北美海篷子三萜皂苷bigelovii E抑制mTOR信號通路誘導乳腺癌MCF-7細胞凋亡

黃真真，張丹玉，師 琪，管福琴，王奇志，王 鳴，馮 煦，單 宇

(江蘇省中國科學院植物研究所，江蘇省農業種質資源保護與利用平臺天然產物研究中心，江蘇 南京 210014)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。據全國腫瘤登記中心預計，2015年中國乳腺癌發病率和死亡率分別占女性癌癥發病和死亡的15%和7%[1]，并呈現逐年上升的趨勢[2]。臨床研究表明，一些天然產物在藥理學和癌癥治療中具有潛在的應用，具有直接性和毒性作用小等特點，可直接作用于病變部位，減少了對正常組織和細胞的損害。因此，從天然藥物中尋找抗腫瘤的新型藥物具有重要意義[3]。北美海篷子(SalicorniabigeloviiTorr.)生長于鹽堿地、鹽湖旁及海邊[4]，可直接利用海水灌溉[5]，栽培海蓬子還能吸收與利用海水水產養殖池排污物的營養，構建生態濕地，為野生禽類提供食物和棲息地，有益于改良生態環境[6]。現代藥理學研究表明，北美海篷子具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗凝血的作用[7-8]。此外，研究發現，從北美海篷子分離得到多種皂類成分，都具有很好的抗腫瘤作用[9]。bigelovii E是從北美海篷子中分離得到的一種三萜類化合物，結構見Fig 1[10]。本課題組研究發現，bigelovii E對乳腺癌細胞MCF-7具有明顯的體外抑制作用，且對正常細胞的毒性較低，但其作用機制尚不明確。因此，本研究進一步觀察了bigelovii E對MCF-7細胞凋亡的影響，分析bigelovii E對MCF-7細胞線粒體凋亡通路的調控及其作用機制。

Fig 1 Chemical structure of bigelovii E

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 人類癌細胞系(MCF-7、Hela、HepG2、A549、B16、Lovo、LN229)和正常細胞株(HLF-1)均購自中國科學院上海細胞庫。

1.1.2試劑 Bigelovii E由本課題組從北美海篷子中分離純化獲得；胰蛋白酶和DMEM培養基購自以色列BioInd公司；胎牛血清(FBS)購自北京索萊寶科技有限公司；MTT、二甲基亞砜(DMSO)、碘化丙啶(PI)、Hoechst 33258、羅丹明123、DCFDA、NAC均購自美國Sigma Aldrich公司；Annexin V-PE/7-ADD細胞凋亡試劑盒，購自美國BD公司；BCA蛋白測定試劑盒、RIPA裂解緩沖液，購自江蘇碧云天生物技術研究所；一抗PARP、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-7、Mcl-1、Bax、Bak、Bcl-xl、mTOR、p-mTOR、p-p70S6K、p-4-EBP、β-actin，Tubulin以及二抗，購自美國CST公司；ECL化學發光液購自美國Thermo Fisher Scientific公司。所有其他化學試劑均購自沈陽國藥化學試劑有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 細胞在含有10% FBS、青霉素100 kU·L-1、鏈霉素100 g·L-1的DMEM或RPMI 1640中培養，培養條件為37℃、5% CO2。培養液2～3 d更換1次。

1.2.2MTT法 分別取處于對數生長期的細胞，鋪于96孔培養板中，每孔100 μL，含有細胞5 000個，分別用(3.125、6.25、12.5、25、50、100 mg·L-1)的 bigelovii E處理，每個濃度重復3孔，在37℃、含5% CO2的培養箱中孵育。72 h后，向各孔中加10 μL MTT(5 g·L-1)，培養箱中繼續孵育4 h后，每孔中加入100 μL DMSO，振搖5 min，用酶標儀在波長570 nm下測定每孔的吸光值，進行至少3次獨立實驗。通過確定每個細胞系的IC50值，檢測 bigelovii E對腫瘤細胞和正常細胞活力的影響。

1.2.3集落克隆實驗 將細胞以400個細胞/孔的密度接種在6孔板上。 24 h后，用 bigelovii E(2.5、5、10 mg·L-1)或DMSO處理MCF-7細胞。培養液每3 d更換1次。再培養10 d，觀察到細胞集落形成后，去除培養液，PBS洗2次，4%多聚甲醛固定10 min，結晶紫染色后計數。進行至少3次獨立實驗。

1.2.4Hoechst 33258熒光染色 取處于對數生長期的乳腺癌MCF-7細胞，常規消化，制成單細胞懸液，計數，以2.5×107·L-1接種于6孔板中，用不同濃度的 bigelovii E(2.5、5、10 mg·L-1)處理48 h后，細胞用PBS洗滌2次，固定液固定10 min，然后用0.5 mL Hoechst 33258染色5 min，去除培養液，PBS洗2次，在倒置熒光顯微鏡下分析形態學變化。

1.2.5Annexin V-PE/7-ADD雙染法測定細胞凋亡率 取對數生長期細胞，1×105個接種于6孔板，用bigelovii E(2.5、5、10 mg·L-1)處理細胞48 h，并用PBS洗滌。隨后收集細胞，并重懸于100 μL結合緩沖液中。將細胞懸浮液與Annexin V-PE和7-ADD染液在黑暗中孵育15 min，加入400 μL結合緩沖液，流式細胞儀檢測，采用Accuri C6 software獲取并分析數據。

1.2.6檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP) 將MCF-7細胞(1×105/孔)接種到6孔板，用bigelovii E(2.5、5、10 mg·L-1)處理。48 h后棄去培養基，用PBS清洗3次，然后在含有10 μmol·L-1RH123探針的無血清DMEM培養基中37℃孵育30 min。細胞用PBS洗滌3次，常規消化，制成單細胞懸液后，用流式細胞儀檢測熒光強度。

1.2.7細胞內活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平的測量 將對數生長期細胞(1×105/孔)接種在6孔板中，然后用含有不同藥物的培養基處理。收集細胞后，加入10 μmol·L-1DCFDA，在黑暗中37℃孵育30 min。流式細胞儀測定細胞內ROS含量。

1.2.8Western blot 檢測相關蛋白的表達 細胞用不同濃度的 bigelovii E處理48 h后，收集細胞，提取各實驗組細胞總蛋白。等量的蛋白(30 μg)在10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳，并轉移到PVDF膜，用 5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h，然后加適當的一抗4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10 min，二抗室溫孵育2 h，ECL發光液反應1 min后，顯影，定影。

2 結果

2.1BigeloviiE對腫瘤細胞和正常細胞增殖的影響使用MTT法檢測 bigelovii E對人腫瘤細胞和正常細胞增殖的抑制作用。bigelovii E對人乳腺癌細胞MCF-7、宮頸癌細胞Hela、肺癌細胞HepG-2、肝癌細胞A549、黑素瘤細胞B16、結腸癌細胞Lovo、腦膠質瘤細胞LN229的IC50值分別為8.17、8.67、13.14、10.64、18.35、9.48、34.93 mg·L-1(Fig 2)。其中，bigelovii E對MCF-7細胞株最敏感，并具有劑量依賴效應，同時對人正常細胞株HLF-1的存活率無明顯影響(Fig 3)，表明bigelovii E對MCF-7具有較好的選擇性。

2.2BigeloviiE抑制MCF-7的集落形成集落形成可以體現細胞獨立生存能力，常用于抗癌藥物敏感實驗、腫瘤放射生物學實驗。Fig 4結果顯示，與對照相比，bigelovii E明顯抑制MCF-7的集落形成，且濃度越高效果越明顯，顯示了劑量依賴效應。

Fig 2 IC50 of bigelovii E on different cancer cells

Fig 3 Inhibitory effects of bigelovii E on proliferation of MCF-7 and HLF-1 cells

*P<0.05，**P<0.01vscontrol

Fig 4 The inhibitory effects of bigelovii E on clongenic potential of MCF-7

2.3BigeloviiE誘導MCF-7細胞凋亡Hoechst 33258染色結果顯示(Fig 5)，bigelovii E 2.5、5、10 mg·L-1處理后，隨著藥物濃度增加，細胞可以觀察到更明亮的熒光和典型的凋亡特征，如細胞生長減少、體積縮小、變形為圓形，而對照組呈圓形或橢圓形的正常形態。將bigelovii E按不同終濃度(2.5、5、10 mg·L-1)處理MCF-7細胞48 h后，Annexin V-PE/7-ADD 雙染結果表明(Fig 6)，與對照組相比，用bigelovii E處理后MCF-7細胞凋亡率明顯增加。Bigelovii E以濃度依賴性方式誘導細胞凋亡。

Fig 7的Western blot結果表明，不同濃度bigelovii E(2.5、5、10 mg·L-1)處理MCF-7細胞48 h后，活化的PARP、caspase-3、caspase-7、caspase-9表達水平明顯增加，進一步證明bigelovii E促進了細胞凋亡。

Fig 5 Effect of bigelovii E on MCF-7 morphological change (×200)

A: Control; B: Bigelovii E 2.5 mg·L-1; C: Bigelovii E 5 mg·L-1; D: Bigelovii E 10 mg·L-1

Fig 6 Effects of bigelovii E on MCF-7 by Annexin V-PE and 7-ADD double staining

A: Control; B: Bigelovii E 2.5 mg·L-1; C: Bigelovii E 5 mg·L-1; D: Bigelovii E 10 mg·L-1

2.4BigeloviiE誘導MCF-7細胞線粒體功能紊亂為了檢測bigelovii E誘導的MCF-7細胞凋亡是否通過線粒體功能介導，通過RH123染色和流式細胞儀分析測定Δψm。Fig 8結果顯示，2.5 mg·L-1bigelovii E處理MCF-7細胞24 h后，線粒體膜電位出現明顯降低。隨著作用濃度升高至5、10 mg·L-1，流式細胞儀檢測到更明顯的去極化峰。這一結果證明，bigelovii E作用細胞后，引起線粒體膜電位下降，導致線粒體功能紊亂，進而激發線粒體凋亡，誘導細胞凋亡。

Fig 7 Effects of bigelovii E on expression of apoptosis perform protein in MCF-7

Fig 8 Effects of bigelovii E on integrity of mitochondrial membrane in MCF-7

A: Control; B: Bigelovii E 2.5 mg·L-1; C: Bigelovii E 5 mg·L-1; D: Bigelovii E 10 mg·L-1

ROS不平衡可能促進線粒體功能障礙，并引發線粒體介導的細胞凋亡。Fig 9結果表明，與對照相比，bigelovii E作用后，細胞內ROS水平增加，而這種增加效應在加入ROS阻斷劑NAC后有所回落。說明bigelovii E可引發細胞內ROS水平增加，使線粒體功能受損。

通過Western blot進一步檢測了 bigelovii E對Bcl-2家族的影響，發現抗凋亡蛋白Bcl-xL和Mcl-1表達明顯降低，而促細胞凋亡蛋白Bax表達明顯增加(Fig 10)。說明bigelovii E可通過調控線粒體凋亡通路相關蛋白，誘導MCF-7細胞凋亡。

2.5BigeloviiE調節mTOR通路蛋白的表達Fig 11的Western blot結果表明，mTOR及其下游靶點p70S6K和4-EBP磷酸化水平均明顯降低，但mTOR蛋白總量并未發生明顯變化。因此推測bigelovii E可通過調控mTOR的磷酸化位點，抑制mTOR活化，進而降低其下游靶點p70S6K和4-EBP磷酸化水平，激活線粒體凋亡通路，最終誘導細胞凋亡。

Fig 9 Effects of bigelovii E on intracellular ROS in MCF-7

Fig 10 Effects of bigelovii E on expression of Bcl-2 protein family in MCF-7

Fig 11 Effects of bigelovii E on expression of mTOR signaling pathway in MCF-7

3 討論

目前，乳腺癌已成為世界范圍內的嚴重公共衛生問題。我國雖是乳腺癌低發國家，但其發病率呈上升趨勢[3]。因此，為了減緩這一趨勢，從天然藥物中尋找新型有效的抗乳腺癌藥物具有重要意義。我們課題組研究發現，bigelovii E作用于MCF-7細胞，可調控線粒體凋亡通路，誘導細胞凋亡，具有良好的抗腫瘤效果。

我們的研究認為mTOR是bigelovii E抑制MCF-7細胞增殖的重要靶點。mTOR信號通路參與細胞凋亡過程，在多種疾病中發揮重要作用[11-12]。Yu等[13]實驗證明，mTOR/p70S6K通路通過調控caspase級聯體系和Bcl-2家族中抗凋亡因子的表達，在細胞凋亡的線粒體損傷途徑中發揮作用。本研究發現，經bigelovii E處理后的MCF-7細胞中，p-mTOR、p-p70S6K和p-4-EBP的表達量與對照組相比均明顯減少，并且具有濃度依賴效應，表明mTOR/p70S6K信號轉導通路在bigelovii E誘導MCF-7細胞凋亡作用中具有重要地位。因此，推測bigelovii E可由mTOR介導的線粒體凋亡途徑，提高細胞凋亡執行蛋白的活化水平，促使細胞凋亡。

隨著線粒體調控細胞凋亡的發現，線粒體誘導腫瘤細胞凋亡成為目前研究的熱點[14-15]。線粒體是多種促細胞凋亡信號轉導分子的靶點，同時也是細胞死亡通路的整合元件，細胞凋亡過程中許多重要事件的發生都與線粒體密切相關。流式細胞術檢測表明，bigelovii E作用細胞后，可明顯降低線粒體膜電位，增大膜通透性，促使ROS釋放，進而影響線粒體功能。同時，Western blot 實驗表明，bigelovii E處理后的MCF-7細胞抗凋亡蛋白Bcl-xl、Mcl-1的表達與對照組相比明顯減少，而促凋亡蛋白Bax的表達明顯增加，且濃度依賴效應明顯。因此，推斷bigelovii E可通過上調Bax表達，下調Mcl-1、Bcl-xl，激發ROS釋放、降低線粒體膜電位，進而導致線粒體功能紊亂，誘導MCF-7細胞凋亡。

本實驗初步研究表明，bigelovii E對人乳腺癌MCF-7細胞有明顯的抗腫瘤活性，可激活mTOR介導的線粒體凋亡通路，進而誘導MCF-7細胞凋亡。但其作用途徑尚有待深入研究，以更全面、系統地闡明bigelovii E對MCF-7增殖抑制的分子機制。

(致謝：本研究是在江蘇省中國科院植物研究所完成，衷心感謝各位老師和同學在實驗過程中的幫助與指導。)

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