S-腺苷蛋氨酸通過降低Cav-1的表達(dá)保護(hù)KCl刺激引起的神經(jīng)元損傷

楊俊霞，李燕強(qiáng)

(徐州醫(yī)科大學(xué)江蘇省麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇省麻醉與鎮(zhèn)痛應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221004)

S-腺苷蛋氨酸(S-adenosylmethionine，SAM，又稱活性氨基酸)是1952年發(fā)現(xiàn)的廣泛存在于體內(nèi)的一種重要的生理活性物質(zhì)。SAM是依賴甲基轉(zhuǎn)移酶的酶促轉(zhuǎn)甲基過程的甲基供體，修飾DNA、RNA 及組蛋白，進(jìn)而影響DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯、DNA錯(cuò)配修復(fù)，調(diào)節(jié)表觀遺傳[1]。質(zhì)膜微囊結(jié)構(gòu)蛋白-1(caveolin-1，Cav-1)是位于細(xì)胞膜信號(hào)交易活躍的微域—小窩上的主要蛋白，能與多種信號(hào)分子形成復(fù)合物，對(duì)機(jī)體功能的調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用[2-4]。我們前期的研究結(jié)果表明，神經(jīng)病理性疼痛狀態(tài)下，小鼠前扣帶回(anterior cingulate cortex，ACC) Cav-1 會(huì)持續(xù)表達(dá)增加，干擾Cav-1表達(dá)，疼痛減輕[5]。高濃度KCl可使細(xì)胞膜電位升高，細(xì)胞膜上的電壓依賴型鈣離子通道開放，胞內(nèi)鈣離子升高，激活細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路，并調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。KCl刺激可使神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生長時(shí)程增強(qiáng)(long-term-potentiation，LTP)現(xiàn)象，神經(jīng)細(xì)胞在LTP活動(dòng)過程中會(huì)引發(fā)各類基因表達(dá)，并合成諸多蛋白質(zhì)[6-7]。本研究采用KCl刺激原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元模型，檢測(cè)SAM對(duì)KCl刺激引起的細(xì)胞損傷是否有保護(hù)作用，并進(jìn)一步研究SAM是否通過降低Cav-1的表達(dá)，對(duì)KCl刺激引起的細(xì)胞損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物 孕13～15 d小鼠，清潔級(jí)，由徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2試劑 SAM (HPLC>99%,西安康諾化工有限公司)；KCl(上海生工生物科技有限公司)；DMEM 培養(yǎng)基、Neuroasal Medium、B-27 添加劑、胰酶(Life Technology Inc)；胎牛血清(Biochem 公司)；L-多聚賴氨酸、二甲基亞砜(Sigma 公司)；抗p-Cav-1 抗體、抗t-Cav-1 抗體(Bioword公司)；引物由上海吉瑪基因有限公司合成；SYBR Green Master Mix (Invitrogen公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗、山羊抗兔二抗、BCA蛋白測(cè)定試劑盒、ECL發(fā)光試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；其余為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2方法

1.2.1原代小鼠皮層神經(jīng)元培養(yǎng)及各組神經(jīng)元處理 取胎齡為13～15 d 的小鼠，無菌條件下分離出大腦皮層，在D-Hank′s 平衡鹽溶液中漂洗3次，盡量剔除腦膜，剪碎后用終濃度為0.25%胰酶，37℃消化10 min，離心，棄上清，用含15%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基制備成1.0×109·L-1密度的細(xì)胞懸液，接種于預(yù)先用L-多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)板中，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。d 2換成含2% B27的Neurobasal 繼續(xù)培養(yǎng)，隔天換液。培養(yǎng)至d 7[8]，換液，KCl組為終濃度為0.05 mol·L-1KCl 作用12 h，SAM-KCl組為0.02 mol·L-1SAM預(yù)處理6 h后加入KCl(終濃度為0.05 mol·L-1)作用12 h。然后，將各組細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2qPCR分析 將細(xì)胞用預(yù)冷的0.01mol·L-1PBS洗2遍，然后置于冰臺(tái)上，用BBI公司B618133試劑盒提取總RNA，用vazyme試劑盒逆轉(zhuǎn)成cDNA,調(diào)節(jié)每組樣品到濃度一致，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｈ?.5 μL cDNA產(chǎn)物，按10 μL反應(yīng)體系進(jìn)行real-time PCR，各成分加入量：Cav-1或β-actin引物1.0 μL，cDNA 0.5 μL，5×SYBR GREEN 2 μL，DEPC水 6.5 μL。引物Cav-1: Forward 5′-ATTGCAGAACCAGAAGGGACAC-3′, Reverse 5′-CCATTGGGATGCCGAAGAT-3′, 產(chǎn)物121 bp；β-actin: Forward 5′-CATTGTTACCAACTGGGACGACAT-3′, Reverse 5′-GCCTCGGTGAGCAGCACA-3′, 產(chǎn)物102 bp。在95℃預(yù)變性1 min，按94℃ 30 s，59℃ 40 s，72℃ 40 s的參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，40個(gè)循環(huán)。然后記錄Cav-1和β-actin的CT值，二者比值越大說明該樣品含Cav-1拷貝數(shù)越少。CT值即達(dá)到一定熒光強(qiáng)度所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

1.2.3Western blot分析 將培養(yǎng)于6 孔板的各組細(xì)胞用冰冷的PBS洗滌2遍，每孔加入0.6 mL蛋白裂解液，刮取細(xì)胞，收集到1.5 mL EP管，冰上放置30 min，超聲粉碎細(xì)胞，13 000 r·min-1離心10 min，取少量上清液，用BCA法測(cè)蛋白濃度，30 μg總蛋白分裝成1管，-20℃保存。用12% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。經(jīng)3% BSA封閉5～6 h后，加入適當(dāng)稀釋的一抗24 h,漂洗3遍再加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗。用ECL曝光法顯示蛋白質(zhì)條帶。掃描免疫印跡膠片，并以Image J軟件分析條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的水平。

2 結(jié)果

2.1SAM對(duì)各組神經(jīng)元形態(tài)的影響0.05 mol·L-1KCl 作用于體外培養(yǎng)1周的小鼠皮層神經(jīng)元12 h，可使神經(jīng)元產(chǎn)生明顯的損傷，突起縮短變細(xì)，胞體變小，細(xì)胞聚團(tuán)。0.02 mol·L-1SAM預(yù)處理6 h可明顯降低KCl刺激引起的細(xì)胞損傷(Fig 1)。

Fig 1 Effect of SAM on morphological characteristics of primary cultured neurons injured by KCl (×200)

A: Neurons soma in control group were rounded, translucent, neurite extended naturally; B: Neurons soma in KCl group was significantly smaller, wrinkled, neurite shortened; C: The soma and neurite of neurons in SAM-KCl group was obviously better than those in KCl group.

2.2SAM對(duì)各組神經(jīng)元Cav-1mRNA表達(dá)的影響qPCR檢測(cè)SAM對(duì)各組神經(jīng)元Cav-1 mRNA表達(dá)的影響。Fig 2結(jié)果顯示，KCl組Cav-1 mRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯升高(P<0.01),SAM-KCl組Cav-1 mRNA表達(dá)與KCl組相比降低(P<0.05),說明SAM能夠逆轉(zhuǎn)KCl引起的神經(jīng)元Cav-1 mRNA表達(dá)升高。

Fig 2 SAM inhibited increases of Cav-1 mRNA of neurons induced by KCl(±s，n=5)

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsKCl group

2.3SAM對(duì)各組神經(jīng)元Cav-1蛋白表達(dá)的影響免疫印跡檢測(cè)SAM對(duì)各組神經(jīng)元Cav-1蛋白表達(dá)的影響。Fig 3結(jié)果顯示，KCl刺激可使t-Cav-1和p-Cav-1蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，SAM預(yù)處理可抑制KCl刺激引起的t-Cav-1和p-Cav-1蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。

3 討論

Fig 3 SAM reversed up-regulation of Cav-1 protein of KCl-injured neurons(±s，n=5)

A: The representative immunoblotting bands of Cav-1 protein of each group measured by Western blot; B: The quantitative data.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsKCl group

近年來，隨著對(duì)SAM 在體內(nèi)代謝過程認(rèn)識(shí)的深入和大量臨床研究，SAM維護(hù)神經(jīng)健康的作用越來越受到重視。有研究發(fā)現(xiàn)，SAM的抗抑郁效果與三環(huán)類抗抑郁藥相當(dāng)，在單獨(dú)使用或與其他抗抑郁藥物合用時(shí)，可提高其他抗抑郁藥的治療效果[9]。特別是對(duì)5-羥色胺再攝取抑制劑類抗抑郁藥的藥效有增強(qiáng)效應(yīng)。也有研究發(fā)現(xiàn)，SAM的抗抑郁效果還與葉酸含量有關(guān)，SAM 可與葉酸偶聯(lián)，共同參與中樞神經(jīng)遞質(zhì)( 如乙酰膽堿[10]) 的合成，SAM作為甲基供體參與腦組織和細(xì)胞的生理活動(dòng)，影響各種神經(jīng)遞質(zhì)的合成和代謝。SAM能夠提高阿爾茨海默病模型TgCRND8小鼠腦中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase,GST)活性，增加還原型谷胱甘肽含量[11]。因此，SAM對(duì)維護(hù)人體健康至關(guān)重要。體內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的存活有賴于“電活動(dòng)”或神經(jīng)營養(yǎng)因子的“營養(yǎng)”作用，同樣，體外原代培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞維持存活也必須依賴于類似的“營養(yǎng)”作用。現(xiàn)已證明，大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)KCl刺激誘導(dǎo)表現(xiàn)出LTP，KCl可使細(xì)胞膜電位升高，當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞的膜電位上升到一定值時(shí)，細(xì)胞膜上的電壓依賴型鈣離子通道開放，引起細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路的激活。比如細(xì)胞受KCl刺激后引起膜的去極化，細(xì)胞外鈣內(nèi)流，激活鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶(calcium/calmodulin-dependent protein kinase, CAMK)及Ras/MAPK途徑，通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)磷酸化環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)，激活腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)KCl刺激誘導(dǎo)表現(xiàn)出LTP，作為神經(jīng)細(xì)胞活動(dòng)最具特征性的表現(xiàn)方式，會(huì)引發(fā)各類基因表達(dá)并合成諸多蛋白質(zhì)，從而使得神經(jīng)細(xì)胞體現(xiàn)出不同的生物學(xué)功能[6-7,12]。Cav-1是質(zhì)膜微囊結(jié)構(gòu)蛋白的一種，是細(xì)胞質(zhì)膜表面小窩的標(biāo)記蛋白。Cav-1作為支架蛋白與多種信號(hào)分子組成信號(hào)分子復(fù)合物，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞增殖等活動(dòng)。研究表明，Cav-1在神經(jīng)元突觸的生長發(fā)育、多種生理和病理生理的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中是必需的，Cav-1可募集谷氨酸受體和多種神經(jīng)營養(yǎng)因子受體在膜上的錨定，增強(qiáng)神經(jīng)元信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[13-14]。神經(jīng)病理性疼痛狀態(tài)下，小鼠ACC區(qū)Cav-1會(huì)持續(xù)表達(dá)增加[5]，那么在高濃度KCl刺激神經(jīng)元時(shí)，Cav-1的表達(dá)是怎樣的呢？

本研究首先從細(xì)胞形態(tài)上證實(shí)了SAM對(duì)高濃度KCl刺激引起的神經(jīng)元胞體皺縮、突起變細(xì)變短有明顯的改善作用。收集KCl刺激體外培養(yǎng)1周的小鼠皮層神經(jīng)元12 h的總RNA和蛋白，qPCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Cav-1 mRNA和蛋白表達(dá)均升高。Cav-1具體是參與了KCl刺激細(xì)胞引起的膜去極化過程、或是鈣內(nèi)流、還是LTP形成有待進(jìn)一步研究。SAM預(yù)處理神經(jīng)元6 h組，再用KCl刺激神經(jīng)元，不能引起Cav-1 mRNA和蛋白表達(dá)增高。說明SAM可抑制高濃度KCl引起的Cav-1表達(dá)增高，從而使神經(jīng)元免受高濃度KCl引起的損傷。至于SAM是怎樣調(diào)節(jié)高濃度KCl引起的Cav-1表達(dá)增高的，是通過甲基化Cav-1基因，還是通過某個(gè)信號(hào)通路的激活，有待進(jìn)一步研究。

本研究證實(shí)了高濃度KCl刺激體外培養(yǎng)的小鼠皮層神經(jīng)元，可使其Cav-1 mRNA和蛋白表達(dá)增高，SAM可抑制這種增高并起到保護(hù)神經(jīng)元的作用。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在徐州醫(yī)科大學(xué)麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)&麻醉與鎮(zhèn)痛應(yīng)用技術(shù)實(shí)驗(yàn)室完成，感謝實(shí)驗(yàn)室主任曹君利教授以及段雯珍、蔡衡、高甜慧老師在實(shí)驗(yàn)中給予的幫助。)

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