長鏈非編碼RNA在腫瘤耐藥中的作用

高夢如，魏小麗，顧康生

(安徽醫科大學第一附屬醫院腫瘤內科，安徽 合肥 230022)

早期的惡性腫瘤由于缺少特征性臨床癥狀，確診患者大部分已有轉移，無法直接接受手術治療，因此，化療就成為治療腫瘤的重要途徑。然而，中晚期惡性腫瘤由于先天性或者后天性耐藥的存在，患者對化療敏感性不佳，治療效果大打折扣。近年來，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA) 不僅在調控正常細胞增殖分化過程中發揮重要作用，在惡性腫瘤的發生、發展、耐藥等過程中同樣顯示出很多潛在的作用。本文對近幾年lncRNA在腫瘤耐藥性方面的文章進行綜述，期待找出克服腫瘤耐藥性的相關分子機制，提高腫瘤化療敏感性。

1 lncRNA與腫瘤

從本質上說惡性腫瘤是一種遺傳性疾病，它通過修改細胞遺傳信息，破壞細胞內穩態并促進細胞增殖。過去的研究表明，蛋白質編碼基因突變、原癌基因激活或者抑癌基因沉默可以驅動惡性腫瘤的產生。基于這個原理開發出了惡性腫瘤的靶向治療，例如酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼治療BCR-ABL型白血病[1]。然而，在人類的基因組序列中轉錄的編碼序列小于2%，人類生物生物功能復雜程度和非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA)更相關。同樣，在腫瘤的發生發展過程中，ncRNA的功能越來越被關注。這些非編碼RNA中轉錄長度大于200個核苷酸，缺少特定開放閱讀框，無編碼蛋白質功能的即為lncRNA。根據lncRNA和鄰近編碼基因的位置關系分為正義(sense)、反義(antisense)、雙向(bidirectional)、基因內(intronic)及基因間(intergenic)5類[2]。來源上，lncRNA可能來自于基因復制過程中出現反位移、局部串聯復制以及轉座子插入、蛋白質編碼基因中斷或者染色質重組。lncRNA在調控蛋白編碼基因表達發揮重要作用，包括參與了 X染色體沉默和激活，作為轉錄因子和表觀遺傳修飾因子活化的“支架”與蛋白結合，進而引導其定位于基因組上特定位點等[3]，lncRNA自身可以作為mRNA的前體或作海綿靶向降解mRNA抑制翻譯[4]。

2 lncRNA和腫瘤耐藥

腫瘤細胞對抗癌藥物產生耐藥性是化療失敗的主要原因之一。不管是預先存在的先天性耐藥，還是獲得的次級耐藥，細胞內信號通路的異常激活與腫瘤耐藥性密切相關。lncRNA可以改變藥物外排系統，增加藥物代謝、細胞周期的改變、細胞凋亡異常、上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)等方式誘導耐藥性(Fig 1)。另外，有靶向結合位點的lncRNA可以和微小RNA(microRNA, miRNA)形成內源性競爭性RNA(competing endogenous RNAs, ceRNA)參與耐藥性[5]。

Fig 1 Mechanisms of cancer drug resistance mediated by alterations of drug efflux, cell cycle, apoptosis, as well as EMT

2.1藥物外排系統改變相關的lncRNA與腫瘤耐藥性藥物外排系統的改變是腫瘤耐藥機制中最常見的一種。由于藥物流出的增加，導致細胞內藥物濃度低于細胞殺傷閾值，引起腫瘤耐藥。ATP結合盒蛋白(ATP-binding cassette protein, ABC)、多藥耐藥相關蛋白(multi-drug resistant associate protein, MRP)和銅轉運體1(Copper transport protein, CTR1)等藥物外排相關轉運體的表達會受到多種lncRNA影響。人類中已知的49種ABC轉運蛋白被分為從ABCA到ABCG的7個亞類，ABCG2、MRP都是ABC轉運蛋白家族的成員[6]。Jiang等[7]在69例接受替莫唑胺(temozolomide ,TMZ)化療的腦膠質瘤患者中檢測出3種lncRNA H19的轉錄本變體，并鑒定出最長的變體1在耐藥組織比敏感組織明顯升高。同樣，在腦膠質瘤細胞系U87和U251及其TMZ耐藥系U87/TMZ和U251/TMZ中，H19在耐藥系中高表達，敲除耐藥系中H19，MDR、MRP和ABCG2的mRNA和蛋白質表達明顯下調。因此，高表達的H19使多種耐藥相關基因(multidrug resistance, MDR)、MRP和ABCG2表達增多，TMZ外排增加，耐藥性增強。Jiang等[8]在多種非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)體內和體外研究中均證實，綠茶多酚(epigallocatechin gallate, EGCG)通過誘導CTR1表達，促進鉑在細胞中積累，增強腫瘤細胞順鉑的敏感性。再進一步的機制研究中發現EGCG使通過lncRNA NEAT1(nuclear paraspeckle assembly transcrip 1)和hsa-miR-98-5p形成ceRNA，促進CTR1表達。不僅在實體瘤中，在白血病中NEAT1也存在表達失調。Gao等[9]在多種白血病細胞以及患者組織相對正常細胞或組織，NEAT1明顯低表達，表明NEAT1在白血病中具有腫瘤抑制功能。NEAT1在多種白血病細胞系中過表達可以抑制ABCG2，減少硼替佐米和Alisertib外排，從而減輕耐藥性。Lan等[10]不僅在5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)和順鉑耐藥胃癌患者的組織中發現INK4基因座的反義非編碼RNA—lncRNA ANRIL(antisense non-coding RNA in the INK4 locus)高表達，并且在順鉑耐藥的細胞(BGC823/DDP)和5-FU耐藥細胞(BGC823/5-FU)也具有相同的上調趨勢。敲低ANRIL表達，抑制MDR1和MRP1，從而限制胃癌多藥耐藥性的發展。

2.2細胞周期相關lncRNA與腫瘤耐藥性阿糖胞苷能干擾DNA的合成，對惡性腫瘤細胞的S期(DNA合成期)有特異性殺傷作用，被稱為細胞周期依賴性抗腫瘤藥物，對此類藥物的耐藥性被稱為化療相對不敏感[11]。周期依賴性蛋白激酶(cyclin-dependent protein kinase, CDK)是調控細胞周期的重要因子，通過阻斷CDK可以導致細胞周期停滯，降低化療療效。He等[12]分析了阿霉素耐藥細胞(MCF-7/ADM)和乳腺癌細胞(MCF-7/WT)的lncRNA表達譜，并發現了一組失調的lncRNA。在初步研究中，lncRNA NONHSAT028712在MCF-7/ADM細胞和MCF-7/PTX細胞中均明顯增加，其鄰近基因CDK2在多種耐藥細胞中也高表達，在ADM細胞中抑制NONHSAT028712，CDK2的mRNA水平明顯降低，并且G1期細胞周期停滯增多。因此，NONHSAT028712順式調節CDK2，促進阿霉素耐藥性，具體機制需要進一步探索。Li等[13]在骨肉瘤體內和體外實驗均存在，腫瘤組織相對正常組織lncRNA HOTTIP(HOXA transcript at the distal tip)明顯高表達。用不同劑量的順鉑處理骨肉瘤細胞，HOTTIP高表達促進細胞進入S期，促進細胞對順鉑耐藥。機制研究證實，HOTTIP可以通過激活Wnt/β連環蛋白(β-catenin)途徑，增加骨肉瘤細胞對順鉑耐藥性。尿路上皮癌相關抗原1(urothelial carcinoma associated 1,UCA1)是一種在乳腺癌中具有致癌作用的lncRNA。Li等[14]在研究中發現，在雌激素受體(estrogen receptor,ER)陽性乳腺癌細胞(MCF-7)中，UCA1上調導致停滯于G0/G1期的細胞減少，凋亡減少，腫瘤細胞增殖活躍，他莫昔芬抗性明顯升高；另一方面，他莫昔芬通過miR-18a-HIF1α反饋環也可以誘導UCA1上調，產生耐藥性。在耐藥細胞LCC2、LCC9、BT474中，敲低UCA1使細胞周期停滯增多，內分泌治療敏感性增加。因此，UCA1上調導致ER陽性乳腺癌細胞獲得性他莫昔芬耐藥。UCA1含有miR-18a靶點，可以形成ceRNA，是缺氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)的負調節因子。miR-18a抑制劑降低MCF-7細胞對他莫昔芬的敏感性，而miR-18a類似物使耐藥的BT474細胞對他莫昔芬致敏。miR-18a下調也部分地促成癌細胞中獲得性的他莫昔芬抗性。他莫昔芬通過miR-18a-HIF1α反饋環也可以誘導UCA1上調，產生耐藥性。

2.3細胞凋亡相關lncRNA與腫瘤耐藥性大多數藥物通過激活細胞凋亡途徑抑制癌細胞生長[19]，凋亡的異常調控可能有助于腫瘤細胞增殖產生耐藥性。lncRNA通過上調Bcl-2、核因子-κB (nuclear factor-kappaB, NF-κB)、凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein, IAP)等促生存因子，獲得凋亡抗性，或者抑制caspase、p53等抑癌基因表達，產生耐藥性。?ze等[15]觀察到復發性鉑耐藥卵巢腫瘤相對原發性卵巢腫瘤lncRNA HOTAIR(hox transcript antisense)水平升高，并且HOTAIR的上調可以誘導卵巢癌發生鉑耐藥。在鉑誘導的DNA損傷修復過程中，HOTAIR使DNA損傷修復持續激活，NF-κB表達，白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)分泌和活化細胞周期檢測點激酶1(checkpoint kinase 1,CHK1)-p53-p21途徑，抑制凋亡，產生化療耐藥性。在DNA損傷修復期間，驅動NF-κB-HOTAIR軸正反饋環級聯有助于細胞凋亡和化療敏感[15]。Liu等[16]的研究中，與順鉑敏感的卵巢癌患者組織相比，順鉑耐藥患者的腫瘤組織中lncRNA PVT1(plasmacytoma variant translocation 1)過表達。順鉑耐藥細胞(SKOV-3/DDP、A2780/DDP)相比順鉑敏感細胞(SKOV-3和A2780)，同樣存在PVT1高表達。敲低PVT1，使轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、p-Smad4、caspase-3的mRNA和蛋白均明顯升高，腫瘤細胞凋亡百分比增加，細胞活力減低，可以逆轉順鉑耐藥細胞株的順鉑耐藥性；PVT1過表達則使TGF-β1、p-Smad4、caspase-3的mRNA和蛋白均明顯降低，腫瘤細胞凋亡百分比減少，細胞活力升高。可見，PVT1通過調節細胞凋亡途徑參與卵巢癌順鉑耐藥性產生。Wang等[17]發現，順鉑敏感的骨肉瘤細胞中，LINC00161通過競爭性結合miR-645和上調四肽重復的干擾素誘導蛋白(interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 2,IFIT2)表達，促進凋亡,化療敏感。另一方面，LINC00161在順鉑耐藥細胞中下調，使骨肉瘤細胞產生順鉑耐藥性。Pan等[18]發現，在膀胱癌細胞中lncRNA UCA1表達減少，抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡，降低順鉑/吉西他濱敏感性，而UCA1的過表達增加了膀胱癌細胞敏感性。UCA1和環磷腺苷效應元件結合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)啟動子結合，激活miR-196a-5p表達。miR-196a-5p可以直接靶向p27 kip1，誘導細胞凋亡，參與順鉑/吉西他濱耐藥。這提供了一種新型的UCA1-CREB-miR-196a-5p模式，可以部分解釋UCA1在順鉑/吉西他濱耐藥中的作用。Shang等[18]研究了過表達UCA1在胃癌對阿霉素耐藥中的作用。沉默UCA1可以明顯抑制胃癌BGC-823和SGC7901細胞的增殖。 UCA1沉默抑制SGC7901/ADR細胞對阿霉素的耐藥性，阿霉素的IC50明顯下降。在SGC7901/ADR細胞中，UCA1沉默明顯促進DNA修復酶PARP(poly ADP-ribose polymerase)蛋白表達，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，誘導凋亡產生。這些結果表明，UCA1沉默誘導的化療耐藥性變化可能由細胞凋亡途徑介導。Fang等[20]研究同樣發現UCA1在胃癌組織中明顯上調，并且其表達與miR-27b表達水平呈負相關。抑制UCA1明顯提高胃癌多藥耐藥細胞(SGC7901/ADR)中miR-27b的表達。耐藥細胞中，敲低UCA1和miR-27b過表達，降低了ADR、DDP和5-FU的IC50，并增加了ADR誘導的細胞凋亡。胃癌細胞SGC7901中，UCA1過表達和miR-27b抑制，增加了ADR、DDP和5-FU的IC50，降低了ADR誘導的細胞凋亡。蛋白質印跡分析顯示，UCA1敲低和miR-27b過表達，也降低抗凋亡蛋白Bcl-2表達，增加促凋亡蛋白caspase-3的表達。因此，UCA1-miR-27b軸參與胃癌細胞化學敏感性的調節。Bian等[21]在2個結直腸癌隊列中發現UCA1上調，通過抑制凋亡，促進生長，并降低對5-FU的敏感性，且與患者生存時間負相關。以前報道的2種UCA1轉錄物NR_015379.3(～1.4 kb)和GU799565(～2.3 kb)，在結直腸癌(colorectal cancer, CRC)中只有前者作為UCA1的主要轉錄物。5-FU是細胞周期特異性抗腫瘤藥物，但UCA1不影響CRC細胞的細胞周期。UCA1和miR-204-5p形成ceRNA，恢復CRC細胞中miR-204-5p靶基因Bcl-2、RAB22A和CREB1表達，從而促進CRC細胞的增殖和化療耐藥性。UCA1的過表達可通過抑制5-FU誘導的細胞凋亡，促進CRC細胞對5-FU的耐藥性，而沉默UCA1增加細胞凋亡，使CRC細胞對5-FU敏感。表明UCA1或miR-204-5p影響5-FU敏感性主要通過誘導凋亡，而不是細胞周期停滯。

Tab 1 lncRNA involved in drug resistance of tumor

2.4EMT相關lncRNA與腫瘤耐藥性EMT是一種與基底膜相連的上皮細胞喪失細胞極性和細胞-細胞間黏附能力，成為間充質細胞，這種生物學性狀的改變使細胞獲得遷移和侵襲能力。維持干細胞特性、腫瘤進展、轉移和化療耐藥性與EMT相關[21]。多種腫瘤細胞在經過化療后會發生EMT，這種適應性變化的產生使腫瘤細胞繼發性耐藥。Chen等[23]發現，多西紫杉醇耐藥性肺腺癌細胞具有EMT表型。結腸癌相關轉錄物-1(colon cancer-associated transcript-1,CCAT1)是一種在多西他賽耐藥肺腺癌細胞中上調的lncRNA。此外，CCAT1的下調降低了多西他賽耐藥性肺腺癌細胞的耐藥性，抑制增殖，增強細胞凋亡和逆轉EMT表型。CCAT1在多西他賽耐藥性肺腺癌細胞中的致癌作用取決于let-7c的海綿狀結構。反過來，CCAT1的let-7c擴散釋放出Bcl-xl(let-7c靶)，從而促進了多西紫杉醇肺腺癌細胞中化療抗性和EMT表型的獲得。Pan等[24]的實驗室中建立的多西紫杉醇肺腺癌細胞具有化療耐藥和間充質特征。首先在誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)中發現長的基因間非編碼RNA—lncRNA ROR，并在多西他賽耐藥的肺腺癌細胞中上調。在研究肺腺癌中獲得化療耐藥性基于EMT的lncRNA相關機制中，發現在多西他賽耐藥的肺腺癌細胞中，ROR的表達降低有效地逆轉了EMT，并使其化療敏感。肺腺癌細胞中ROR的功能取決于和miR-145形成的海綿狀結構，釋放miR-145靶標FSCN1，從而有助于獲得耐多西紫杉醇LAD細胞的化學耐藥性和EMT表型。lncRNA PVT1在宮頸癌中對化療敏感性具有調節作用。Shen等[25]采用HPV16陽性CaSki和SiHa細胞作為體外細胞模型。敲除HPV16 E7明顯抑制PVT1，并恢復miR-195的表達。 PVT1與miR-195啟動子區域中的EZH2和復合錨點直接相互作用。 PVT1過表達導致miR-195啟動子區域H3K27me3水平升高，而PVT1敲低可降低啟動子區域的H3K27me3水平。此外，PVT1可以與miR-195競爭結合。 miR-195過表達抑制了癌細胞中的PVT1表達。 PVT1和miR-195均可抑制紫杉醇(paclitaxel,PTX)誘導的EMT，并使CaSki細胞對PTX敏感。推測PVT1通過增強miR-195啟動子區域中的組蛋白H3K27me3水平以及和miR-19形成ceRNA，直接降低miR-195的表達。此外，PVT1/miR-195軸可通過調節EMT，調節癌細胞對PTX的反應性。

3 總結與展望

盡管對腫瘤藥物抗性機制的研究不斷進展，但是對由lncRNA介導的耐藥機制的認識仍然相當有限。在本綜述中，我們嘗試總結lncRNA在腫瘤耐藥性中發揮的作用以及機制(Tab 1)。 這些結果表明，多種lncRNA在化療敏感性和耐藥性細胞中表達不同，其中大多數與化學抗性正相關，通過調節基因表達直接或間接影響化療療效。 不僅1種lncRNA可以調節許多藥物抗性，而且1種藥物抗性可以被許多lncRNA調節。lncRNA在耐藥性相關的分子機制正在被不斷研究，這將會為更有效的治療腫瘤帶來新的希望。

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