內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路在棕櫚酸誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用

許文虎，金春子，王曉龍，陳 晨，崔 蘭

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院1. 心血管內(nèi)科、2. 中心實(shí)驗(yàn)室，吉林 延吉 133000)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)性疾病屬于危及人類健康的重大疾病之一[1-5]，內(nèi)皮細(xì)胞損傷、凋亡是AS病變形成的始動(dòng)環(huán)節(jié)，脂質(zhì)代謝紊亂是導(dǎo)致AS發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一[6]，降低脂質(zhì)、保護(hù)血管內(nèi)皮是AS性疾病防治的關(guān)鍵步驟。有關(guān)AS發(fā)生機(jī)制的炎癥學(xué)說認(rèn)為，AS是一個(gè)血管受損傷后的慢性炎癥過程，各種炎癥因子在動(dòng)脈中的浸潤和過量表達(dá)可以促進(jìn)AS的發(fā)生、發(fā)展[7]。研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致心肌梗死的AS不穩(wěn)定性斑塊的兩個(gè)主要特征是斑塊中大量的炎癥因子浸潤和豐富的游離膽固醇。大量研究證實(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)可能參與了AS的炎癥反應(yīng)的病理過程，ERS途徑可能是一種廣泛的血管炎癥和內(nèi)皮功能障礙的調(diào)節(jié)因素[8]。可見，ERS與血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷有一定關(guān)聯(lián)，但是ERS與脂毒性血管內(nèi)皮損傷之間的相關(guān)性研究甚少。基于此，本研究擬分析棕櫚酸對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)的ERS信號(hào)通路活性及細(xì)胞凋亡的影響，闡明ERS信號(hào)通路與棕櫚酸所致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的關(guān)聯(lián)，將為脂毒性內(nèi)皮損傷的防治提供指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞系 HUVECs購自上海基免實(shí)業(yè)有限公司。

1.1.2試劑 GRP78、CHOP、PERK、IRE1、ATF6抗體均購自美國Abcam公司；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自BestBio(貝博)公司；CCK-8檢測試劑盒購自碧云天公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶均購自美國Gibco公司；棕櫚酸(palmitic acid，PA)及ERS抑制劑4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid，4-PBA)均購自Sigma公司。

1.1.3儀器 超凈工作臺(tái)(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(杭州利輝環(huán)境檢測設(shè)備有限公司)，熒光顯微鏡及倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，紫外分光光度計(jì)(上海凌析儀器有限公司)，多功能酶標(biāo)儀(上海逍鵬生物科技有限公司)，高速冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司)，電泳槽、電轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad公司)，化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(美國ProteinSimple公司)。

1.2方法

1.2.1游離脂肪酸的配制 用0.1 mol·L-1的NaOH溶液在70℃水浴中溶解一定量的PA，振蕩混勻10 min，過濾，配成100 mmol·L-1的PA儲(chǔ)存液。在55℃水浴中，用去離子水配50 g·L-1的BSA溶液，過濾。將上述PA溶液和BSA溶液按1∶19的體積比混合配成PA/BSA復(fù)合液，在水浴中振蕩10 s，繼續(xù)水浴10 min，取出后冷卻至室溫，過濾。然后，將上述復(fù)合液分別用高糖DMEM培養(yǎng)基稀釋。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) HUVECs在細(xì)胞培養(yǎng)箱(飽和濕度、5% CO2、37℃)中培養(yǎng)至70%～80%融合度，經(jīng)消化、傳代，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用的DMEM培養(yǎng)液包含10 mL·L-1雙抗、2 mmol·L-1的L-谷氨酰胺、10 mmol·L-1的HEPES、10 mmol·L-1的丙酮酸鈉、5 mmol·L-1葡萄糖。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組 ① PA濃度梯度分析實(shí)驗(yàn)：對(duì)照組、PA(0.1、0.2、0.4、0.8 mmol·L-1)組。② PA(0.4 mmol·L-1)時(shí)間梯度分析實(shí)驗(yàn)：對(duì)照組、12 h刺激組、24 h刺激組、48 h刺激組。③ 抑制劑實(shí)驗(yàn)：對(duì)照組、0.4 mmol·L-1PA組、10 mmol·L-14-PBA預(yù)處理2 h后，給予0.4 mmol·L-1PA組。

1.3檢測指標(biāo)

1.3.1CCK-8檢測細(xì)胞增殖率 HUVECs接種于96孔培養(yǎng)板中(每孔1×106個(gè)細(xì)胞)，培養(yǎng)24 h后給藥，進(jìn)行孵育，每孔中加入10 μL CCK-8溶液反應(yīng)2 h，酶標(biāo)儀檢測570 nm處吸光度值。按公式：細(xì)胞增殖抑制率/%=(對(duì)照組吸光度值-給藥組吸光度值)/(對(duì)照組吸光度值-本底)×100%計(jì)算，共重復(fù)3次，每組6個(gè)復(fù)孔。

1.3.2Western blot法檢測ERS信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平 每組血管內(nèi)皮細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜后，用PBS清洗2次，按組別給藥后，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育一定時(shí)間，在4℃用裂解液裂解細(xì)胞30 min后，用細(xì)胞刮將培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞反復(fù)刮至離心管內(nèi)，13 000 r·min-1離心分離15 min，蛋白定量后，取20 μL的蛋白樣品加入SDS-PAGE凝膠樣品槽內(nèi)，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉等過程后，加入GRP78、CHOP、PERK、IRE1、ATF6抗體(均為1∶1 000)，4℃孵育24 h，洗膜，加入二抗室溫反應(yīng)1 h后，用顯影液處理，用化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀分析NADPH信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平。

1.3.3Annexin V-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡 Annexin V被作為檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。凋亡中晚期碘化丙啶(propidium Iodide，PI)能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此，將Annexin V與PI聯(lián)合使用時(shí)，PI 則被排除在活細(xì)胞(Annexin V-/PI-)和早期凋亡細(xì)胞(Annexin V+/PI-)之外，而晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞同時(shí)被FITC和PI結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽性(Annexin V+/PI+)。6孔細(xì)胞培養(yǎng)板接種HUVECs，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長至70%～80%融合度，按組別給藥后，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h，PBS反復(fù)沖洗后，加入500 μL的1×Binding Buffer，加入5 μL的Annexin V-FITC避光室溫孵育15 min，再加入5 μL的PI孵育5 min，PBS反復(fù)沖洗后，采用熒光顯微鏡拍照，并用Image J 1.41 軟件分析綠色熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1棕櫚酸對(duì)HUVECs細(xì)胞增殖的影響Fig 1A結(jié)果表明，0.1、0.2、0.4、0.8 mmol·L-1PA組在PA刺激24 h后，0.4、0.8 mmol·L-1PA組的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖率明顯降低(P<0.05)。Fig 1B結(jié)果表明，0.4 mmol·L-1PA刺激0、12、24、48 h 后，刺激時(shí)間在24～48 h 時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖率明顯降低(P<0.05)。

Fig 1 Influence of PA on cell viability in HUVECs(±s，n=5)

A: Cell viability was significantly suppressed when PA concentration increased to 0.4 mmol·L-1; B: HUVECs were treated with 0.4 mmol·L-1PA for different time, and inhibition of cell viability was calculated from CCK-8 assay.*P<0.05vs0 mmol·L-1group (A);#P<0.05vs0 h group (B).

2.2棕櫚酸對(duì)HUVECs細(xì)胞ERS信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響如Fig 2所示，0.4 mmol·L-1PA刺激0、12、24、48 h 后，刺激時(shí)間在24～48 h，GRP78、CHOP、PERK、IRE1、ATF6等ERS信號(hào)通路蛋白的水平出現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)(P<0.05)；而24、48 h PA刺激組之間的ERS信號(hào)通路蛋白表達(dá)均無顯著性差異(P>0.05)。

Fig 2 Influence of PA(0.4 mmol·L-1)on expression of ERS in cell viability in HUVECs(±s, n=3)

A: Representative images of GRP78, CHOP, PERKphos, IRE1phosand ATF6 expression by Western blot; B: HUVECs were treated with 0.4 mmol·L-1PA for different time, and quantitative analysis of GRP78, CHOP, PERKphos, IRE1phosand ATF6 expression.*P<0.05vs0 h group.

Fig 3 Effects of PA(0.4 mmol·L-1)on apoptosis of HUVECs(scale bars: 50 μm)

Annexin V-FITC is green fluorescence; PI is red fluorescence. Fluorescence images of HUVECs stained with(Annexin V-FITC)/PI after cells were incubated for 0 h (A), 12 h (B), 24 h (C) and 48 h (D) with 0.4 mmol·L-1PA.

Fig 4 Influence of ERS inhibitor 4-PBA on apoptosis of HUVECs exposed to PA(scale bar: 50 μm)

Fluorescence images of HUVECs stained with(Annexin V-FITC)/PI after cells were incubated for 24 h with control (A), 0.4 mmol·L-1PA (B) and 0.4 mmol·L-1PA+10 mmol·L-14-PBA (C).

2.3棕櫚酸對(duì)HUVECs細(xì)胞凋亡的影響如Fig 3所示，0.4 mmol·L-1PA刺激0、12、24、48 h后，24、48 h組的紅色熒光明顯強(qiáng)于0、12 h組，說明刺激24～48 h時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡狀態(tài)，而24、48 h PA刺激組之間的紅色熒光水平無顯著性差異。

2.4阻斷ERS信號(hào)通路對(duì)棕櫚酸刺激下HUVECs細(xì)胞凋亡水平的影響如Fig 4所示，0.4 mmol·L-1PA刺激24 h后，細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡狀態(tài)；而與單純PA(0.4 mmol·L-1)組相比，預(yù)處理內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA組細(xì)胞凋亡明顯減少，與對(duì)照組無顯著性差異。

3 討論

1847年，膽固醇被鑒定為AS斑塊中的關(guān)鍵組成部分，繼而脂質(zhì)浸潤學(xué)說被認(rèn)為是由于血脂升高導(dǎo)致AS的重要學(xué)說。此學(xué)說主張，一般生理狀態(tài)下，血管內(nèi)皮設(shè)有屏障，使脂蛋白顆粒進(jìn)入動(dòng)脈受阻，而在高血脂等病理狀態(tài)下，血管壁局部上沉積膽固醇等脂質(zhì)，從而誘發(fā)平滑肌細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞聚集被細(xì)胞吞噬而出現(xiàn)泡沫細(xì)胞，細(xì)胞間質(zhì)增多，血管內(nèi)膜增厚，最終出現(xiàn)AS。可見，脂質(zhì)浸潤與血管內(nèi)皮損傷有密不可分的關(guān)聯(lián)，因此，本研究建立了棕櫚酸所致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，旨在模擬脂毒性AS體系。本研究結(jié)果顯示，棕櫚酸刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞增殖功能出現(xiàn)明顯降低，此結(jié)果符合文獻(xiàn)報(bào)道。

內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是AS的起始階段，研究表明ERS信號(hào)通路對(duì)AS疾病中內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂起著廣泛的調(diào)節(jié)作用[9]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)屬于真核細(xì)胞較關(guān)鍵的細(xì)胞器，主要發(fā)揮包括合成膽固醇和脂質(zhì)、合成蛋白質(zhì)、調(diào)節(jié)鈣等作用[10-14]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)翻譯合成和細(xì)胞內(nèi)鈣離子存儲(chǔ)場所，新生的蛋白質(zhì)在分子伴侶的協(xié)助下進(jìn)行折疊，只有正確折疊的蛋白質(zhì)可以被轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體，未折疊或者錯(cuò)誤折疊的蛋白仍留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解機(jī)制逆移位至細(xì)胞質(zhì)，并被蛋白酶體降解[15]。近年研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)過度負(fù)荷可打破內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)，這種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂時(shí)出現(xiàn)錯(cuò)誤折疊與未折疊蛋白在腔內(nèi)聚集以及Ca2+平衡紊亂的狀態(tài)被稱為ERS。為了減輕ERS，真核細(xì)胞激活一系列自身保護(hù)機(jī)制，稱為ERS反應(yīng)，即從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向核內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)，而目前，ERS信號(hào)傳導(dǎo)主要涉及3個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜效應(yīng)蛋白：PERK、IRE1和ATF6。正常情況下，這3種蛋白的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)側(cè)都與GRP78/BIP結(jié)合而處于無活性狀態(tài)，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白聚集超過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理能力時(shí)，GRP78/BIP即從這3種蛋白解離，與未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白結(jié)合，以協(xié)助其正確折疊，GRP78/BIP解離時(shí)PERK、IRE1、ATF6三個(gè)反應(yīng)器蛋白出現(xiàn)活化，進(jìn)而觸發(fā)ERS的信號(hào)傳導(dǎo)。如果ERS時(shí)間過長，3個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜效應(yīng)蛋白持續(xù)表達(dá)也會(huì)上調(diào)凋亡相關(guān)的基因，如轉(zhuǎn)錄因子CHOP的表達(dá)，促使細(xì)胞凋亡。本研究提示，棕櫚酸刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞24 h后，ERS信號(hào)通路蛋白GRP78、PERK、IRE1、ATF6、CHOP的表達(dá)明顯升高，說明ERS信號(hào)通路的激活可能與棕櫚酸誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷有密切關(guān)聯(lián)。而另一組研究提示，棕櫚酸刺激24 h時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡水平出現(xiàn)明顯升高，而與單純棕櫚酸組相比，預(yù)處理ERS抑制劑4-PBA組細(xì)胞凋亡明顯減少。此現(xiàn)象說明血管內(nèi)皮細(xì)胞可在棕櫚酸的刺激下出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡，且此損傷與ERS信號(hào)通路的激活密切相關(guān)。

綜上所述，棕櫚酸刺激可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力，激活ERS信號(hào)通路，使細(xì)胞處于應(yīng)激性凋亡狀態(tài)，而此狀態(tài)成功被ERS信號(hào)通路抑制劑所阻斷。此結(jié)果證實(shí)，調(diào)控ERS信號(hào)通路對(duì)棕櫚酸引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的防治有指導(dǎo)意義。

(致謝:本文實(shí)驗(yàn)主要在延邊大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院藥學(xué)分析實(shí)驗(yàn)室、基礎(chǔ)學(xué)院藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室、附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室完成，由湖北科技學(xué)院醫(yī)藥研究院省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室協(xié)助完成。感謝廉麗花副教授、李晶副教授、碩士生馬偉平、金艷紅、權(quán)麗娜等對(duì)本實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)與幫助。)

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