三七超臨界CO2萃取物對谷氨酸損傷PC12細胞的保護作用

段賢春，周 安，彭代銀，鮑金云，夏倫祝

(安徽中醫藥大學1.藥學院；2.第一附屬醫院藥學部，安徽 合肥 230038)

腦缺血是致殘和致死的主要原因之一，其發生概率隨年齡的增長而增加[1]。研究表明，腦缺血缺氧后神經細胞的損傷與谷氨酸(glutamate, Glu) 介導的興奮性毒性密切相關[2-3]。腦缺血缺氧后突觸前膜會過度釋放谷氨酸，突觸間隙堆積的谷氨酸引起Ca2+大量內流，從而導致神經細胞損傷。α-氨基羥甲基異惡唑丙酸(amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid, AMPA)受體上的谷氨酸受體2(glutamate receptors 2,GluR2)亞基可以阻斷Ca2+內流，絕大部分神經元突觸表面的AMPA受體上含有GluR2亞基，對Ca2+的通透性很低[4-5]。研究表明，膜轉運蛋白(protein that interacts with C kinase Ⅰ, PICK1)的PDZ結構域與GluR2 C末端緊密結合可以調節突觸AMPA受體GluR2亞基的表達，進而影響到AMPA受體對Ca2+通透性[6]。

三七為五加科多年生草本植物三七Panaxnotoginseng(BurK.)F. H. Chen的干燥根，收錄于《本草綱目》，具有活血化瘀、消腫止痛的作用[7]。三七總皂苷通過促進腦缺血/再灌注大鼠腦組織血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達來發揮神經保護作用[8]。除皂苷類成分外，課題組前期研究發現，三七超臨界萃取物(supercritical fluid extract, SFE)主要含有人參炔醇、斯巴醇等脂溶性成分。三七中的脂溶性成分如人參炔醇對損傷的神經細胞也有保護作用[9]，但其脂溶性部位對損傷的神經細胞的保護作用機制尚不明確。故本實驗采用谷氨酸損傷PC12細胞為體外缺血性腦損傷模型，研究三七SFE是否可以干擾或阻斷PICK1與GluR2亞基的相互作用，為PICK1成為一個可能的藥靶蛋白提供實驗基礎。

1 材料

1.1藥物與試劑三七超臨界CO2萃取物(實驗室自制)；FSC231抑制劑(純度>96.66%，美國Calbiochem公司，批號2769360)；L-谷氨酸(Sigma公司進口分裝)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；DMEM培養基(美國Hyclone公司)；胰蛋白酶(Gibco進口分裝，武漢生命技術有限公司)；MTT、DMSO(Sigma公司)；LDH試劑盒(南京建成生物工程研究所)；Hoechst 33342染色試劑盒(上海貝博生物公司)；Fluo-3/AM熒光染料(日本株式會社同仁化學研究所)；PICK1抗體、GluR2抗體和β-actin抗體(Abcam公司)

1.2儀器CO2培養箱(MCO-175型，日本Sanyo公司)；倒置顯微鏡(CK2型，日本Olympus公司)；酶標儀(ELX800uv型，美國Bio-Tek公司)；水平離心機(LD4-8型，北京醫用離心機廠)；熒光顯微鏡(BX-60型，日本Olympus公司)；激光共聚焦顯微鏡(IX-81型，日本Olympus公司)；凝膠成像系統(Gel DOC XR型，美國Bio-Rad公司)；純水機(Milli-Q Advantage A10型，美國Millipore公司)。

2 方法

2.1細胞培養PC12細胞培養于含1%青霉素-鏈霉素溶液、10%胎牛血清的DMEM培養液中，置5% CO2培養箱中培養，溫度為37 ℃，隔天換液，3～4 d傳代1次，取處于對數生長期的細胞應用于實驗。

2.2模型的建立取對數生長期的PC12細胞，以2×104個/孔接種于96孔培養板，待細胞完全貼壁后，棄除原培養液，再以含不同濃度(5、10、15、20、25、30 mmol·L-1)谷氨酸的完全培養基繼續培養，正常對照組不加谷氨酸，每組設6個復孔，置5% CO2培養箱、溫度為37 ℃的條件下，分別培養24、48、72 h后，MTT法檢測PC12細胞存活率。實驗重復3次，按公式計算生長抑制率：抑制率(IR)/%=(1-模型組OD值/正常組OD值)×100 %，根據IC50確定最佳造模的時間與濃度。

2.3實驗分組與處理將細胞分為7組：對照組(不加谷氨酸的正常細胞組)、模型組(谷氨酸損傷的細胞組)、三七SFE給藥組(25、50、100 mg·L-1)、PICK1抑制劑組(100 μmol·L-1FSC231)、三七SFE+抑制劑組(100 mg·L-1SFE+100 μmol·L-1FSC231)，藥物預處理1 h后，加谷氨酸共同孵育24 h，應用倒置顯微鏡觀察PC12細胞形態。

2.4MTT法檢測細胞活力取對數生長期的PC12細胞，以2×104個/孔接種于96孔培養板，每孔100 μL。置5% CO2培養箱、溫度為37 ℃的條件下培養過夜后，按實驗要求給予不同方法處理，每組為6個復孔。培養24 h后，每孔加入5 g·L-1的MTT 20 μL，繼續孵育4 h后，棄除上清液，每孔加入DMSO 150 μL，置恒溫振蕩器上振蕩10 min后，酶標儀檢測490 nm處各孔吸光度值。細胞存活率/%=處理組OD值/對照組OD值×100%，重復實驗3次。

2.5LDH活性檢測將“2.3”項各組細胞培養24 h后,分別收集培養上清液20 μL，按照說明書測定各組細胞上清LDH的活力。

2.6Hoechst33342染色檢測細胞損傷“2.3”項各組細胞用PBS液洗3遍，每孔中加入用PBS配置好的Hoechst 33342染料1 mL，室溫避光20 min，用4%多聚甲醛固定5 min，熒光顯微鏡下觀察。

2.7Fluo-3/AM熒光染色法檢測細胞內鈣離子濃度“2.3”項各組細胞用PBS液洗3遍，各組加入濃度為5 μmol·L-1的Fluo-3/AM染色液，置5% CO2培養箱、溫度為37 ℃的條件下，避光孵育30 min。為充分除去殘留的Fluo-3/AM染色液，用PBS液洗3次，然后加入PBS液覆蓋細胞。用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察并拍照。激發波長488 nm，發射波長525 nm，計算機自動分析處理，計算細胞內游離鈣相對含量。

2.8Westernblot檢測PICK1、GluR2蛋白表達同“2.3”項實驗分組與處理方法，以細胞裂解液提取細胞總蛋白，用BCA試劑盒進行蛋白定量。運用5%濃縮膠和10%分離膠進行SDS-PAGE電泳，再將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，以5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，PBST洗滌3次，每次10 min，加入一抗(1 ∶1 000)孵育過夜。次日，PBST洗滌3次，每次10 min，加入標記有HRP的二抗稀釋液(1 ∶10 000)孵育2 h，再以PBST洗滌3次，每次10 min。最后用ECL試劑盒顯影，以凝膠成像系統采集圖片，蛋白表達情況運用AlphaView SA軟件分析。

3 結果

3.1谷氨酸的細胞毒性作用不同濃度(5、10、15、20、25、30 mmol·L-1)谷氨酸分別作用PC12細胞24、48、72 h后，MTT法檢測細胞存活率變化情況。Fig 1結果顯示，濃度在5～30 mmol·L-1范圍內，谷氨酸對PC12細胞的生長具有明顯抑制作用，且呈現一定的量效關系。25 mmol·L-1谷氨酸作用24 h對細胞生長的抑制率接近50%，故選擇該作用時間和濃度為后續實驗的模型。

Fig 1 Effects of glutamate on proliferation of PC12 cells(n=6)

Fig 2 Morphological changes of PC12 cells observed by inverted-microscope(×200)

A:Control group;B:25 mmol·L-1Glu group;C:25 mg·L-1SFE+25 mmol·L-1Glu group;D:50 mg·L-1SFE+25 mmol·L-1Glu group;E:100 mg·L-1SFE+25 mmol·L-1Glu group;F:100 μmol·L-1FSC231+25 mmol·L-1Glu group;G:100 mg·L-1SFE+100 μmol·L-1FSC231+25 mmol·L-1Glu group

3.2細胞形態學觀察倒置顯微鏡下觀察發現，正常PC12細胞大多呈長梭形、多邊形貼壁生長，有類似神經突觸的細胞突起。25 mmol·L-1谷氨酸作用PC12細胞24 h后，細胞變圓，突起減少，貼壁不牢，細胞間隙增大，折光度下降。而三七SFE和FSC231預處理后能減輕谷氨酸對PC12細胞的損傷，與模型組比較，細胞密度明顯增大，細胞突起增多，貼壁細胞增多，折光性增強(Fig 2)。

3.3三七SFE增加谷氨酸損傷PC12細胞的存活率Fig 3的MTT實驗結果顯示，與正常組(98.75±7.02)%比較，單用三七SFE組、單用PICK1抑制劑組的細胞存活率(94.63±4.84)%、(95.46±2.30)%差異均沒有顯著性。25 mmol·L-1谷氨酸作用PC12細胞24 h后，細胞的生長受到明顯抑制，與正常組比較，細胞存活率下降為(50.27±2.87)%(P<0.05)。與模型組相比，三七SFE(25、50、100 mg·L-1)、FSC231、三七SFE+FSC231預處理PC12細胞1 h后能明顯提高PC12細胞存活率，分別為(60.76±1.83)%、 (69.13±2.72)%、 (78.39±5.04)%、(85.89±6.83)%、(86.90±6.07)%(P<0.01)。

3.4三七SFE降低谷氨酸損傷PC12細胞的LDH活性25 mmol·L-1谷氨酸作用PC12細胞24 h后，與正常組LDH活性(131.23±4.42)U·L-1比較，培養基上清液中的LDH活性(522.85±26.67)U· L-1明顯增加(P<0.05)。三七SFE(25、50、100 mg·L-1)、FSC231、三七SFE+FSC231預處理PC12細胞1 h后，與模型組相比，上清液中LDH活性分別為(400.84±20.84)、(246.12±22.86)、(201.26±3.33)、(150.94±21.01)、(143.40±6.66)U·L-1，明顯減少(P<0.01)。不同濃度的三七SFE、FSC231、三七SFE+FSC231能夠減輕谷氨酸導致的神經細胞損傷(Fig 4)。

3.5三七SFE降低谷氨酸損傷PC12細胞的凋亡率Hoechst 33342染色法檢測細胞凋亡情況。Fig5結果顯示，正常組的細胞核呈均勻的藍色熒光，凋亡細胞較少。谷氨酸損傷后部分細胞呈濃染的碎塊狀，并發出高亮度的熒光，與正常組細胞凋亡率(9.78±0.96)%相比，凋亡細胞明顯增多，凋亡率為(64.71±7.47)%(P<0.05)。與模型組相比，三七SFE(25、50、100 mg·L-1)、FSC231、三七SFE+FSC231預處理PC12細胞1 h后，各組細胞核固縮現象減少，凋亡細胞也明顯減少，凋亡率分別為(58.99±3.55)%、(47.76±6.53)%、(38.81±2.05)%、(19.22±3.18)%、(19.78±2.72)%(P<0.01)。不同濃度的三七SFE、FSC231、三七SFE+FSC231均可抑制谷氨酸誘導PC12細胞的凋亡。

Fig 3 Effects of SFE on viability of glutamate injured PC12 cells measured by MTT assay(±s,n=6)

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

Fig 4 Effects of SFE on glutamate injured LDH release in PC12 cells(±s,n=6)

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

Fig5EffectsofSFEonglutamate-inducedapoptosisinPC12cells

A:Apoptosis changes of PC12 cells observed by fluorescence microscopy.a:Control group;b:25 mmol·L-1Glu group;c:25 mg·L-1SFE+25 mmol·L-1Glu group;d:50 mg·L-1SFE+25 mmol·L-1Glu group; e:100 mg·L-1SFE+25 mmol·L-1Glu group; f:100 μmol·L-1FSC231+25 mmol·L-1Glu group; g: 100 mg·L-1SFE+100 μmol·L-1FSC231+25 mmol·L-1Glu group.B:Effects of SFE on glutamate-induced apoptosis in PC12 cells.##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

Fig6EffectsofSFEonglutamate-inducedPC12intracellularCa2+concentration

A:Fluorescence intensity changes of Ca2+of PC12 cells observed by laser confocal microscopy. a: Control group;b:25 mmol·L-1Glu group;c:25 mg·L-1SFE+25 mmol·L-1Glu group; d:50 mg·L-1SFE+25 mmol·L-1Glu group; e:100 mg·L-1SFE+25 mmol·L-1Glu group; f:100 μmol·L-1FSC231+25 mmol·L-1Glu group; g: 100 mg·L-1SFE+100 μmol·L-1FSC231+25 mmol·L-1Glu group. B:Effects of SFE on glutamate-induced PC12 intracellular Ca2+concentration.##P<0.01vscontrol group;*P<0.05，**P<0.01vsmodel group

3.6三七SFE減少谷氨酸損傷PC12細胞內Ca2+濃度25 mmol·L-1谷氨酸作用PC12細胞24 h后，與正常組細胞內Ca2+濃度(99.18±20.48)nmol·L-1比較，細胞內Ca2+濃度(628.02±53.64)nmol·L-1明顯升高(P<0.05)。三七SFE(25、50、100 mg·L-1)、FSC231、三七SFE+FSC231預處理PC12細胞1 h后，與模型組相比，細胞內Ca2+濃度(570.85±19.59)、(423.76±30.27)、(363.08±7.18)、(314.86±23.40)、(303.62±10.42)nmol·L-1，明顯降低(P<0.01)。不同濃度的三七SFE、FSC231、三七SFE+FSC231可以減少谷氨酸誘導PC12細胞外鈣離子的內流(Fig 6)。

3.7三七SFE抑制PICK1和增加GluR2蛋白表達Western blot結果表明，谷氨酸作用于PC12細胞24 h后，與正常組相比，PICK1、GluR2蛋白表達明顯降低(P<0.05)。三七SFE(25、50、100 mg·L-1)、FSC231、三七SFE+FSC231預處理PC12細胞1 h后，與模型組相比，PICK1蛋白表達明顯降低(P<0.01)(Fig 7)，GluR2蛋白表達明顯增多(P<0.01)(Fig 8)，且三七SFE+FSC231組與FSC231抑制劑組PICK1、GluR2兩種蛋白表達無明顯差異。三七SFE可能通過增加GluR2蛋白表達、降低PICK1蛋白表達，抑制谷氨酸損傷PC12細胞的凋亡。

Fig 7 Effect of SFE on expression levels of PICK1 in PC12 cells

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

4 討論

谷氨酸是腦組織中一類重要的興奮性氨基酸，腦缺血缺氧時，突觸前膜釋放大量的谷氨酸并堆積導致鈣超載，繼而對神經細胞產生致命的損傷[10]。AMPA受體上的GluR2亞基可以阻斷Ca2+內流，而膜轉運蛋白PICK1可以影響GluR2亞基的表達。病理狀態下，PICK1蛋白的PDZ結構域與GluR2 C末端緊密結合，導致膜表面GluR2亞基含量降低，引起缺乏GluR2亞基的AMPA受體增多，后者對Ca2+有很高的通透性，引起Ca2+內流，導致神經細胞損傷[11-12]。三七中皂苷類成分對損傷的神經細胞的保護作用已有大量文獻報道，除皂苷類成分外，三七中的脂溶性成分如人參炔醇，對損傷的神經細胞也有保護作用。課題組前期研究發現，三七SFE主要含有人參炔醇、斯巴醇等脂溶性成分，脂溶性成分極性小，可能比水溶性成分更容易透過血腦屏障，但其脂溶性部位對損傷的神經細胞保護作用機制尚不明確。故本實驗以谷氨酸損傷PC12細胞為缺血性腦損傷研究模型，觀察三七SFE對谷氨酸損傷PC12細胞的保護作用并初步探討其可能作用機制。

Fig 8 Effect of SFE on expression levels of GluR2 in PC12 cells

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

本實驗結果表明，單用三七SFE和單用PICK1抑制劑對細胞存活率影響不大，后期檢測指標主要以正常對照組做參照。25 mmol·L-1谷氨酸作用于PC12細胞后,與正常對照組比較，細胞存活率降低、LDH漏出率升高、細胞凋亡率升高、細胞內鈣離子濃度升高、PICK1與GluR2蛋白表達均降低；三七SFE(25、50、100 mg·L-1)、FSC231、三七SFE+FSC231可以提高細胞存活率、降低LDH漏出率、減少細胞凋亡、減少細胞內鈣離子濃度、降低PICK1蛋白表達、增加GluR2蛋白表達，并在三七SFE濃度為25～100 mg·L-1時呈一定的量效關系。此外，三七SFE+FSC231組與FSC231抑制劑組PICK1、GluR2兩種蛋白表達差異無顯著性，表明三七SFE很有可能通過抑制PICK1和GluR2間相互作用來發揮神經保護作用。

本實驗初步從分子水平探討了三七SFE的神經保護作用，其機制可能與抑制PICK1、增加GluR2蛋白表達、減少鈣離子內流有關，但三七SFE對PICK1與GluR2蛋白共表達是否有影響及萃取物中何種成分發揮作用有待于進一步研究。

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