桿菌(MGI)、草分枝桿菌(MPH)、戈登分枝桿菌(MGO)、次要分枝桿菌(MTR)、胃分枝桿菌(MGA)、母牛分枝桿菌(MUA)、蘇爾加分枝桿菌(MDI)、迪氏分枝桿菌(MDI)、猿猴分枝桿菌(MSI)。

1 標本處理：在各種標本中加入適量4%NaOH 37 ℃液化30min或更長時間，13000rmp離心5min，棄上清液，向沉淀中加入1mL MTB洗液，洗滌離心棄上清液，再向沉淀中50 μl MTB裂解液，沸水浴10min離心留上清液。

2 取出PCR反應管，加入已提取好的待測樣品DNA 4μl按以下條件進行擴增，50℃ 2min，95℃ 10min，95℃ 45s、68℃ 60s 30cycles，95℃ 30s、54℃ 30s、68℃ 60s 30cycles，68℃ 10min，另設陽性、陰性質控。

3 雜交：將所有PCR擴增產物(約25μl)加入到裝有雜交膜的雜交液管中，沸水水浴10min之后置于雜交箱中，59℃雜交1.5h。

4 洗膜：取出雜交膜，移至裝有預熱到59℃的洗液中，輕搖洗滌15min。

5 顯色：將洗滌好的雜交膜放入1：2000的POD溶液中，室溫輕搖浸泡30min，再用洗液清洗2遍，之后置于顯色液中避光顯色10min即可觀察結果。

6 結果判讀：根據雜交膜塊上不同位點是否顯判讀分枝桿菌陰、陽性。

四、統計學分析

數據統計學分析采用SPSS17.0軟件處理，分類計數資料用率來進行描述。

結 果

一、分枝桿菌菌種鑒定結果

345例患者中檢出68例(19.7%)陽性共6種分枝桿菌，其中男性40例(18.2%)，女性28例(22.4%)；結核分枝桿菌復合群59例(17.1%)，非結核分枝桿菌8例(2.3%)，另外1例為混合分枝桿菌感染(0.3%)；痰液、灌洗液、分泌物、胸水各種標本中分枝桿菌檢出率分別為31.5%、20.3%、16%、4.7%。(見表1)。

二、分枝桿菌分布特點

68例分枝桿菌中共包括6種類型，分別為MTC 59例(86.76%)、MFO 1例(1.47%)、MGO 1例(1.47%)、MIN 4例(5.88%)、MAB 1例(1.47%)、MXE 1例(1.47%)、MTC/MIN 1例(1.47%)，具體結果見表2。

表1 345例患者分枝桿菌檢測結果

表2 68株非分枝桿菌菌種分布情況

討 論

自1882年分枝桿菌被Koch發現以來，現已知有150多種， 分為結核分枝桿菌復合群、非結核分枝桿菌及麻風桿菌三大類，目前以結核分枝桿菌復合群及非結核分枝桿菌感染為主。分枝桿菌是引起人類慢性傳染性感染的最重要的病原微生物之一，無論在發展中國家還是在發達國家，分枝桿菌感染都是影響公共衛生健康的棘手問題。高發病率、高死亡率及易傳染性，迫使分枝桿菌感染倍受關注。2010年我國第五次全國結核病流行病學調查示[5]，我國現有結核病患者700萬，其中非結核分枝桿菌的感染率為22.9%，明顯高于2000年全國第四次結核病流行病調查的11.1%[6]。本研究分析了345例可疑分枝桿菌感染患者，結果示共68例陽性(占19.7%)，其中MTC占86.76%，NTM占11.77%，混合感染占1.47%，NTM感染率低于第五次全國調查水平，與第四次全國感染率相仿。NTM與MTC同屬抗酸桿菌，有臨床特征相似，故極易誤診誤治[7]，而NTM對常規抗結核藥具有較高的耐藥性[8-9]，因此準確快速檢測分枝桿菌菌種對于結核病防治意義重大。作者運用PCR-斑點雜交方法分析了345例患者不同標本中分枝桿菌感染狀況，結果示男性感染40例(占18.2%)，女性感染28例(占22.4%)；不同標本中分枝桿菌檢出率不同，痰液、灌洗液、分泌物、胸水中分枝桿菌檢出率分別為：31.5%、20.3%、16.0%、4.7%；本次研究共發現6種分枝桿菌，其中以MTC感染為主，占86.76%，非結核分枝桿菌中以MIN為主，占5.88%，與北京[10]、上海[11]、廣州[12]等報道存在一定差異，由此可見NTM感染具有明顯地區差異；另外68例感染患者中只有1例混合感染，提示分枝桿菌感染以單一感染為主。

由于非結核分枝桿菌感染呈現上升趨勢，且存在明顯地域差異等特性，因此有必要建立準確、快速檢測方法，分析分枝桿菌流行狀況，為當地衛生醫療機構因地制宜地制訂相應的防治措施提供依據。

[1] World Health Organization.Tuberculosis[M].Geneva:World Health Organization,2008.

[2] World Health Organization.WHO report 2009: Global Tuberculosis Control: Epidemiology, Strategy, Financing [M].Geneva:World Health Organization,2009.

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[6] 全國結核病流行病學抽樣調查技術指導組.第四次全國結核病流行病學抽樣調查報告[J].中華結核和呼吸雜志，2002，25(1)：3-7.

[7] 孫勤，沙巍.非結核分枝桿菌肺病與肺結核患者的臨床特征對比分析[J].中國防癆雜志，2011，33(2)：120-122.

[8] 柴華，包訓迪.29例非結核分枝桿菌的藥敏實驗分析[J].臨床肺科雜志，2012，17(3)：564-565.

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[11] 梁莉，張瀅蓉，樂軍,等.上海市非結核分枝桿菌感染趨勢及耐藥分析[J].中華醫院感染學雜志，2007，17(7)：895-897.

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EpidemiologyofmycobacteriainfectionbyPCR-reversedothybridizationinJiangxiarea

LVXiao-lin,NIEYi-jun,LINHui,XIAOJie
theFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330006,China

ObjectiveTo understand the prevalence of mycobacteria infection in Jiangxi region and to provide a scientific basis for clinical prevention and treatment.MethodsThe different samples of 345 patients who suspected with mycobacteria infection were tested by PCR- reverse dot hybridization.Results68 cases were positive in 345 specimens, including 59 cases of mycobacteria tuberculous complex (MTC) (86.76%) and 8 cases of nontuberculous mycobacteria (NTM) (11.77%) and 1 case of mixed infection (MTC/MIN) (1.47%). There were 5 kinds of NTM infection detected, namely MFO, MGO, MIN, MAB and MXE respectively, and MIN was priority to others in NTM, accounted for 5.88%. The positive rate was various in different specimens, which sputum, lavage, secretions, pleural effusion positive rate was31.5%, 20.3%, 16.0%, and 4.7% respectively.ConclusionMTC and single infection are mainly types of mycobacterial infection in Jiangxi region.

mycobacteria; infection; PCR- reverse dot hybridization

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.12.032

330006 江西 南昌，南昌大學第一附屬醫院檢驗科

2016-12-30]