基于1H-NMR護肝片抗大鼠急性肝損傷的代謝組學研究

龔夢鵑， 巫圣乾，岳 賀，王淑美，梁生旺，鄒忠杰

(1.廣東藥科大學中藥學院， 2. 國家中醫藥管理局中藥數字化質量評價技術重點研究室， 3.廣東高校中藥質量工程技術研究中心，廣東 廣州 510006)

代謝組學是上世紀90年代中期發展起來的一門新興學科，它是通過考察生物體系受刺激或干擾后(如將某個特定的基因變異或環境變化后)其代謝產物的變化或其隨時間的變化，來研究生物體系的代謝途徑的一種技術[2]。代謝組學技術為中醫藥的整體評價和研究提供了可能，已廣泛用于中藥及其復方的研究[3-4]。

本文采用1H-NMR技術分析CCl4急性肝損傷模型大鼠、正常大鼠、護肝片給藥組大鼠的尿液和糞便成分譜變化，結合模式識別方法分類，尋找并解釋標記物歸屬，聯系機體代謝通路和代謝網絡，闡述CCl4致大鼠急性肝損傷的尿液和糞便代謝輪廓變化及護肝片對相關代謝通路和潛在生物標志物的干預作用，為護肝片的保肝作用機制提供參考。

1 材料

1.1動物Sprague-Dawley(SD)大鼠，♂，體質量180～200 g，購自廣州中醫藥大學實驗動物中心，SPF級，合格證號SCXK(粵)2013-0034。飼養環境光照每天12 h，溫度(22±2)℃，濕度 45%～55% 。

1.2藥物與試劑護肝片(黑龍江葵花藥業股份有限公司，批號：201609128)；四氯化碳(分析純，天津市大茂化學試劑廠，批號：20170102)； 丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase, ALT)、堿性磷酸酯酶(alkaline phosphatase, ALP)、天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase, AST)和乳酸脫氫酶 (lactate dehydrogenase, LDH)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號分別為：20170412、20170331、20170411和20170408)；磷酸鹽緩沖液(PBS，美國Sigma公司，批號：K40104)；氘水(D2O，美國Sigma公司，批號：1001484275)。

1.3儀器Bruker AVANCE III 500 MHz 全數字化超導核磁共振譜儀(瑞士 Bruker公司)；AMS18全自動生化儀(北京奧普森公司)；1-14型低溫離心機(德國Sigma公司)。

2 方法

2.1分組與給藥參考文獻方法[1]，將36只♂ SD大鼠適應性喂養3 d后，隨機分成正常組、模型組和護肝片組。護肝片組灌胃護肝片混懸液(0.5% CMC-Na溶解)，劑量為1.7 g·kg-1，正常組和模型組灌胃給予等體積的溶劑，每天1次，連續9 d。末次給藥后1 h，模型組及護肝片組大鼠腹腔注射50% CCl4花生油溶液1 mL·kg-1，正常組腹腔注射等體積的花生油溶液。每組一半動物用于測量血清生化指標水平，另一半動物用于尿液和糞便代謝組學分析。

2.3尿液采集及預處理參考文獻方法[5]，腹腔注射CCl4后，大鼠放入代謝籠中收集24 h尿液。尿液收集時，代謝籠集尿器置于冰上，加入0.5 mL 2% NaN3溶液做防腐劑。400 μL尿液中加入200 μL磷酸緩沖液(0.2 mol·L-1Na2HPO4-0.2 mol·L-1NaH2PO4, pH 7.4)，靜置20 min后離心(4 000 r·min-1, 15 min, 4℃)，取上清液500 μL加至5 mm NMR測試管中，再加入50 μL D2O(含有0.05% W/V TSP-d4)，振蕩混勻，待測。

在城市軌道交通系統中，不僅列車消耗電能，而且由于接觸網和導軌有電阻的存在，同樣會消耗能量[9]。尤其在線路運行高峰期，由于負荷較大，供電電流較大，則線損亦比較大。因此，多列車運行的能耗目標要綜合考慮線路的損耗和列車的能量消耗。以所有牽引變電所發出的能量總額為目標，設全線牽引變電所的編號為P=[P1,P2，P3,…，Pi,…,PN]，Pi站的電壓和電流分別為UPi和IPi，對應的能耗為EPi，則列車全天的能耗量為：

2.4糞便提取及預處理參考文獻方法[6]，100 mg糞便加入800 μL磷酸緩沖液(0.2 mol·L-1Na2HPO4-0.2 mol·L-1NaH2PO4, pH 7.4)和200 μL D2O(含有0.05% W/V TSP-d4)勻漿，勻漿液室溫超聲提取30 min后離心(12 000 r·min-1，10 min，4℃)，取上清液550 μL加至5 mm NMR測試管中，待測。

2.51H-NMR測定實驗溫度為298K，尿液和糞便樣本均采用預飽和的1D NOESY脈沖序列壓制水峰。尿液樣本弛豫延遲時間3 s，采集時間3.28 s。糞便樣本弛豫延遲時間2 s，采樣時間1.64 s。尿液和糞便樣本譜寬10 kHz，采樣點數64 K，采集次數128次。

2.61H-NMR圖譜處理及多變量數據分析采用線寬為0.3 Hz的指數窗函數進行傅立葉變換。運用軟件MestReNova 6.1(西班牙Mestrelab Research公司)對所獲譜圖進行手動相位和基線校正后，參照TSP(δ 0.0)對1H-NMR譜的化學位移進行定標。在δ 0.5～9.5區域按δ0.01等間隔分段積分，然后將所得數據轉換成ASCⅡ文件輸出到Excel 2010中進行下一步處理。對于尿液和糞便樣本，分別將區域δ 4.49～5.98和δ 4.70～5.15設為0積分段，在進行多變量數據分析之前對各分段積分值進行歸一化處理，所得數據乘以10 000后導入SIMCA-P 12.0 (Umetrics AB, Ume?/Malm?, Sweden)，經Pareto標度化預處理后，進行正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)。

3 結果

3.1護肝片對CCl4致急性肝損傷大鼠血清ALT、AST、ALP、LDH水平的影響與正常組比較，模型組大鼠血清中AST、ALT、ALP、LDH水平均明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，護肝片組大鼠血清中AST、ALT、ALP、LDH水平均明顯降低(P<0.05)，表明護肝片能明顯回調CCl4致急性肝損傷大鼠血清中升高的AST、ALT、ALP、LDH水平，提示護肝片能有效預防急性肝損傷(Tab 1)。

3.2尿液和糞便代謝輪廓分析大鼠尿液和糞便的1H-NMR譜圖如Fig 1、2所示。代謝物譜峰的歸屬主要依據化學位移值、峰的裂分情況、偶合常數及參考文獻報道[7-8]。

Fig 1 1H-NMR spectra of rat urine

A:Control group; B: Model group; C: Hugan Tablets group

Fig 2 1H-NMR spectra of rat feces

A:Control group;B:Model group;C:Hugan Tablets group

3.3OPLS-DA分析結果如Fig 3A、3B所示，正常組和模型組的尿液和糞便樣本點在PC1維可以完全區分開，說明CCl4誘導急性肝損傷后大鼠機體生理及物質代謝狀況發生了明顯的改變。本研究采用7倍交叉驗證法對OPLS-DA模型的可靠性進行驗證，得到了OPLS-DA 模型的主要參數，尿液：R2X(cum)=0.86，R2Y(cum)=0.99，Q2(cum)=0.89；糞便：R2X(cum)=0.84，R2Y(cum)=0.97，Q2(cum)=0.84。從上述參數可以看出本研究建立的模型具有較高的可靠性。

Tab 1 Effect of HGT on level of ALT, AST, ALP and LDH in serum of rats with CCl4-induced acute hepatic injury(±s, n=6)

*P<0.05,**P<0.01vsmodel

Fig 3 OPLS-DA score plots derived from 1H-NMR spectra of rat urine(A, C) and feces(B, D)

▲: Control group; ●: Model group; ◆: Hugan Tablets group

3.4與CCl4致急性肝損傷相關潛在生物標志物的鑒定本研究使用OPLS-DA模型中變量重要性投影(variable importance in the projection，VIP)和獨立樣本t檢驗來評價內源性代謝物相對峰面積在正常組和模型組間的差異。只有同時滿足VIP>1和P<0.05的代謝物才被認為是潛在的生物標志物。按照上述原則，最終在大鼠尿液和糞便中分別篩選得到7種和3種與急性肝損傷相關生物標志物(Tab 2、3)。

3.5護肝片對CCl4致急性肝損傷大鼠尿液和糞便代謝指紋譜和相關標志物的干預作用護肝片組樣本點與模型組樣本點可以完全分離，且與正常組樣本點接近，表明護肝片能有效干預急性肝損傷(Fig 3C、3D)。同時，護肝片能分別使急性肝損傷大鼠尿液和糞便中5種和3種潛在生物標志物明顯回調(Tab 2、3)。從上述結果可以看出，護肝片對CCl4致急性肝損傷大鼠尿液和糞便代謝紊亂能產生有效的干預作用。

Tab 2 Potential biomarkers related to CCl4-induced acute hepatic injury in rat urine(±s,n=6)

s, singlet; d, doublet; t, triplet; m, multiplet.*P<0.05vsmodel group

Tab 3 Potential biomarkers related to CCl4-induced acute hepatic injury in rat feces(±s,n=6)

s, singlet; d, doublet; t, triplet; q, quartet, m, multiplet.*P<0.05vsmodel group

4 討論

CCl4是經典的化學性肝毒劑，腹腔注射致大鼠肝損傷模型重現性好，既可以造成肝細胞實質性損傷，又可以引起肝功能異常。自由基的形成及引發的鏈式過氧化反應是CCl4所致肝損傷主要機制[9]，肝細胞受到自由基攻擊，細胞膜通透性升高，導致細胞內酶釋放，引起血清酶升高。

本實驗通過CCl4誘導復制了SD大鼠急性肝損傷模型，AST、ALT、ALP、LDH存在于肝細胞中，當血清中上述指標升高時提示肝臟損傷。模型組較正常組大鼠血清中AST、ALT、ALP、LDH 水平升高，而護肝片降酶保肝能力明顯。

與前期報道相一致[10]，本研究通過尿液代謝組學研究發現，CCl4可引起機體三羧酸循環(tricarboxylic acid cycle，TCA)紊亂。TCA是需氧生物體內普遍存在的代謝途徑，α-酮戊二酸(2-oxoglutarate)和檸檬酸(Citrate)是三羧酸循環的重要中間產物。在三羧酸循環第一步反應中，檸檬酸合成酶(citrate synthase，CSY)可催化乙酰輔酶A的乙基與草酰乙酸的酮基結合生成檸檬酰輔酶A，以便后續高能硫酸鍵水解，釋放出輔酶A，得到檸檬酸。而異檸檬酸轉變成α-酮戊二酸時需要異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)的參與。上述反應均為不可逆反應，CSY與IDH均為反應中的限速酶[10]。在CCl4致大鼠急性肝損傷的情況下，α-酮戊二酸和檸檬酸水平明顯降低，表明CCl4肝損傷引起三羧酸循環被破壞，這可能與大鼠接觸CCl4后抑制CSY與IDH活性有關。而給予護肝片可以使α-酮戊二酸和檸檬酸水平明顯升高，說明護肝片可調節三羧酸循環，其機制可能與提高CSY與IDH活性有關。

此外，馬尿酸(hippurate)是由甘氨酸和苯甲酸在肝臟中結合生成，而苯甲酸主要是由腸道微生物代謝膳食中的芳香酸或多酚生成。腸道厭氧菌代謝苯丙胺生成苯乙酸，在肝臟中苯乙酸與甘氨酸結合生成苯乙酰甘氨酸(phenylacetylglycine)。膽堿在腸道菌群的作用下生成三甲胺，進而被肝臟黃素單加氧酶代謝成氧化三甲胺(trimethylamine N-oxide)[11]。因此，模型組大鼠尿液中馬尿酸水平降低，氧化三甲胺和苯乙酰甘氨酸水平升高，表明大鼠體內腸道菌群平衡被破壞。而護肝片能提高馬尿酸水平和降低氧化三甲胺水平，說明其能通過調節腸道菌群代謝產生保肝作用。

糞便提取液中的代謝物作為腸道菌群和宿主共代謝的產物，不僅可以反映機體內腸道菌群的狀態，而且具有豐富的代謝物信息，同時在共棲菌與宿主之間起著紐帶作用。不易消化的碳水化合物是結腸微生物重要的能量來源，菌種如多形擬桿菌及卵形擬桿菌所含的糖苷酶和裂解酶基因是人的2倍多，它們能利用幾乎所有的植物及宿主的聚糖(如黏蛋白相關的糖蛋白)，腸道微生物發酵產生的短鏈脂肪酸中丁酸(butyrate)最為重要，其在結腸上皮細胞中常作為細胞代謝的能量底物[12]。CCl4肝損傷模型大鼠糞便中葡萄糖(glucose)和丁酸水平降低，說明CCl4可能引起了腸道菌群結構與組成的變化，護肝片能逆轉葡萄糖和丁酸的變化，表明護肝片可減輕腸道菌群紊亂。

綜上所述，本研究采用1H-NMR檢測灌服護肝片的CCl4急性肝損傷大鼠的尿液和糞便中內源性代謝物變化，對護肝片在體內的作用機制進行了初步探討。護肝片能調節機體三羧酸循環和腸道菌群代謝，達到干預CCl4致急性肝損傷時代謝組學變化的作用，進而改善肝功能，減輕肝損傷。

(致謝：本文實驗在廣東藥科大學實驗中心、國家中醫藥管理局中藥數字化質量評價技術重點研究室、廣東高校中藥質量工程技術研究中心完成，特別感謝實驗中心吳霞老師的幫助。)

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