結直腸癌組織SHP-2和STAT3蛋白表達及臨床意義

譚婉燕，馬清峰

(1華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院消化科,武漢 430077;2華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院檢驗科;*通訊作者,E-mail:402140571@qq.com)

結直腸癌組織SHP-2和STAT3蛋白表達及臨床意義

譚婉燕1，馬清峰2*

(1華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院消化科,武漢 430077;2華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院檢驗科;*通訊作者,E-mail:402140571@qq.com)

目的 觀察STAT3和SHP-2蛋白在結直腸癌中的表達,探討其與結直腸癌臨床病理特征的關系。 方法 采用免疫組織化學法檢測168例結直腸癌及40例癌旁正常組織中STAT3和SHP-2的表達情況,分析其表達與結直腸癌臨床病理參數的關系;采用Western-blot方法檢測40例結直腸癌組織及其癌旁正常組織中STAT3和SHP-2的表達情況。 結果 免疫組化結果顯示,STAT3陽性表達率在結直腸癌組織明顯高于正常大腸組織,而SHP-2陽性表達率在結直腸癌組織明顯低于正常大腸組織,差異均有統計學意義(P<0.05)。Western-blot檢測方法顯示,在結直腸癌組和正常組中,STAT3的蛋白水平分別為0.421 3±0.112 7和0.301 7±0.079 9，SHP-2的蛋白水平分別為0.239 6±0.065 5和0.766 5±0.113 3，且組間比較差異均有統計學意義(P<0.001)。STAT3蛋白的表達與分化程度、淋巴結轉移、遠處轉移和TNM分期有關,與性別、年齡、浸潤程度無關;SHP-2蛋白的低表達與分化程度和淋巴結轉移有關,與性別、年齡、浸潤程度、遠處轉移、TNM分期無關。結直腸癌中,STAT3和SHP-2蛋白表達呈負相關(r=-0.501,P<0.05) 結論 在結直腸癌組織中,STAT3高表達,SHP-2低表達,兩者可能共同參與了腫瘤發生、發展的過程,并可能成為潛在的治療靶點。

結直腸癌; STAT3; SHP-2; 免疫組織化學; 蛋白免疫印跡

結直腸癌在我國已成為第三大常見惡性腫瘤[1,2],它的發生與遺傳因素、環境因素、飲食因素及慢性腸道炎癥等有關。其中慢性炎癥誘發結直腸腫瘤是近幾年研究的熱點之一。

信號轉導及轉錄活化因子3(signal transducer and activator of transcription 3,SATA3)是慢性炎癥促進腫瘤相關炎癥形成及腫瘤發生過程中的關鍵節點,它可通過介導炎癥介質細胞外信號調控腫瘤細胞、免疫細胞等,使腫瘤細胞存活并促進其持續增生[3]。SHP-2屬于蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase,PTPase)家族成員之一,有研究證實,SHP-2對STAT3的磷酸化有間接抑制作用,在多種腫瘤的發生、發展中扮演抑癌蛋白的角色[4,5]。本研究通過免疫組化、Western-blot方法檢測STAT3和SHP-2蛋白在人結直腸癌組織中的表達情況,分析他們與患者臨床病理因素的關系,初步探討STAT3和SHP-2在結直腸癌發生、發展中的作用,為其應用于臨床診治和預后判斷方面提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.2 主要試劑 鼠抗人單克隆STAT3抗體、兔抗人單克隆SHP-2抗體分別購自Bioworld和Abcam公司。免疫組化用STAT3抗體和SHP-2抗體稀釋比例分別為1 ∶200和1 ∶100。Western-blot試驗用STAT3抗體和SHP-2抗體稀釋比例分別為1 ∶600和1 ∶1 000。羊抗兔二抗、DAB顯色試劑盒購自博士德公司,ECL發光液購自Thermo Scientific公司,BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天公司,GAPDH抗體購自杭州賢至生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學法檢測 168例結直腸癌組織中的STAT3和SHP-2表達采用SABC法,操作按試劑盒說明書進行。組織切片經脫蠟、水化、加熱修復抗原、3%過氧化氫溶液消除內源性過氧化物酶活性,1 ∶50羊血清封閉液室溫封閉抗原15 min,一抗在4 ℃下孵育過夜(工作濃度1 ∶100),生物素化二抗室溫孵育15 min,滴加ABC復合物,DAB顯色,蘇木精對比染色后封片,光學顯微鏡下觀察,以PBS替代一抗作為陰性對照。

1.2.2 免疫組織化學結果判定 根據蛋白在細胞內的定位,分別以蛋白表達陽性信號強度和陽性表達面積兩種指標進行綜合評分。計數20個高倍視野的免疫組織化學反應著色的細胞,染色強度積分為:無染色0分,染成淡黃色1分,黃色2分,棕褐色3分;染色面積積分為:著色范圍≤10%為0分,10%-25%為1分,25%-50%為2分,50%-75%為3分,>75%為4分。若兩者積分之和≥3分則為陽性,低于3分則為陰性。

1.2.3 Western-blot方法檢測 40例結直腸癌組織中的STAT3和SHP-2蛋白的表達分別取各組結直腸標本組織,用適量RIPA裂解液勻漿組織,測蛋白濃度后,各樣品取50 μg總蛋白上樣電泳,根據蛋白分子量配制10%的PAGE膠電泳。根據預染Marker顯示,判斷目的蛋白得到充分分離后,停止電泳。取出凝膠根據Marker切下目的條帶,用蒸餾水沖洗,剪與PAGE凝膠相同大小的PVDF膜和濾紙,然后用半干式電轉的方法將蛋白質轉移至PVDF膜上,5%牛血清白蛋白37 ℃封閉2 h,1 ∶600的鼠抗STAT3單克隆抗體和1 ∶1 000抗SHP-2單克隆抗體中4 ℃孵育過夜;生物素標記的羊抗兔IgG中37 ℃孵育2 h,DAB顯色,見有清晰條帶出現即用雙蒸水終止顯色。所得圖像用掃描儀掃描,應用BandScan圖像分析系統測量條帶的吸光度值,將目的蛋白吸光度值與GAPDH的比值作為結果。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 STAT3和SHP-2在結直腸癌組織和正常結直腸組織中的表達

2.1.1 免疫組化學方法觀察STAT3和SHP-2在結直腸癌和正常結直腸組織中的表達 免疫組化染色結果顯示,STAT3的陽性表達主要位于細胞質,少部分位于細胞核(見圖1),結直腸癌組織中STAT3蛋白表達陽性率為58.3%(98/168),與正常結直腸組織27.5%(11/40)比較,結直腸癌組織中STAT3的表達明顯升高,差異有統計學意義(P<0.05)。SHP-2的陽性表達主要位于細胞質,也有少部分位于細胞核(見圖2),結直腸癌組織中SHP-2蛋白表達陽性率為25.6%(43/168),與正常結直腸組織42.5%(17/40)比較,結直腸癌組織中SHP-2的表達明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05)。

A.正常結直腸組織 B.結直腸癌組織圖1 STAT3在結直腸癌和正常結直腸組織中的表達 (SABC,×400)Figure 1 Expression of STAT3 in colorectal carcinoma tissues and normal colorectal tissues (SABC,×400)

A.正常結直腸組織 B.結直腸癌組織圖2 SHP-2在結直腸癌和正常結直腸組織中的表達 (SABC,×400)Figure 2 Expression of SHP-2 in colorectal carcinoma tissues and normal colorectal tissues (SABC,×400)

2.1.2 Western-blot方法觀察STAT3和SHP-2在結直腸癌和正常結直腸組織中的表達 STAT3和SHP-2蛋白的定量采用與GAPDH的蛋白水平相比較的方法進行測量。結直腸癌組織中STAT3的蛋白水平為0.421 3±0.112 7,配對正常結直腸組織中STAT3的蛋白水平為0.301 7±0.079 9,兩組比較差異有統計學意義(P<0.000 1,見圖3)。結直腸癌組織中SHP-2的蛋白水平為0.239 6±0.065 5,配對正常結直腸組織中SHP-2的蛋白水平為0.766 5±0.113 3,兩組比較差異有統計學意義(P<0.000 1,見圖4)。

圖3 正常結直腸組織和結直腸癌中STAT3的Western blot分析Figure 3 Expression of STAT3 protein in colorectal carcinoma tissues and matched adjacent nontumor tissues by Western blot

圖4 正常結直腸組織和結直腸癌中SHP-2的Western blot分析Figure 4 Expression of SHP-2 protein in colorectal carcinoma tissues and matched adjacent nontumor tissues by Western blot

2.2 STAT3和SHP-2在結直腸癌組織表達與臨床病理特征之間的關系

結直腸癌組織中,STAT3的表達與分化程度、淋巴轉移、遠處轉移和TNM分期相關(P<0.05),而與年齡、性別、浸潤程度無關(P>0.05);SHP-2的表達與分化程度、淋巴轉移相關(P<0.05),而與年齡、性別、浸潤程度、遠處轉移、TNM分期無關(P>0.05,見表1)。

表1STAT3和SHP-2在結直腸癌組織中表達與臨床病理特征的關系例(%)

Table1ExpressionofSTAT3andSHP-2incolorectalcarcinomapatientswithdifferentclinicopathologicalfeaturescases(%)

病理特征nSTAT3的高表達PSHP?2的低表達P性別03180463 男9458(617)22(234) 女7440(541)21(284)年齡04330282 <60歲9055(611)20(222) ≥60歲7843(551)23(295)分化程度00120019 高、中分化13673(537)40(294) 低、未分化3225(781)3(94)浸潤程度01350147 T1+T23416(471)12(353) T3+T413482(612)31(231)淋巴結轉移00260037 陰性11158(523)34(306) 陽性5740(702) 9(158)遠處轉移00300709 無15486(558)40(260) 有1412(857) 3(214)TNM分期00110323 Ⅰ+Ⅱ11962(521)33(277) Ⅲ+Ⅳ4936(735)10(204)

2.3 STAT3和SHP-2蛋白表達的相關性

Spearman等級相關分析顯示,結直腸癌組織中,STAT3和SHP-2蛋白表達呈負相關(r=-0.501,P<0.05)。

3 討論

全球每年有超過120萬的結直腸癌新發病例,其中約20%具有家族遺傳性,其他結直腸癌的發生與不良生活習慣、腸道的共生菌和病原體以及慢性腸道炎癥有關,其中由慢性炎癥誘發的結直腸癌近幾年受到廣泛關注。菌群失調、組織損傷及壞死產物均能激活免疫細胞中STAT3通路,使其持續活化,后者能繼續刺激腫瘤微環境中的免疫細胞產生過多的細胞因子;而過多的細胞因子、趨化因子及活性氧等則誘發了DNA突變,這些細胞在慢性炎癥作用下通過抑制凋亡、加速增殖,最終導致了腫瘤的發生[6-8]。

信號轉導及轉錄活化因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)是STATs家族成員之一。STAT3在調控炎癥反應和免疫反應中有著非常重要的作用,同時也是眾多致癌信號通路的重要銜接點。一般情況下,細胞因子、生長因子等可與細胞表面相應受體結合,從而啟動細胞內酪氨酸激酶磷酸化的級聯反應,胞質中的STAT3可自身活化,活化的STAT3可轉至細胞核內,發揮轉錄調控的作用。當某些細胞因子、致癌因子激活SATA3時,異常活化的SATA3可調控下游分子如c-Myc、Cyclin Dl、Bcl-2等抗凋亡及細胞生存等相關蛋白的表達,維持炎癥反應,促進腫瘤細胞增殖,減少細胞死亡[9]。有研究發現[10-14],肝癌、胃癌、結腸癌、肺癌、乳腺癌等腫瘤中的STAT3活性均發生高頻率的異常活化,且活化程度與腫瘤患者的預后呈顯著負相關。本研究發現,STAT3在結直腸癌組織中表達明顯高于正常組織,且與腫瘤的分化程度、淋巴轉移、遠處轉移和TNM分期密切相關。STAT3可能參與了結直腸癌發生、發展的進程,并在結直腸癌侵襲、轉移過程中發揮著重要作用。

SHP-2屬于蛋白酪氨酸磷酸酶(Protein tyrosine phosphatase,PTPase)家族成員之一,具有兩個SH2功能域和一個PTP功能域,其中SH2功能域是與酪氨酸磷酸蛋白質的結合位點,兩者結合后使PTP酶激活,從而作為多種生長因子(如PDGF、EGF、IGF-1等)胞外刺激因素的下游信號分子,參與信號轉導。SHP-2能夠直接或者間接地調控STAT磷酸化,從而影響其轉錄活性[15-16]。有研究表明[17],SHP2能夠通過JAK1/2及STAT3的去磷酸化,負向調控JAK/STAT3通路的功能,抑制STAT3的激活[18-20]。Toso等[21]發現,在前列腺癌中,SHP2與抑癌蛋白PTEN正向相關,通過下調JAK/STAT3通路的活性發揮抑癌功能。Bard-Chapeau等[22]亦發現,SHP-2在肝細胞中對STAT3有重要的負調控作用,在肝細胞中敲除SHP-2可導致STAT3磷酸化水平明顯增高,使肝臟中的炎癥信號增強,從而推動了炎癥引發的肝癌形成。因此,腸組織中SHP2可通過STAT3通路,促進STAT3的持續活化,影響了腸上皮細胞的增殖分化,調節腸道炎癥的發生,從而調控結直腸癌的起始與進展。本實驗免疫組化和Western-blot結果表明,與正常結直腸組織比較,STAT3在結直腸癌中表達明顯上調,SHP-2明顯下調。同時,SHP-2的表達與結直腸癌的分化程度和淋巴結轉移密切相關,在分化程度較低及出現淋巴結轉移的患者中,SHP-2的陽性表達率明顯降低。SHP-2表達下降有可能成為結直腸癌淋巴轉移及不良預后的標志物,并可能成為潛在的治療靶點。

總之,在結直腸癌中,STAT3表達上調,SHP-2的表達下調,二者的表達呈負相關。SHP-2可能通過負向調控STAT3通路來發揮抑癌作用,但具體作用機制和信號通路有待進一步研究。

[1] Douaiher J, Ravipati A, Grams B,etal. Colorectal cancer-global burden, trends, and geographical variations[J]. J Surg Oncol, 2017, 115(5):619-630.

[2] 張玥,石菊芳,黃慧瑤,等.中國人群結直腸癌疾病負擔分析[J].中華流行病學雜志,2015,36(7):709-714.

[3] Yu H, Pardoll D, Jove R. STATs in cancer inflammation and immunity: a leading role for STAT3[J]. Nat Rev Cancer, 2009, 9(11): 798-809.

[4] Zhang L, Yang Z, Ma A,etal. Growth arrest and DNA damage 45G down-regulation contributes to Janus kinase/signal transducer and activator of transcription 3 activation and cellular senescence evasion in hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology, 2014, 59(1): 178-189.

[5] Bard-Chapeau EA, Li S, Ding J,etal. Ptpn11/Shp2 acts as a tumor suppressor in hepatocellular carcinogenesis[J]. Cancer Cell, 2011,19(5): 629-639.

[6] Iliopoulos D, Hirsch HA, Struhl K. An epigenetic switch involving NF-kappaB, Lin28, Let-7 MicroRNA, and IL6 links inflammation to cell transformation[J].Cell,2009,139(4):693-706.

[7] Greten FR, Karin M. NF-κB linking inflammation and immunity to cancer development and progression[J]. Nat Rev Immunol, 2005,5(10):749-759.

[8] Grivennikov S, Karin E, Terzic J,etal. IL-6 and Stat3 are required for survival of intestinal epithelial cells and development of colitisassociated cancer[J]. Cancer Cell, 2009,15(2):103-113.

[9] 侯嘉杰,孫倍成.STAT3:慢性炎癥介導腫瘤發生和進展的關鍵節點[J].生物化學與生物物理進展,2014,41(1):69-78.

[10] Morikawa T, Baba Y, Yamauchi M,etal. STAT3 expression,molecular features, inflammation patterns, and prognosis in a database of 724 colorectal cancers[J]. Clin Cancer Res, 2011, 17 (6):1452-1462.

[11] Schütz A , R?ser K , Klitzsch J ,etal. Lung adenocarcinomas and lung cancer cell lines show association of MMP-1 expression with STAT3 activation[J].Transl Oncol, 2015, 8 (2): 97-105.

[12] Ku JM, Kim SR, Hong SH,etal. Cucurbitacin D induces cell cycle arrest and apoptosis by inhibiting STAT3 and NF-κB signaling in doxorubicin-resistant human breast carcinoma (MCF7/ADR) cells[J]. Mol Cell Biochem, 2015,409 (1-2): 33-43.

[13] Cai QW, Li J, Li XQ,etal.Expression of STAT3, MMP-1 and TIMP-1 in gastric cancer and correlation with pathological features[J]. Mol Med Report,2012,5 (6): 1438-1442.

[14] Kao JT, Feng CL, Yu CJ,etal. IL-6, through p-STAT3rather than p-STAT1, activates hepatocarcinogenesis and affects survival of hepatocellular carcinoma patients: a cohort study[J]. BMC Gastroenterol, 2015,15(1): 50-60.

[15] Leibowitz MS, Srivastava RM, Andrade Filho PA,etal. SHP2 is overexpressed and inhibits p STAT1-mediated APM component expression, T-cell attracting chemokine secretion, and CTL recognition in head and neck cancer cells[J]. Clin Cancer Res, 2013, 19(4): 798-808.

[16] Dittrich A, Quaiser T, Khouri C,etal. Model-driven experimental analysis of the function of SHP-2 in IL-6-induced Jak/STAT signaling[J].Mol Biosyst, 2012,8 (8): 2119-2134.

[17] Mohi MG, Neel BG. The role of Shp2 (PTPN11) in cancer[J].Curre Opin Genet Dev, 2007, 17(1): 23-30.

[18] Toso A, Revandkar A, Di Mitri D,etal. Enhancing chemotherapy efficacy in pten-deficient prostate tumors by activating the senescence-associated antitumor immunity[J].Cell Rep, 2014, 9(1): 75-89.

[19] Sturla LM, Zinn PO, Ng K,etal. Src homology domain-containing phosphatase 2 suppresses cellular senescence in glioblastoma[J].Br J Cancer, 2011, 105(8): 1235-1243.

[20] Zhang W, Chan RJ, Chen H,etal. Negative regulation of Stat3 by activating PTPN11 mutants contributes to the pathogenesis of Noonan syndrome and juvenile myel-omonocytic leukemia[J]. J Biol Chem, 2009, 284(33): 22353-22363.

[21] Toso A, Revandkar A, Di Mitri D,etal. Enhancing chemotherapy efficacy in Pten-deficient prostate tumors by activating the senescence-associated antitumor immunity[J].Cell Rep, 2014, 9(1): 75-89.

[22] Bard-Chapeau EA,Li S,Ding J,etal.Ptpn11/Shp2 acts as a tumor suppressor in hepatocellular carcinogenesis[J].Cancer Cell,2011,19(5):629-639.

ExpressionandclinicalsignificanceofSHP-2andSTAT3incolorectalcarcinoma

TAN Wanyan1,MA Qingfeng2*

(1DepartmentofGastroenterology,LiyuanHospital,TongjiMedicalCollegeofHuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430077,China;2DepartmentofClinicalLaboratory,LiyuanHospital,TongjiMedicalCollegeofHuazhongUniversityofScienceandTechnology;*Correspondingauthor,E-mail:402140571@qq.com)

ObjectiveTo investigate the expression of STAT3 protein and SHP-2 protein in colorectal carcinoma(CRC), and to explore its relationships with clinical characteristics.MethodsImmunohistochemisty was used to detect the expression of STAT3 and SHP-2 in 168 cases of CRC tissues and 40 cases of normal tissues. The expression of STAT3 and SHP-2 was compared between patients with different clinicopathological features of CRC. The expression of STAT3 and SHP-2 in 40 cases of CRC tissues and matched adjacent non-tumor tissues was detected by Western-blot.ResultsThe results of immunohistochemisty demonstrated that the positive expression rate of STAT3 protein in 168 cases of CRC was significantly higher than that of normal tissues(P<0.05), but the positive expression rate of SHP-2 protein in 168 cases of CRC was significantly lower than that of normal tissues(P<0.05). Western-blot results showed that STAT3 protein in CRC was higher than that of matched adjacent non-tumor tissues(0.421 3±0.112 7vs0.301 7±0.079 9,P<0.05), but SHP-2 protein level in CRC was lower than that of matched adjacent non-tumor tissues(0.239 6±0.065 5vs0.766 5±0.113 3,P<0.001). The expression of STAT3 in CRC tissues was correlated with differentiation grade,lymph node metastasis,distant metastasis and TNM stage, but not related to gender, age and invasion depth. The expression of SHP-2 in CRC tissues was correlated with differentiation grade and lymph node metastasis, but not related to gender, age, invasion depth, distant metastasis and TNM stage. The expression of STAT3 protein was negatively correlated with the expression of SHP-2 in colorectal carcinoma protein(r=-0.501,P<0.05).ConclusionThe expression of STAT3 is higher but SHP-2 is lower in CRC patients, suggesting that the two proteins may be involved in the evolution and development process of CRC, which may be used as potential therapeutic targets in the treatment.

colorectal carcinoma; STAT3; SHP-2; immunohistochemistry; Western-blot

湖北省自然科學基金資助項目(2014CFB434)

譚婉燕,女,1978-12生,碩士,副主任醫師,E-mail:2898077793@qq.com

2017-07-30

R735.3

A

1007-6611(2017)11-1172-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.11.018