M3受體亞型在NSCLC細胞增殖、侵襲和遷移中的作用及機制研究

王士奇, 魏曉莉，閆海濤

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所, 北京 100850)

肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快，對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一[1]。肺癌可分為小細胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，其中非小細胞肺癌約占80%～85%[2]。盡管近年來化療、放療以及手術(shù)治療等常規(guī)療法均有所進展，仍不能有效提高患者的5年生存率。因此，研究其發(fā)病機制尤為重要。

近年來，非神經(jīng)元膽堿能信號通路與腫瘤的關(guān)系受到廣泛關(guān)注。已有研究表明，多種腫瘤細胞均可合成和分泌乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)作為一種生長因子，作用于自身或鄰近細胞上的煙堿型膽堿受體(nicotinic cholinergic receptors，NRs)和毒蕈堿型膽堿受體(muscarinic cholinergic receptors，MRs)，參與細胞的生長增殖、抵抗凋亡、血管發(fā)生、轉(zhuǎn)移侵襲，促進癌癥的進程[3-4]。mAChR屬G蛋白偶聯(lián)受體家族，存在M1～M5五種受體亞型[5]。mAChR的表達和過度激活已在肺癌、結(jié)腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)癌和前列腺癌中報道[6-7]。Song等[8]研究證實，在SCLC細胞外源性給予ACh或卡巴膽堿可引起鈣內(nèi)流增加，此作用可被選擇性M3R拮抗劑4-DAMP、達非那新(Darifenacin)完全阻斷，應(yīng)用M3R拮抗劑或敲減M3R可以引起小細胞肺癌MAPK和Akt磷酸化水平下降，M3R拮抗劑單獨給藥即可抑制SCLC細胞增殖，并降低裸鼠移植瘤MAPK磷酸化水平。而有關(guān)M3R和NSCLC的研究報道并不多，有研究指出，M3R表達可能與NSCLC腫瘤發(fā)展相關(guān)，并且M3R高表達與NSCLC患者不良預(yù)后相關(guān)[9-10]。

本研究擬觀察拮抗M3R對H1299細胞增殖、遷移和侵襲的影響，并探討其可能的作用機制。M3R拮抗劑在臨床上治療慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)已經(jīng)很長時間，具有很好的療效和依從性[11]。如果在體外證實了M3R拮抗劑能夠抑制NSCLC細胞增殖、遷移和侵襲等，將有助于確認M3R是否可作為抗腫瘤靶標，尤其是為未來可能的NSCLC組合化療策略選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細胞與試劑人非小細胞肺癌H1299細胞購自國家實驗細胞資源共享平臺(China Infrastructure of Cell Line Resource)；人非小細胞肺癌H460細胞購自中國科學(xué)院上海細胞庫。RPMI 1640細胞培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自吉泰生物；BCATMProtein Assay試劑盒購自Thermo公司；M3R拮抗劑富馬酸(R,R)-戊乙奎醚(R2-8018)由本所合成；膽堿能受體激動劑卡巴膽堿、M3R拮抗劑達非那新，均購自Sigma公司；星形孢菌素購自MCE公司；抗體均購自Cell Signaling Technology公司；Fluo-4，AM購自美國Life Technologies公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁株式會社化學(xué)研究所；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自康為世紀。

1.2儀器CKX41倒置顯微鏡，日本奧林巴斯公司；GENios Pro多功能酶標儀，澳大利亞Tecan公司；05PR-22冷凍離心機，日本HITACHI公司；MCO-15AC二氧化碳培養(yǎng)箱，日本SANYO公司；Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)，美國LICOR公司。

1.3細胞培養(yǎng)細胞用含10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素和100 μmol·L-1鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1～2 d換液1次，待細胞生長到對數(shù)生長期時，用0.25% 胰酶消化傳代。

1.4CCK-8法檢測細胞存活取對數(shù)生長期的細胞用胰酶消化，制成細胞懸液，調(diào)整細胞密度為3×107·L-1，以每孔100 μL接種于96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)置4個復(fù)孔，每孔細胞數(shù)3 000。將培養(yǎng)板在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。加入等比稀釋的藥物，使其終濃度為：1.25、2.5、5、10、20、40、80 μmol·L-1，并設(shè)置空白組和DMSO對照組(加入培養(yǎng)液和同等稀釋度的DMSO)。藥物作用一段時間后，向每孔加入10 μL的CCK-8，置37℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)1～4 h，用酶標儀測定在波長450 nm的光密度(OD)值，并根據(jù)(OD)值繪制細胞生長曲線。細胞活力/%=[OD(加藥)-OD(空白)]/[OD(對照)-OD(空白)]×100%，抑制率/%=1-細胞活力(%)，每個濃度設(shè)4個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.5siRNA轉(zhuǎn)染M3受體特異性siRNA、陰性對照siRNA由上海吉瑪基因公司設(shè)計并合成。序列分別為：5′-CGAGCCAAACGAACAACAATT-3′和5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′。轉(zhuǎn)染前1 d將細胞接種于6孔板中,每孔細胞數(shù)2×105個，待細胞貼壁，24 h進行轉(zhuǎn)染。實驗分3組：以靶向M3受體的siRNA轉(zhuǎn)染H1299細胞為siRNA干擾組、以轉(zhuǎn)染陰性siRNA的H1299細胞為陰性對照組，空白對照組不作處理。按照脂質(zhì)體LipofectamineTM3000試劑說明書，按每孔siRNA 200 nmol·L-1、脂質(zhì)體7.5 μL，分別將siRNA和脂質(zhì)體加入100 μL Opti-MEMⅠ培養(yǎng)基中混勻，然后將兩液混合，室溫放置10～15 min，然后將混懸液逐滴加入培養(yǎng)板，輕輕混勻，置于培養(yǎng)箱。轉(zhuǎn)染后4～6 h更換新鮮培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染的H1299細胞，其中一部分72 h后Western blot檢測轉(zhuǎn)染效率，另一部分24 h后將細胞消化接種到96孔板繼續(xù)培養(yǎng)，48、72 h后CCK-8法檢測細胞存活。

1.6細胞內(nèi)鈣成像取1支50 μg的Fluo-4,AM溶于45.6 μL DMSO中，使其終濃度為1 mmol·L-1。取45.6 μL的母液溶于22.8 mL HBSS中，配制成2 μmol·L-1的工作液。H1299細胞接種于激光共聚焦小皿中，培養(yǎng)24 h后棄掉激光共聚焦小皿中的細胞培養(yǎng)液，HBSS溶液洗滌細胞3次后，每皿加入2 mL Fluo-4,AM工作液，37℃、5% CO2孵箱中避光負載30 min。棄去Fluo-4,AM工作液，每皿用HBSS溶液洗滌細胞3次，分別加入不同濃度的拮抗劑孵育30 min。用激光共聚焦顯微鏡檢測細胞，激發(fā)波長494 nm，發(fā)射波長516 nm，鏡下選擇合適的細胞后，加入卡巴膽堿刺激細胞，檢測鈣的動態(tài)變化。

1.7劃痕實驗檢測細胞遷移力取對數(shù)生長期H1299細胞，消化接種于背面畫有5條橫線的6孔板，孵育24 h后，用20 μL槍頭在6孔板底垂直于橫線劃痕，PBS沖洗3次，分別加入低血清培養(yǎng)基稀釋的藥物，加藥后0、24 h于倒置顯微鏡下觀察劃痕傷口愈合情況并拍照分析。遷移率/%=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/ 0 h劃痕寬度×100%。

1.8Transwell細胞侵襲實驗檢測細胞侵襲能力50 mg·L-1Matrigel膠稀釋8倍包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃風(fēng)干。每個小室加入50 μL含1% BSA的無血清培養(yǎng)液水化基底膜，37℃、30 min使Matrigel聚合成凝膠。消化細胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1～2遍，重懸細胞，調(diào)整細胞密度至2×108·L-1。取細胞懸液100～200 μL加入Transwell小室，24孔板下室加入500 μL含10% FBS的培養(yǎng)基。每孔分別加入0、20、40 μmol·L-1R2-8018，給藥處理24 h。棄去小室內(nèi)培養(yǎng)液，用棉簽輕輕擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細胞，晾干后，每孔用1 mL 0.1%結(jié)晶紫染色10 min。顯微鏡下拍照觀察。

1.9Westernblot檢測蛋白表達細胞給藥處理后，收集并裂解細胞，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。蛋白變性后取等量(50 μg)上樣于10%的SDS-PAGE ，將電泳分離開的蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素NC膜，5% BSA封閉1 h，加入相關(guān)蛋白的一抗，4℃搖床孵育過夜。次日TBST洗膜3次，加入相應(yīng)種屬二抗孵育1 h，再用TBST洗膜3次后，紅外熒光掃描成像，用Odyssey軟件對條帶進行分析，以目的蛋白/actin條帶的灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量，實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1R2-8018與達非那新抑制H1299細胞和H460細胞的增殖CCK-8法48 h檢測結(jié)果顯示(Fig 1)，R2-8018和達非那新對H1299和H460細胞的增殖具有抑制作用，并且隨M3R拮抗劑濃度的增大，抑制作用也增加，呈劑量依賴性，其中R2-8018抑制H1299細胞的效果最明顯，作用48 h的IC50值為10.6 μmol·L-1。

Fig 1 Effect of M3R antagonists on proliferation of H1299(A) and H460(B) cells(±s, n=4)

Cells were treated with R2-8018 or darifenacin for 48 h. Cells treated with 0.1% DMSO were used as a control, with viability set at 100%.

2.2敲減M3R后對H1299細胞增殖的影響利用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染200 nmol·L-1M3R siRNA, 72 h后Western blot檢測敲減效率，F(xiàn)ig 2結(jié)果顯示，與空白對照組及陰性siRNA組相比，轉(zhuǎn)染siRNA能夠有效敲減M3R；CCK-8法48、72 h檢測結(jié)果顯示，與空白對照組及陰性siRNA組相比，M3R siRNA干擾組H1299細胞增殖明顯被抑制，并且隨siRNA作用時間延長，抑制作用更明顯。

Fig 2 Effect of M3 siRNA transfection on proliferation

A:Down-regulation of M3 was detected by Western blot 72 h after transfection of 200 nmol·L-1M3 siRNA; B: Cells were incubated in the presence of 200 nmol·L-1siRNA for 48 h and 72 h, after that, cell growth viability was determined using the CCK-8 assay.*P<0.05,**P<0.01vsnegative control group.

2.3達非那新拮抗卡巴膽堿引起的H1299細胞鈣信號增強激光共聚焦顯微鏡實時監(jiān)測鈣離子的變化，F(xiàn)ig 3結(jié)果顯示，30 μmol·L-1的卡巴膽堿能夠引起H1299細胞鈣信號增強，而拮抗劑達非那新預(yù)先處理的H1299細胞，加入30 μmol·L-1卡巴膽堿后細胞內(nèi)鈣信號基本無變化，表明達非那新能夠拮抗激動劑卡巴膽堿引起的細胞鈣信號增強，說明鈣內(nèi)流可能是M3R的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)。

Fig3CalciumresponsestocholinergicagonistsandantagonistsinH1299cells

A:Carbachol caused an increase in [Ca2+]iin H1299 cells; B: Darifenacin blocked the carbachol-induced increase in [Ca2+]i, the cells were exposed to 20 μmol·L-1darifenacin for 30 min, followed by 30 μmol·L-1carbachol. C: Representative trace of the [Ca2+]iresponse of H1299 cells to carbachol (30 μmol·L-1) in the presence or absence of darifenacin. This experiment is representative of four others.

2.4PKC抑制劑星形孢菌素抑制H1299細胞的增殖CCK-8法24 h檢測結(jié)果顯示(Fig 4)，0.062 5～2 μmol·L-1星形孢菌素體外對H1299細胞的增殖具有抑制作用，并且隨拮抗劑濃度的增大，抑制作用也增加，呈劑量依賴性。

Fig 4 Effect of staurosporine on proliferation

Cells were treated with staurosporine for 24 h. Cells treated with 0.1% DMSO were used as a control, with viability set at 100%.

2.5M3R拮抗劑下調(diào)H1299細胞PKC-α蛋白水平Western blot檢測結(jié)果顯示(Fig 5)，與對照組相比， 5～20 μmol·L-1R2-8018給藥處理 24 h，PKC-α蛋白表達水平明顯降低。

Fig 5 Effect of R2-8018 on PKC-α expression

Cells were treated with R2-8018 for 24 h.**P<0.01vscontrol group.

Fig 6 Time effect of 20 μmol·L-1 darifenacin on levels of G1 checkpoint upstream regulatory proteins of H1299(A) and H460(B) cells(±s,n=3)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

2.6M3R拮抗劑下調(diào)Akt、GSK3β和cyclinD1蛋白表達水平給予H1299細胞和H460細胞20 μmol·L-1達非那新，觀察其對調(diào)控細胞周期G1檢查點上游蛋白分子的影響。Western blot結(jié)果顯示(Fig 6)，達非那新可時間依賴性下調(diào)Ser473p-Akt、Ser9p-GSK3β和cyclinD1的表達，提示拮抗M3R抑制細胞增殖可能是通過抑制Akt/GSK-3β信號通路，下調(diào)cyclinD1來實現(xiàn)的。

2.7M3R拮抗劑上調(diào)H1299細胞p21蛋白表達水平Western blot結(jié)果顯示(Fig 7)，與對照組相比，20 μmol·L-1R2-8018處理H1299細胞24 h后，p21蛋白表達水平明顯升高。

2.8M3R拮抗劑抑制H1299細胞遷移能力Fig 8劃痕實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，隨著R2-8018濃度升高，H1299細胞的遷移能力明顯下降。提示20 μmol·L-1R2-8018對H1299細胞的遷移能力有明顯的抑制作用。

2.9M3R拮抗劑抑制H1299細胞侵襲能力如Fig 9所示，R2-8018作用H1299細胞24 h后，與對照組相比，隨R2-8018濃度增加，視野范圍內(nèi)附著在小室底膜下室側(cè)的細胞數(shù)量逐漸減少，穿膜細胞數(shù)明顯減少，說明R2-8018明顯抑制H1299細胞的侵襲能力。

2.10M3R拮抗劑下調(diào)H1299細胞MMP-2蛋白表達水平Fig 10 Western blot結(jié)果顯示，5～20 μmol·L-1R2-8018作用H1299細胞24 h后，隨著濃度的增加，H1299細胞的MMP-2蛋白表達水平明顯降低。

Fig 7 Effect of R2-8018 on p21 expression

Cells were treated with R2-8018 for 24 h.**P<0.01vscontrol group.

3 討論

目前，早期肺癌以手術(shù)治療為主，而晚期肺癌以化療為主，然而并不能有效提高患者的5年生存率。近年來靶向藥物興起，雖然酪氨酸酶抑制劑在晚期NSCLC的治療中取得較好進展，但并非所有的NSCLC患者都能獲得生存質(zhì)量的改善[12]。因此，迫切需要發(fā)展新的治療策略。

Fig 8 Migration of H1299 cells after R2-8018 treatment analysed by Wound-healing assay(±s,n=4)

Cells were treated with R2-8018 for 24 h.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

Fig 9 Invasion of H1299 cells after R2-8018 treatment analysed by Transwell invasion assay(±s,n=4)

Cells were treated with R2-8018 for 24 h.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

Fig 10 Effect of R2-8018 on MMP-2 expression

Cells were treated with R2-8018 for 24 h.**P<0.01vscontrol group.

實驗室前期采用本所自主合成的抗膽堿藥R2HBJJ，發(fā)現(xiàn)不同組織類型的腫瘤細胞對R2HBJJ具有不同的敏感性，其中以非小細胞肺癌細胞H1299、H460和H157最為敏感，并且H1299細胞對多種N受體拮抗劑不敏感。放射性配體受體結(jié)合實驗表明，R2HBJJ對M3R選擇性強，表明R2HBJJ抑制腫瘤細胞增殖并非細胞毒作用。本實驗中，單獨應(yīng)用本所自主合成的M3R拮抗劑R2-8018(R2HBJJ同系物)及市售M3R拮抗劑達非那新，能夠抑制H1299和H460細胞的增殖，且具有劑量依賴性。接著采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)敲減M3R，首先觀察敲減效率，發(fā)現(xiàn)siRNA轉(zhuǎn)染72 h后能夠有效降低H1299細胞M3蛋白表達，CCK-8法觀察siRNA轉(zhuǎn)染48、72 h后對H1299細胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)敲減M3R的H1299細胞增殖同樣受到抑制，并且對細胞增殖的抑制作用隨siRNA作用時間延長而更加明顯，這與我們單獨應(yīng)用M3R拮抗劑的結(jié)果是一致的。已知M3R與Gq蛋白偶聯(lián)，激動M3R可激活磷脂酶Cβ(PLCβ)，導(dǎo)致鈣內(nèi)流增加和蛋白激酶C(PKC)激活，進而激活多種與細胞生長過程相關(guān)的受體、蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等。通過細胞內(nèi)鈣成像我們發(fā)現(xiàn)，外源性給予H1299細胞卡巴膽堿可引起鈣內(nèi)流增加，此作用可被M3R拮抗劑達非那新完全阻斷；CCK-8實驗結(jié)果證實PKC抑制劑星形孢菌素對H1299細胞增殖具有明顯抑制作用， 并且M3R拮抗劑劑量依賴性的降低 H1299細胞PKC-α蛋白表達水平，說明拮抗M3R可以通過其G蛋白偶聯(lián)信號發(fā)揮細胞生長抑制作用。

PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與調(diào)節(jié)細胞生長、增殖、分化、遷移、凋亡以及細胞應(yīng)激和惡性轉(zhuǎn)化，是人類癌癥治療的關(guān)鍵靶點，而G蛋白偶聯(lián)受體則是將細胞外信號傳遞至這些激酶通路的主要介質(zhì)之一。一旦被激活，PI3K催化PIP2生成PIP3，PIP3結(jié)合PDK1，促使Akt磷酸化后激活，Akt作用于下游GSK3β，引起GSK3β磷酸化使其失活，減少對cyclinD1的降解，促進細胞周期進行。我們發(fā)現(xiàn)，拮抗M3R能夠時間依賴性下調(diào)Ser473p-Akt和Ser9p-GSK3β。前期研究表明[13]，M3R拮抗劑誘導(dǎo)H1299細胞凋亡發(fā)生率較低，其主要是能夠誘導(dǎo)H1299細胞產(chǎn)生G0/G1期阻滯。細胞周期調(diào)控異常是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中最基礎(chǔ)的機制，常伴隨周期相關(guān)蛋白的異常表達[14]。Western blot顯示，20 μmol·L-1達非那新處理H460，cyclinD1蛋白表達下調(diào)，20 μmol·L-1R2-8018處理H1299，p21蛋白表達水平明顯升高。通過以上結(jié)果我們推測，拮抗M3R抑制細胞增殖可能是通過抑制Akt/GSK3β信號通路，抑制cyclinD1活性，并上調(diào)p21來實現(xiàn)的。

肺癌發(fā)生侵襲性轉(zhuǎn)移是致使患者最終死亡的首要原因。本研究實驗結(jié)果表明，M3R拮抗劑R2-8018作用H1299細胞24 h后，能夠抑制H1299細胞的遷移和侵襲能力。基質(zhì)金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinases，MMPs) 是一組金屬離子高度依賴的蛋白酶，它可通過降解細胞基底膜和細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)中各種蛋白成分，從而促進肺癌向周圍組織浸潤和轉(zhuǎn)移。本研究顯示，5～20 μmol·L-1R2-8018作用H1299細胞24 h后，隨著濃度的增加，H1299細胞的MMP-2表達水平明顯降低。提示M3R可能通過MMP-2促進H1299細胞的遷移和侵襲。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，M3R在NSCLC中表達并過度激活，參與介導(dǎo)了NSCLC的生長增殖、侵襲和遷移等，其作用與機制可能是拮抗M3R，通過抑制Akt信號通路的激活而抑制NSCLC細胞的增殖與遷移，其體內(nèi)抗腫瘤活性有待進一步研究。

(致謝：本文實驗是在軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所軍事毒理與生化藥理實驗室完成，感謝張樹卓、劉曉燕老師以及張康、王華、蘭麗婷、楊蕊等同學(xué)的幫助！)

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