芥子酸拮抗同型半胱氨酸誘導的血管內皮細胞凋亡及焦亡

裴 星,韓 勇,丘 紅,樊一鋼,耿 杰,田紅燕*

(1西安交通大學附屬紅會醫院內科,西安 710054;2西安交通大學第一附屬醫院周圍血管科;*通訊作者,E-mail:hytgxy@163.com;#共同通訊作者,E-mail:gqgalbert@163.com)

芥子酸拮抗同型半胱氨酸誘導的血管內皮細胞凋亡及焦亡

裴 星1#,韓 勇1,丘 紅1,樊一鋼1,耿 杰2,田紅燕2*

(1西安交通大學附屬紅會醫院內科,西安 710054;2西安交通大學第一附屬醫院周圍血管科;*通訊作者,E-mail:hytgxy@163.com;#共同通訊作者,E-mail:gqgalbert@163.com)

目的 研究同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)對casepase途徑介導的內皮細胞凋亡和焦亡的促進作用,以及該過程中芥子酸(sinapic acid, SA)對Hcy的拮抗作用。 方法 分別利用0,0.1,0.3,0.5,1,3,5 mmol/L濃度的Hcy處理HUVEC-12人臍靜脈內皮細胞24 h,檢測細胞凋亡和細胞焦亡水平,篩選最適處理濃度;以最適濃度Hcy處理細胞24 h,同時分別添加0.1,0.5,1,5,10 μmol/L的SA。采用Annexin-Ⅴ/PI法檢測早期細胞凋亡,caspase-1 FLICA/PI法檢測細胞的焦亡,Western blot檢測細胞中焦亡關鍵調控蛋白NRLP3、ASC、caspase-1,凋亡相關蛋白caspase-8、caspase-3和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達,通過ELISA方法檢測細胞上清中內皮素(endothelin-1,ET-1)及炎性因子白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)的分泌量。 結果 細胞凋亡細胞焦亡水平隨Hcy濃度升高而逐漸上升;與對照相比,當Hcy濃度分別≥0.5 mmol/L和≥1 mmol/L時,細胞凋亡和焦亡水平顯著升高(P<0.05);3 mmol/L和5 mmol/L Hcy進一步促進細胞的凋亡、焦亡及相關調控蛋白的水平(P<0.05);選擇3 mmol/L為最適濃度,用于后續研究。1 μmol/L SA可以抑制上述改變并能拮抗Hcy誘導的ET-1和IL-1β的分泌(P<0.05),并且其拮抗作用跟泛caspase抑制劑Z-VAD-FMK的效果類似。 結論 Hcy可通過casepases途徑誘導血管內皮細胞的凋亡和焦亡;低濃度的SA可拮抗Hcy誘導的血管內皮細胞凋亡和焦亡。

芥子酸; 同型半胱氨酸; 血管內皮細胞; 細胞凋亡; 細胞焦亡

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

人臍靜脈內皮細胞系HUVEC-12，購于美國ATCC細胞庫(American Type Culture Collection,ATCC,Manassas,VA)；芥子酸(SA)、同型半胱氨酸(Hcy)、胎牛血清(FBS)均購于美國Sigma公司；泛caspase抑制劑Z-VAD-FMK購于美國BD公司；Annexin Ⅴ-FITC凋亡試劑盒購自BD公司；FAM-FLICATM體內caspase檢測試劑盒購于Abdserotec公司；BCA蛋白定量分析試劑盒購自美國Thermo公司；ET-1 ELISA試劑盒、小鼠NLRP3單克隆抗體(1 ∶200)、小鼠ASC單克隆抗體、小鼠cleaved caspase-1多克隆抗體、小鼠cleaved caspase-8多克隆抗體、小鼠cleaved caspase-3多克隆抗體和小鼠Bcl-2多克隆抗體(1 ∶500)購自英國Abcam公司；小鼠β-actin單克隆抗體購于Sigma公司；IL-1β ELISA檢測試劑盒購自杭州MultiSciences公司。

CO2細胞培養箱(SANYO,日本);離心機(Eppendorf,德國);流式細胞儀(Beckman Coulter,美國);蛋白電泳儀、凝膠成像系統和多功能酶標儀(Bio-Rad,美國)。

1.2 細胞培養及分組

將HUVEC-12細胞在含有10% FBS的DMEM培養基,37 ℃、5% CO2條件下培養,每隔2-3 d傳代1次,取對數期增長的細胞進行后續實驗。

不同濃度Hcy處理細胞實驗分組:Hcy用完全培養基稀釋后,將貼壁細胞分為6組:對照組(0 mmol/L)、Hcy(0.1 mmol/L)、Hcy(0.3 mmol/L)、Hcy(0.5 mmol/L)、Hcy(1 mmol/L)、Hcy(3 mmol/L)和Hcy(5 mmol/L)處理組。每組細胞需設3個復孔,各組的Hcy處理時間24 h用于細胞凋亡及焦亡檢測。

SA及caspase抑制劑處理細胞實驗分組:將細胞接種于6孔板并培養24 h,將細胞分為空白組、Hcy模型組、SA處理組。除對照組外,各組細胞均換用3 mmol/L的Hcy培養基,同時SA處理組分別加入終濃度0.1,0.5,1,5,10 μmol/L的SA的完全培養基,而caspase抑制劑組則加入10 μmol/L的Z-VAD-FMK,培養24 h用于后續檢測。

1.3 Annexin Ⅴ和碘化丙啶(propidium iodide,PI)雙染色法檢測早期細胞凋亡

用冰PBS洗3次,0.25%的胰蛋白酶將各組細胞消化成細胞懸液,計數后收集106個細胞。離心,棄上清,將細胞重懸于200 μl結合緩沖液,加入10 μl AnnexinⅤ-FITC(20 μg/ml)和5 μl PI(50 μg/ml),避光于室溫下溫育30 min,混勻后用流式細胞儀(FACS caliber, Becton Dickinson)檢測早期細胞凋亡。其中,AnnexinⅤ+、PI-的象限是早期凋亡的細胞。

1.4 caspase-1 FLICA和PI雙染色法檢測細胞焦亡

胰酶消化收集細胞,300×g離心5 min,加入caspase-1 FLICA 37℃孵育1 h,用apoptosis buffer洗滌2次,加入5 μl PI孵育15 min,流式細胞儀檢測細胞的焦亡。caspase-1+、PI+的象限是發生焦亡的細胞。

1.5 Western blot檢測細胞和細胞上清中caspase-1和caspase-3蛋白表達

每孔30 μg蛋白上樣于聚丙烯酰胺凝膠中，120 V電泳2.5 h，將膠中的蛋白樣品轉移到NC膜上，室溫封閉1 h去除封閉液，將小鼠NLRP3單克隆抗體(1 ∶200)、小鼠ASC單克隆抗體(1 ∶400)、小鼠cleaved caspase-1多克隆抗體(1 ∶1 000)、小鼠cleaved caspase-8多克隆抗體(1 ∶800)、小鼠cleaved caspase-3多克隆抗體(1 ∶1 000)、小鼠Bcl-2多克隆抗體(1 ∶500)和小鼠β-actin單克隆抗體(1 ∶5 000)分別與NC膜上相應蛋白條帶4 ℃孵育過夜。1×TBST洗膜3次，每次10 min。將NC膜在羊抗鼠IgG-HRP(1 ∶5 000)中室溫孵育2 h，1×TBST洗膜3次，每次10 min。加入發光液后曝光觀察。

1.6 ELISA檢測細胞上清中IL-1β和ET-1的分泌量

收集細胞上清液,按照Endothelin-1 ELISA Kit(ab133030)和IL-1βELISA Kit(70-E-EK101B1/70-E-EK101B2)試劑盒說明書進行操作。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 高水平Hcy促進HUVEC-12細胞系凋亡和焦亡

不同濃度Hcy處理HUVEC-12細胞24 h,檢測細胞凋亡與細胞焦亡,結果顯示,細胞凋亡水平隨Hcy濃度升高而逐漸上升,Hcy濃度≥0.5 mmol/L時,差異具有統計學意義(見圖1A);細胞焦亡水平同樣隨Hcy濃度升高而逐漸上升,當Hcy濃度≥1 mmol/L時,差異具有統計學意義(見圖1B)。與0.5 mmol/L Hcy處理組相比,3 mmol/L Hcy和5 mmol/L Hcy處理后細胞凋亡水平顯著上升(見圖1A)。與1 mmol/L Hcy處理組相比,3 mmol/L Hcy和5 mmol/L Hcy處理后細胞焦亡水平顯著上升(見圖1B)。細胞焦亡標志蛋白NLRP3、ASC和caspase-1,細胞凋亡蛋白caspase-8和caspase-3的表達變化趨勢與細胞焦亡和凋亡基本一致,抗凋亡蛋白Bcl-2表達變化趨勢則相反(見圖1C)。因此,本實驗選擇3 mmol/L的Hcy濃度用于后續研究。

與對照比較,*P<0.05,**P<0.01;與1 mmol/L Hcy比較,#P<0.05圖1 不同濃度Hcy處理24 h對HUVEC-12凋亡和焦亡的影響Figure 1 The apoptosis and pyroptosis of HUVEC-12 induced by different concentrations of Hcy for 24 h

2.2 SA拮抗高Hcy誘導的內皮細胞凋亡和焦亡

3 mmol/L Hcy與不同濃度SA同時處理HUVEC-12細胞,結果顯示,隨著SA濃度的增加,細胞凋亡和焦亡水平逐漸降低,濃度為1 μmol/L時降到最低;之后,隨著SA濃度的增加,細胞凋亡和焦亡水平又逐漸增加(見圖2A和2B)。NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor 3,NLRP3)、凋亡相關點樣蛋白(ASC)、半胱氨酸天冬蛋白酶-1(cysteine-aspartic acid protease,caspase-1)、caspase-8和caspase-3等蛋白的變化趨勢與細胞凋亡和焦亡的變化趨勢基本一致,抗凋亡蛋白Bcl-2表達變化趨勢則相反(見圖2C)。因此我們選擇1 μmol/L SA濃度作為后續研究。

與對照比較,*P<0.05,**P<0.01;與Hcy+0.1 μmol/L SA比較,#P<0.05;與Hcy+0.5 μmol/L SA比較,&P<0.05圖2 不同濃度SA對Hcy誘導的細胞凋亡和焦亡的影響Figure 2 Effects of different concentrations of SA on Hcy-induced apoptosis and pyroptosis of HUVEC-12

2.3 SA拮抗高Hcy誘導的內皮素和炎癥因子分泌

3 mmol/L Hcy與不同濃度SA同時處理HUVEC-12細胞時,炎癥因子ET-1和IL-1β分泌水平的變化趨勢與細胞凋亡和焦亡的變化趨勢基本一致,隨著SA濃度的增加,ET-1和IL-1β分泌逐漸減少,濃度為1 μmol/L時降到最低;之后,隨著SA濃度的增加,ET-1和IL-1β分泌又逐漸增加(圖3A和3B)。

2.4 SA與caspase抑制劑對細胞凋亡、焦亡影響的比較

3 mmol/L的Hcy處理后,細胞凋亡及焦亡數量顯著增加,1 μmol/L SA可拮抗Hcy誘導的細胞凋亡及焦亡,但這種作用稍弱于Z-VAD-FMK(見圖4A，4B)。3 mmol/L的Hcy處理后,ET-1和IL-1β的分泌量也顯著增高,1 μmol/L SA可拮抗Hcy誘導的ET-1和IL-1β的分泌,但該拮抗作用稍強于Z-VAD-FMK(見圖4C，4D)。

3 討論

細胞凋亡(apoptosis)和細胞焦亡(pyroptosis)都是細胞自主性死亡的過程。細胞凋亡時,胞內的顯著特征為染色質DNA降解成大小為200 bp的整數倍的片段,主要由裂解激活的caspase-3調節[4]。細胞焦亡,又稱細胞炎性壞死,表現為細胞不斷脹大直至胞膜破裂,同時伴隨強烈的炎癥反應,該過程起始于炎性小體NLRP3等與ASC等結合后激活下游的caspase-1,從而催化炎癥因子IL-1β等的成熟和釋放[5]。現有研究表明,動脈粥樣硬化等心血管疾病過程中炎癥因子ET-1和IL-1β釋放量增加,血管內皮細胞的凋亡和焦亡水平提高。本研究亦發現高水平Hcy誘導的內皮細胞功能障礙過程中細胞凋亡和焦亡水平顯著升高,提示細胞凋亡和焦亡在內皮功能障礙過程中均發揮重要推動作用。

A. 不同濃度SA與3 mmol/LHcy同時處理對HUVEC-12細胞ET-1分泌的影響 B. 不同濃度SA與3 mmol/LHcy同時處理對HUVEC-12細胞IL-1β分泌的影響與對照比較,*P<0.05,**P<0.01;與Hcy+0.1 μmol/L SA比較,#P<0.05;與Hcy+0.5 μmol/L SA比較，&P<0.05圖3 不同濃度SA對Hcy誘導的ET-1和IL-1β分泌的影響Figure 3 Effects of different concentrations of SA on Hcy-induced production of ET-1 and IL-1β in HUVEC-12 culture media

與對照比較,*P<0.05,**P<0.01;與3 mmol/LHcy比較,#P<0.05;與Hcy+Z-VAD-FMK比較,&P<0.05圖4 SA與Z-VAD-FMK對Hcy誘導的細胞凋亡、焦亡和炎癥因子分泌拮抗作用的比較Figure 4 Comparison of the antagonistic effects of SA versus Z-VAD-FMK on Hcy-induced apoptosis, pyroptosis, and production of inflammatory factors

高水平Hcy是動脈粥樣硬化等心血管疾病的獨立危險因素[6]。血漿Hcy濃度每升高3 μmol/L,機體發生卒中的概率將增加19%,而缺血性心臟的概率也增加11%[7]。高Hcy水平使得機體過多的產生活性氧物質,導致動脈血管內皮細胞損傷導致內皮細胞凋亡,并加重局部免疫反應。本研究表明,內皮細胞受到不同濃度Hcy處理時,細胞凋亡和焦亡水平隨Hcy濃度升高而逐漸上升,當Hcy濃度≥0.5 mmol/L時細胞凋亡水平與對照組相比差異顯著,Hcy濃度≥1 mmol/L時細胞焦亡水平與對照組相比差異顯著,且3 mmol/L Hcy處理可引起細胞大量凋亡和焦亡。現有多項報道與本研究結果基本一致:人臍靜脈內皮細胞在0.5 mmol/L Hcy濃度刺激下細胞骨架成分發生顯著變化,細胞內氧化應激水平升高,當Hcy濃度達到3 mmol/L時,細胞發生大面積凋亡[8,9];最近亦有研究表明,0.5 mmol/L Hcy與10 μg/ml LPS共同處理內皮細胞后,細胞中活性caspase-3和活性caspase-1表達量顯著增加,細胞凋亡和焦亡水平顯著上升[10]。

芥子酸(又稱3,5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸)是一種天然酚酸類化合物,具有一定的刺激性。心肌梗死、肝損傷和慶大霉素誘導的急性腎損傷小鼠模型中,低濃度的SA表現出一定程度的抗炎、緩解脂質過氧化作用,起到保護心血管和肝腎的作用[11-13]。體內外研究也表明,低濃度的SA可減少ET-1的分泌,促進NO的合成,起到保護血管內皮、舒張血管、降低血壓的作用[14]。本研究亦表明,SA以劑量依賴的方式影響內皮細胞的功能,低濃度的SA抑制caspase-1和caspase-3的表達,抑制Hcy誘導的細胞凋亡、焦亡和炎癥反應,其效果與泛caspases抑制劑有類似之處。然而,高濃度的SA對細胞程序性死亡和炎癥的緩解作用明顯降低,甚至消失,這是因為酚酸類化合物本身就具有一定的刺激性和細胞毒性。可見,SA可作為一種天然的caspase-1/3抑制劑,在內皮細胞的病理性凋亡、焦亡、炎癥和氧化應激的治療過程中有巨大的潛在應用價值,但是一定要嚴格控制用量。

[1] Jeon SB, Kang DW, Kim JS,etal. Homocysteine, small-vessel disease, and atherosclerosis: an MRI study of 825 stroke patients[J]. Neurology, 2014, 83(8): 695-701.

[2] Ansari MA, Raish M, Ahmad A,etal. Sinapic acid mitigates gentamicin-induced nephrotoxicity and associated oxidative/nitrosative stress, apoptosis, and inflammation in rats[J]. Life Sci, 2016, 165 (11):1-8.

[3] Silambarasan T, Manivannan J, Priya MK,etal. Sinapic acid protects heart against ischemia/reperfusion injury and H9c2 cardiomyoblast cells against oxidative stress[J]. Biochem Bioph Res Co, 2015, 456(4): 853-859.

[4] Dunnick JK, Brix A, Sanders JM,etal. Apoptosis: a review of programmed cell death[J]. Toxicol Pathol,2007,35(4):495-516.

[5] Bergsbaken T, Fink SL, Cookson BT. Pyroptosis: host cell death and inflammation[J]. Nat Rev Microbiol,2009,7(2):99-109.

[6] Kumakura H, Fujita K, Kanai H,etal. High-sensitivity C-reactive protein, lipoprotein(a) and homocysteine are risk factors for coronary artery disease in Japanese patients with peripheral arterial disease[J]. J Atheroscler Thromb, 2015, 22(4): 344-354.

[7] Zhong C, Lv L, Liu C,etal. High homocysteine and blood pressure related to poor outcome of acute ischemia stroke in Chinese population[J]. PLoS One, 2014, 9(9): e107498.

[8] Kanazawa I, Tomita T, Miyazaki S,etal. Bazedoxifene ameliorates homocysteine-induced apoptosis and accumulation of advanced glycation end products by reducing oxidative stress in MC3T3-E1 cells[J]. Calcif Tissue Int, 2017, 100(3): 286-297.

[9] El-Hawli A, Qaradakhi T, Hayes A,etal. IRAP inhibition using HFI419 prevents moderate to severe acetylcholine mediated vasoconstriction in a rabbit model[J]. Biomed Pharmacother, 2017, 86(1): 23-26.

[10] Xi H, Zhang Y, Xu Y,etal. Caspase-1 inflammasome activation mediates homocysteine-induced pyrop-apoptosis in endothelial cells[J]. Circ Res, 2016, 118 (10):1525-1539.

[11] Shin DS, Kim KW, Chung HY,etal. Effect of sinapic acid against carbon tetrachloride-induced acute hepatic injury in rats[J]. Arch Pharm Res, 2013, 36(5): 626-633.

[12] Ansari MA, Raish M, Ahmad A,etal. Sinapic acid mitigates gentamicininduced nephrotoxicity and associated oxidative/nitrosative stress, apoptosis, and inflammation in rats[J]. Life Sci, 2016, 165(11):1-8.

[13] Zeng X, Zheng J, Fu C,etal. A newly synthesized sinapic acid derivative inhibits endothelial activation in vitro and in vivo[J]. Mol Pharmacol, 2013, 83(5): 1099-1108.

[14] Silambarasan T, Manivannan J, Krishna Priya M,etal. Sinapic acid prevents hypertension and cardiovascular remodeling in pharmacological model of nitric oxide inhibited rats[J]. PLoS One, 2014, 9(12): e115682.

Antagonisticeffectofsinapicacidonhomocysteine-inducedapoptosisandpyroptosisinendothelialcells

PEI Xing1#,HAN Yong1,QIU Hong1,FAN Yigang1,GENG Jie2,TIAN Hongyan2*

(1DepartmentofInternalMedicine,HonghuiHospitalAffiliatedtoXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710054,China;2PeripheralVascularSection,FirstAffiliatedHospitaltoMedicalCollegeofXi’anJiaotongUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:hytgxy@163.com;#Co-correspondingauthor,E-mail:gqgalbert@163.com)

ObjectiveTo investigate the effect of homocysteine(Hcy) on the promotion of caspases-mediated apoptosis and pyroptosis in endothelial cells and the antagonistic effect of sinapic acid(SA) during this process.MethodsHcy at the concentrations of 0, 0.1, 0.3, 0.5, 1, 3, 5 mmol/L were respectively used to incubate human umbilical vein endothelial HUVEC-12 cells for 24 h. Cell apoptosis and pyroptosis were detected to determine the optimal concentration of Hcy. Then the cells were incubated with the optimal concentration of Hcy together with SA at the concentrations 0.1, 0.5, 1, 5 and 10 μmol/L for 24 h,respectively. Early cell apoptosis was detected with the Annexin-Ⅴ/PI staining method. Cell pyroptosis was detected by the caspase-1-FLICA/PI method. Western blot was used to detect the expression of pyroptotic proteins NRLP3, ASC and caspase-1, the apoptotic proteins caspase-8 and caspase-3, and the anti-apoptotic protein Bcl-2. In the culture media, the production of ET-1 and IL-1β was determined by ELISA.ResultsCell apoptosis and pyroptosis were both gradually increased with the elevation of the Hcy concentration. Compared with 0 mmol/L Hcy, the cell apoptosis and pyroptosis were significantly increased when Hcy concentration≥0.5 mmol/L and ≥1 mmol/L, respectively(P<0.05), and 3 mmol/L and 5 mmol/L Hcy further promoted cell apoptosis, pyroptosis and expression of related proteins(P<0.05). So 3 mmol/L Hcy was selected as the optimal concentration for subsequent experiments. The 1 μmol/L SA antagonized the promoting effect of Hcy on cell apoptosis and pyroptosis and decreased the secretion of endothelin-1(ET-1) and IL-1β. Its antagonistic effect was consistent with Z-VAD-FMK, a pan-caspase inhibitor.ConclusionHcy can induce the apoptosis and pyroptosis of HUVEC-12 cells through the caspase pathways, which can be partially antagonized by low-dose of SA.

sinapic acid; homocysteine; vascular endothelial cells; apoptosis; pyroptosis

西安市紅會醫院科研基金資助項目(YJ2016003)

裴星,男,1964-06生,碩士,副主任醫師,E-mail:gqgalbert@163.com

2017-06-05

R331.32;R364.5

A

1007-6611(2017)11-1096-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.11.003