榆耳低聚肽的制備及抗氧化活性研究

常桂英++于加平+高桂鳳

摘要：以榆耳為原料，經(jīng)提取、純化、酶解，獲得2.0～10.6 μm超濾膜截留范圍的低聚肽，通過鄰苯三酚法測(cè)其抗氧化活性，對(duì)氨基苯磺酸法測(cè)定對(duì)亞硝酸鹽的清除率。結(jié)果表明，榆耳蛋白及低聚肽對(duì)超氧自由基和亞硝酸鹽都有較強(qiáng)清除效果，但緩沖溶液提取的榆耳蛋白最強(qiáng)，而對(duì)于2種提取方法得到的榆耳蛋白水解的低聚肽的對(duì)超氧自由基和亞硝酸鹽都有較強(qiáng)清除效果比榆耳蛋白的清除效果要差很多，其中緩沖溶液提取的低聚肽清除效果最低。說明榆耳蛋白具有很強(qiáng)的抗氧化活性，是天然的抗氧化劑，在食品領(lǐng)域及化妝品產(chǎn)業(yè)均有很高的開發(fā)利用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：榆耳；低聚肽；提??；抗氧化

中圖分類號(hào)： R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）20-0225-03

榆耳是分布于我國(guó)長(zhǎng)白山區(qū)的一種食藥兼用珍貴食用菌品種，屬多孔菌目伏革菌科膠韌革菌，又稱榆蘑，它的浸出液對(duì)痢疾和腸胃系統(tǒng)疾病亦有奇效[1]。低聚肽可以改善肝功能，緩解血液芳香族氨基酸濃度過高導(dǎo)致肝昏迷；可以提供能量，緩解疲勞，可以改善手術(shù)后病人營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，廣泛應(yīng)用于燒傷、外科手術(shù)等病人及消化酶缺失患者的腸道營(yíng)養(yǎng)劑和蛋白營(yíng)養(yǎng)食品；也可用作高強(qiáng)度勞動(dòng)者及運(yùn)動(dòng)員的食品營(yíng)養(yǎng)劑，能及時(shí)補(bǔ)充能量、消除疲勞、增強(qiáng)體力；還具有抗氧化活性，同時(shí)具有良好風(fēng)味[2]。

本研究以榆耳為原料，通過堿法、緩沖液提取法對(duì)其蛋白質(zhì)進(jìn)行提取、純化，以酶解法制備高F值低聚肽，并對(duì)不同提取物進(jìn)行活性分析，為榆耳的深加工及產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

榆耳子實(shí)體。

1.2 儀器與試劑

LC-10AT氨基酸自動(dòng)分析儀（檢測(cè)器S-TD-10A VTPlus）；756PC紫外/可見分光光度計(jì)；YP2001N電子天平；TDL-5臺(tái)式離心機(jī)；JJ-5恒溫電動(dòng)攪拌器；超濾裝置（超濾膜孔徑：2.0 μm）；高速萬能粉碎機(jī)；紫外-可見分光光度計(jì)；離心機(jī)；恒溫干燥箱；燒杯；量筒；CaCl2固體；0.2%苯酚，6.0 mol/L 鹽酸；0.4%對(duì)氨基苯磺酸；0.2%鹽酸萘乙二胺；NaOH溶液；鹽酸溶液；NH4Cl溶液；牛血清白蛋白；考馬斯亮藍(lán)G-250；85%磷酸；乙醇。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 榆耳蛋白質(zhì)的提取與純化

1.3.1.1 NaCl的堿性溶液提取榆耳蛋白質(zhì) 稱取20 g榆耳粉末，加入0.5 mol/L的NaCl溶液，pH值為10.0（料液比 1 g ∶ 30 mL），在40 ℃下浸泡4.0 h，12 000 r/min離心20 min后，上清液即為榆耳蛋白質(zhì)粗提取液。

1.3.1.2 緩沖液提取榆耳蛋白質(zhì) 稱取20 g榆耳粉末，加入到1.0 mol/L Tris-Hcl（pH值為8.0）、甘油、聚乙烯吡咯烷酮混合定容，并經(jīng)高壓滅菌的緩沖液里（料液比1 g ∶ 30 mL），在 4 ℃ 下浸泡4.0 h，12 000 r/min離心20 min后，上清液即為榆耳蛋白質(zhì)粗提取液。

1.3.1.3 純化 （1）去多糖：將所得的榆耳蛋白提取液減壓濃縮，并加入3倍體積的95%乙醇，進(jìn)行醇沉除去多糖，離心，將所得溶液減壓濃縮除去乙醇，得到除去多糖的榆耳蛋白溶液。（2）鹽析：向去多糖的蛋白質(zhì)提取液中按氯化銨 60 g/200 mL 固液比緩慢加入氯化銨粉末，鹽析后，4 ℃靜置過夜，待沉淀完全后再離心（4 000 r/min，40 min），棄上清，NaCl堿性溶液提取的榆耳蛋白質(zhì)沉淀物用蒸餾水溶解；緩沖液提取的榆耳蛋白質(zhì)沉淀物用緩沖液溶解。

1.3.1.4 透析 取10倍以上蛋白質(zhì)體積的去離子水，將裝好樣品的透析袋懸于大燒杯中部。在燒杯底部放一個(gè)磁子，緩慢攪拌以促進(jìn)溶液交換。更換洗脫溶液數(shù)次（約 30 min/次），至達(dá)到透析平衡為止（洗出液中無Cl-），獲得榆耳蛋白質(zhì)。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定——考馬斯亮藍(lán)法

1.3.2.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 用牛血清白蛋白配制成 0.1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。

1.3.2.2 染色液（考馬斯亮藍(lán)G-250溶液） 稱取0.1 g考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50.0 mL 90%乙醇中，加入85%的磷酸100.0 mL，蒸餾水定容至1 L，貯存在棕色瓶中。

1.3.2.3 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[3]。得回歸方程：

D=0.342C+0.036 4，r2=0.999 9。

式中：D表示吸光值，C表示蛋白質(zhì)濃度。

1.3.2.4 樣品中蛋白質(zhì)含量測(cè)定 取2支試管（1個(gè)為重復(fù)）A和B，加入樣品提取液1.0 mL，考馬斯亮藍(lán)溶液 5.0 mL，按“1.3.2.3”節(jié)方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 低聚肽的制備 分別取NaCl堿性溶液提取的榆耳蛋白質(zhì)提取液和緩沖液提取的榆耳蛋白質(zhì)提取液各10.0 mL，取1 g蛋白質(zhì)樣品加20.0 mL蒸餾水，在 35 ℃條件下預(yù)熱 15 min 后，加凝乳蛋白酶酶解4.0 h后備用。

1.3.4 維生素C溶液的制備 稱取含量分別與NaCl堿性溶液提取的榆耳蛋白質(zhì)提取液和緩沖液提取的榆耳蛋白質(zhì)提取液具有相同含量的維生素C粉末制備溶液備用。

1.3.5 超氧自由基抑制率測(cè)定 超氧自由基測(cè)定采用改良的鄰苯三酚自氧化法[3]。在試管中按表1加入緩沖液和蒸餾水，于25 ℃恒溫15 min后加入25 ℃預(yù)熱過的樣本和鄰苯三酚，迅速搖勻，立即傾入比色皿中，在波長(zhǎng)325 nm處每30 s測(cè)定1次吸光度D。

超氧自由基清除率=（D0-Df）/D0×100%。

式中：D0表示試劑空白液的吸光值；Df表示分別加入各種樣品和鄰苯三酚后的吸光值。endprint

1.3.6 對(duì)亞硝酸鹽的抗氧化性的測(cè)定[4-8] 分別精確吸取5.000 μg/mL的NaNO2標(biāo)準(zhǔn)液1.2 mL于6支15.0 mL試管中，再分別加含量為0.300 μg/mL（緩沖液提取）或 0.300 μg/mL（堿提）的榆耳蛋白提取液1.2、1.8、2.4、3.0、36、4.8 mL，35 ℃恒溫反應(yīng)10 min。加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%的對(duì)氨基苯磺酸1.2 mL搖勻，靜置5 min后再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.2% 鹽酸萘乙二胺0.6 mL，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻靜置10 min后，在538 nm處測(cè)定吸光度，分別進(jìn)行2次平行試驗(yàn)，取平均值為D。樣本空白管用來調(diào)零的試劑空白管即樣本用蒸餾水代替測(cè)得值為D0。

清除率（SR）=（D0-D）/D0×100%。

式中：D0表示未加試樣后NaNO2的吸光度；D表示加試樣時(shí)NaNO2的吸光度。

2 結(jié)果

2.1 樣品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

按“1.3.2.3”節(jié)方法測(cè)得樣品中蛋白質(zhì)含量的結(jié)果為NaCl堿性溶液提取的榆耳蛋白質(zhì)含量為0.312 μg/mL，緩沖液提取的榆耳蛋白質(zhì)含量為0.297 μg/mL。

2.2 樣品中蛋白質(zhì)對(duì)超氧自由基清除效果研究結(jié)果

取等濃度和體積的NaCl堿性溶液提取的榆耳蛋白質(zhì)、緩沖液提取的榆耳蛋白質(zhì)溶液，分別對(duì)鄰苯三酚的抗氧化活性進(jìn)行研究。由圖1可見，這2種方法提取的榆耳蛋白對(duì)鄰苯三酚超氧自由基都具有清除作用。緩沖液提取的榆耳蛋白質(zhì)比NaCl堿性溶液提取的榆耳蛋白質(zhì)對(duì)超氧自由基的清除效果要好得多，180 s時(shí)緩沖液提取的榆耳蛋白質(zhì)對(duì)超氧自由基的清除率達(dá)93%，而NaCl堿性溶液提取的榆耳蛋白質(zhì)對(duì)超氧自由基的清除率為78%。

2.3 樣品中蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物對(duì)超氧自由基清除效果研究結(jié)果

分別取等質(zhì)量的NaCl堿性溶液提取的榆耳蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物和緩沖液提取的榆耳蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，研究水解產(chǎn)物對(duì)鄰苯三酚的抗氧化活性。由圖2可知，2種方法提取的榆耳蛋白水解產(chǎn)物對(duì)鄰苯三酚超氧自由基都具有一定的清除作用，但比原液清除效果低很多，說明榆耳蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物比榆耳蛋白質(zhì)的抗氧化活性要弱得多，在應(yīng)用時(shí)最好直接應(yīng)用榆耳蛋白質(zhì)。180 s時(shí)緩沖液提取的榆耳蛋白水解產(chǎn)物對(duì)超氧自由基的清除率為43%，而NaCl的堿性溶液提取的榆耳蛋白水解產(chǎn)物對(duì)超氧自由基的清除率僅為29%。

2.4 樣品中蛋白質(zhì)與維生素C對(duì)亞硝酸鹽清除作用的比較研究

取等濃度和體積的NaCl堿性溶液提取的榆耳蛋白質(zhì)、緩沖液提取的榆耳蛋白質(zhì)和維生素C溶液，分別對(duì)亞硝酸鹽清除作用進(jìn)行研究，由圖3可知，這2種方法提取的榆耳蛋白及維生素C對(duì)亞硝酸鹽都有一定的清除作用，隨著濃度的提高清除率都加強(qiáng)。但緩沖液提取的榆耳蛋白質(zhì)對(duì)亞硝酸鹽的清除效果最好，當(dāng)濃度為0.096 μg/mL時(shí)，清除率達(dá)93%。而NaCl堿性溶液提取的榆耳蛋白質(zhì)對(duì)亞硝酸鹽的清除效果次之，當(dāng)濃度為0.096 μg/mL時(shí)，清除率達(dá)51%。維生素C對(duì)亞硝酸鹽的清除效果最差，當(dāng)濃度為0.096 μg/mL時(shí)，清除率僅28%。由此可知，榆耳蛋白對(duì)亞硝酸鹽的清除效果強(qiáng)于維生素C，在應(yīng)用時(shí)最好選擇緩沖液提取的榆耳蛋白質(zhì)清除亞硝酸鹽類。

2.5 樣品中蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物低聚肽與維生素C對(duì)亞硝酸鹽清除作用的比較研究

分別取等質(zhì)量的NaCl堿性溶液提取的榆耳蛋白質(zhì)和緩沖液提取的榆耳蛋白質(zhì)6份進(jìn)行水解，研究水解產(chǎn)物低聚肽對(duì)亞硝酸鹽清除效果，結(jié)果再與相應(yīng)濃度的維生素C溶液對(duì)亞硝酸鹽清除效果進(jìn)行對(duì)比，這2種方法提取的榆耳蛋白水解產(chǎn)物低聚肽及維生素C對(duì)亞硝酸鹽都有一定的清除作用，隨著濃度的提高清除率都增強(qiáng)（圖4）。緩沖液提取的榆耳蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物低聚肽對(duì)亞硝酸鹽的清除效果最好，當(dāng)濃度為0.096 μg/mL時(shí)清除率為67%。NaCl堿性溶液提取的榆耳蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物低聚肽對(duì)亞硝酸鹽的清除效果次之，當(dāng)濃度為0.096 μg/mL時(shí)清除率為41%。維生素C對(duì)亞硝酸鹽的清除效果最差，當(dāng)濃度為0.096 μg/mL時(shí)清除率僅29%。由此可知，榆耳蛋白水解產(chǎn)物低聚肽對(duì)亞硝酸鹽的清除效果強(qiáng)于維生素C，但榆耳蛋白對(duì)亞硝酸鹽清除效果要好于水解產(chǎn)物低聚肽，因此，在應(yīng)用時(shí)最好選擇緩沖液提取的榆耳蛋白質(zhì)清除亞硝酸鹽類。

3 小結(jié)

由試驗(yàn)結(jié)果可知，NaCl堿性溶液和緩沖液2種方法提取的榆耳蛋白含量分別為0.312、0.297 μg/mL。榆耳蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物對(duì)超氧自由基和亞硝酸鹽都有很好的清除效果，但緩沖液提取的榆耳蛋白質(zhì)對(duì)超氧自由基和亞硝酸鹽清除效果最好。由此可知，榆耳蛋白應(yīng)用時(shí)最好選擇緩沖溶液提取的榆耳蛋白質(zhì)。榆耳蛋白質(zhì)具有很強(qiáng)的抗氧化性能，本研究可為榆耳的進(jìn)一步開發(fā)和利用奠定理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持。

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