麥冬皂苷B通過Myt/Cdc2信號通路抑制H460細胞有絲分裂

胡 澄，蔣日磊，郭園園，張 旭，陳美娟

(南京中醫藥大學醫學與生命科學學院，江蘇省中醫藥防治腫瘤協同創新中心，江蘇 南京 210023)

非小細胞肺癌 ( non-small cell lung cancer, NSCLC) 是全世界范圍內肺癌致死的主要原因，也是肺惡性腫瘤的主要病理類型。NSCLC 的臨床和實驗腫瘤學研究盡管已取得了較大進展，但其預后仍不理想[1]。細胞周期是保證細胞正常生命活動的基本過程，通過細胞周期時相的有序變遷，細胞進入增殖、分化、衰老和死亡等生理狀態。通過對腫瘤細胞周期進行調控可以有效抑制腫瘤細胞周期進展及其增殖能力。

麥冬皂苷B(ophiopogonin-B, OP-B)對NSCLC細胞株有廣譜性的增殖抑制作用，前期研究表明OP-B可明顯阻滯H460細胞的細胞周期在G0/G1期[2]，但導致細胞周期阻滯的相關原因并不清楚。本研究中，我們通過免疫組化及細胞核染色觀察OP-B對H460細胞有絲分裂的影響，通過對調控細胞周期的相關蛋白信號通路進行Western blot檢測，試圖發現導致周期阻滯及有絲分裂受限的主要原因，為OP-B的藥理學作用機制研究進一步提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 NSCLC細胞株NCI-H460購自中國科學院上海生命科學院生物化學與細胞生物學研究所。

1.1.2試劑 麥冬皂苷-B購自南京澤朗醫藥科技有限公司 (ZL20110412B)，用二甲亞砜(DMSO)配成10 mmol·L-1的貯備液備用，細胞中使用時DMSO的最終濃度小于0.01%。胎牛血清及DMEM培養液購自Gibco公司；胰酶、牛血清白蛋白(BSA)、凝膠配制試劑盒、十字孢堿，均購自碧云天生物技術研究所； cyclinD1、cyclinD3、cyclinA2、cyclinE2、cyclinB1、CDK2、CDK4、CDK6、Myt1、p-Cdc2(Tyr15)、p-histone H3(Ser10)、p15、p21、p27、β-actin一抗及羊抗兔、羊抗鼠二抗、DAPI，均購自Cell Signaling公司；TUNEL 檢測試劑盒 (美國Roche B.M)。

1.2方法

1.2.1細胞培養及給藥處理 將H460細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養液中，置37℃、5% CO2培養箱中培養，實驗時取對數生長期細胞，胰酶消化，接種于6孔板。培養過夜后，分別給予0、5、10μmol·L-1的OP-B作用24 h，同時給予1μmol·L-1的十字孢堿作對照處理組，用作細胞核形態觀察。

1.2.2TUNEL免疫組化 將細胞以 2×108·L-1的密度接種到6孔板中進行細胞爬片，待細胞貼壁后給藥處理。將爬片細胞在4%多聚甲醛中室溫固定25 min； PBS浸洗2次；0.2%的Triton X-100透化細胞5 min；PBS浸洗2次；新鮮配制的3% H2O2室溫處理細胞5 min； PBS浸洗2次；玻片干后，加50 μL TUNEL 反應混合液(TdT與dUTP按1∶9混合)于細胞上，陰性對照組僅加50 μL dUTP液，避光濕盒37℃反應60 min；PBS浸洗3次；玻片干后，加50 μL converter-POD 于細胞上，避光濕盒37℃反應30 min；PBS浸洗3次；加100 μL DAB顯色劑，室溫反應10 min；PBS浸洗3次；蘇木精復染數秒，立即用自來水沖洗；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。每張切片在高倍鏡下(×200和 ×400)隨機選取5個不重疊的視野進行拍照。

1.2.3DAPI染色 H460細胞提前1 d接種于6孔細胞培養板，次日進行OP-B給藥(10μmol·L-1)24 h，棄去細胞培養基，用PBS洗滌細胞2次，4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS 洗細胞3次，加入DAPI(1 mg·L-1)室溫避光染色5 min，PBS洗滌細胞之后，于熒光倒置顯微鏡(徠卡DM18)下觀察并拍照(×200)。

1.2.4Western blot檢測細胞內相關蛋白變化 取對數生長期細胞消化接種到6孔板中，細胞密度為5×108·L-1。藥物處理一定時間后，收集細胞并用PBS洗滌2 次，每孔加入細胞裂解液200 μL，12 000 r·min-1離心20 min，收集蛋白并定量。取一定量的蛋白，加入5×電泳上樣緩沖液，沸水浴變性5 min，經12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉移至NC膜，5%脫脂奶粉封閉后，加入一抗4℃孵育過夜、二抗室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min，滴加 ECL發光液，置于Bio-Rad凝膠成像儀中曝光，并采集圖像。

2 結果

2.1OP-B對H460細胞核物質及形態的影響如Fig 1所示，與對照組相比，細胞經過10 μmol·L-1的OP-B給藥后，表現為細胞結構松散，胞質空泡化嚴重，細胞核邊緣化，但和十字孢堿處理組相比，并未出現細胞核嚴重固縮的明顯細胞凋亡現象。

2.2DAPI染色觀察細胞有絲分裂Fig 2的DAPI核染色結果表明，對照組細胞核在分布和形態上較均勻，且其中明顯觀察到處于有絲分裂狀態的細胞核(箭頭所示)，十字孢堿處理組細胞則明顯出現核固縮的凋亡特征，而10 μmol·L-1OP-B給藥組則既沒有有絲分裂現象，也沒有凋亡的細胞核形態。

2.3OP-B對H460細胞周期及有絲分裂調控蛋白表達水平的影響Fig 3結果表明，5、10μmol·L-1的OP-B明顯抑制cyclinD1的表達，在10μmol·L-1濃度下對CDK4、cyclinB1也有明顯抑制，對CyclinD3、CyclinA2、CyclinE2、CDK2、CDK6無顯著影響。另外，OP-B還明顯誘導Myt表達升高，繼而導致其下游Cdc2磷酸化水平明顯上調，Cdc2的磷酸化導致其活性被抑制，是導致細胞有絲分裂停止的主要原因。同時，我們檢測了histoneH3在Ser10位點的磷酸化水平，其和細胞有絲分裂水平直接相關，結果發現在5、10μmol·L-1的OP-B作用下，p-histoneH3均被明顯抑制，表明有絲分裂的停止；在細胞周期抑制性蛋白的表達上，觀察到OP-B上調p21的表達，而對p15、p27無明顯的調控作用。

3 討論

Fig 1 Observation of OP-B on nuclear morphology and nuclear matter in H460 cells by TUNEL immunohistochemical assay

Fig 2 Observation of OP-B on cell mitosis and apoptosis in H460 cells by DAPI staining

Fig 3 Western blot detection of effects of OP-B on cell cycle and mitosis regulated proteins in H460 cells

OP-B是一種對NSCLC具有多靶點作用的麥冬皂苷類單體化合物[3]。前期研究中我們發現，OP-B能誘導H460細胞周期阻滯在G0/G1期，但相關的分子機制尚不清楚[2]。在此基礎上，本研究進一步通過TUNEL免疫組化及DAPI核染色進行H460細胞核物質及核形態的觀察，發現OP-B并不能誘導細胞凋亡，而是有抑制細胞有絲分裂的跡象。

眾所周知，細胞周期分為4個時相，即G1期(DNA 及蛋白質合成準備期)、S 期(DNA 合成期)、G2期(有絲分裂準備期)、M期(有絲分裂期)。在G1/S與G2/M兩個過渡期各有1個檢查點，分別制止G1期受損DNA進入S期進行復制和G2期受損DNA進入M期進行有絲分裂，從而中止細胞周期。

細胞周期蛋白(cyclin)是細胞周期調控的變速器，細胞周期依賴性蛋白激酶(cyclin-dependent kinase, CDK) 是細胞周期調控的發動機，只有二者有機結合成cyclin/CDK復合物，并且作用于不同底物，才能對細胞分裂、細胞周期運行等過程進行調控[4]。CyclinD1是調控細胞周期G1期的關鍵蛋白，其結合并激活G1期特有的周期蛋白依賴性激酶CDK4，繼而G1期周期抑制蛋白(Rb)發生磷酸化，并從E2F轉錄因子上解離，使E2F轉錄因子起始轉錄激活細胞周期的基因，從而推動細胞周期由G1時期進入到S時期[5]。CyclinE主要在G1晚期發揮作用[6-7]。CyclinE-CDK2為細胞從G1進入S期的關鍵激酶復合物[8-10]。CyclinE與CDK2結合后, 磷酸化其底物蛋白, 如視網膜母細胞瘤蛋白(pRb)、pRb家族成員p107、CDC6、定位于AT位點的核蛋白 p220(NPAT)等, 使DNA合成得以進行, 細胞由G1期進入S期。另外，有絲分裂調控的焦點是MPF，它由調節亞基cyclinB1和催化亞基CDK1組成，其活性調節在有絲分裂起始、中后期轉換以及有絲分裂退出調控中起重要作用。MPF活性主要受其催化亞基CDK1磷酸化/去磷酸化的調控以及其調節亞基cyclin B1的合成、亞細胞定位以及降解的調控。在G1期，cyclinB1蛋白水平極低；在S、G2期，其表達水平逐漸升高，并與CDK1形成MPF酶復合物，此時MPF主要定位于中心體，其催化亞基CDK1被Wee1、Myt1磷酸化而處于失活狀態[11]；在G2晚期，cyclinB1蛋白水平達到峰值，同時其N端發生磷酸化，促使MPF快速轉移入核，在CDC25C的作用下，CDK1去磷酸化，其活性抑制被解除，從而導致MPF被活化[12]。活化的MPF磷酸化有絲分裂相關蛋白，如核纖層蛋白、組蛋白、微管蛋白等，導致核膜崩解、染色體凝集、有絲分裂微管形成，從而促使細胞進入有絲分裂期[13-14]。

細胞周期的調控蛋白還有CKIs，其通過競爭性地抑制cyclin或cyclin/CDK復合物，導致cyclin生物學功能喪失，從而對細胞生長起負調控作用。目前發現的CKI分為Ink4 (inhibitor of CDK4)和Kip (kinase inhibition protein)兩大家族。Ink4包括P16ink4a、P15ink4b、P18ink4c和P19ink4d，特異性抑制CDK4/cyclinD1、CDK6/cyclinD1復合物；Kip包括P21cip1(cyclin inhibition protein 1)、P27kip1(kinase inhibition protein 1)和P57kip2等，能抑制大多數 CDK 的激酶活性。

通過對細胞周期和有絲分裂調控蛋白進行蛋白免疫印跡檢測發現，G0/G1期周期調控蛋白cyclinD1、cyclinE2、CDK4、cyclinB1的表達均被OP-B明顯抑制。另外，p-histoneH3(Ser10)水平代表著細胞的有絲分裂水平，我們觀察到OP-B給藥后明顯抑制了p-histoneH3(Ser10)水平，表明細胞有絲分裂的停滯，而導致細胞有絲分裂被阻止的直接原因就是OP-B明顯上調了Myt的表達水平及Cdc2的磷酸化水平，OP-B調控Myt /Cdc2信號通路的相關機制將有待進一步探討。

[1] Verdecchia A, Francisci S, Brenner H, et al. Recent cancer survival in Europe: a 2000-02 period analysis of EUROCARE-4 data [J].LancetOncol, 2007,8(9):784-96.

[2] Chen M, Du Y, Qui M, et al. Ophiopogonin B-induced autophagy in non-small cell lung cancer cells via inhibition of the PI3K/Akt signaling pathway [J].OncolRep, 2013,29(2) : 430-6.

[3] 陳美娟, 趙若琳, 郭園園, 等. 麥冬皂苷B對A549細胞株體外黏附、侵襲及遷移的抑制作用及機制研究[J]. 中國藥理學通報, 2015,31(5):660-4.

[3] Chen M J, Zhao R L, Guo Y Y, et al. Inhibitory effect of ophiopogonin-B on adhesion，invasion and migration of A549 cells in vitro [J].ChinPharmacolBull, 2015,31(5):660-4.

[4] Evan G I, Vouaden K H. Proliferation, cell cycle and apoptosis in cancer [J].Nature, 2001,411(6835):342-8.

[5] Coqueret O. Linking cyclins to transcription control [J].Gene, 2002,299(1-2):35-55.

[6] Ohtsubo M, Theodoras A M, Schumacher J, et al. Human cyclin E,a nuclear protein essential for the G1to S phase transition [J].MolCellBiol, 1995,15(5):2612-24.

[7] Krude T, Jackman M, Pines J, et al. Cyclin/cdk- dependent initiation of DNA replication in a human cell-free system [J].Cell,1997,88(1):109-19.

[9] Pagano M, Pepperkok R, Lukas J, et al. Regulation of the cell cycle by the cdk2 protein kinase in cultured human fibroblasts [J].JCellBiol, 1993,121(1):101-11.

[10] Tetsu O, McCormick F. Proliferation of cancer cells despite CDK2 inhibition [J].CancerCell,2003,3(3):233-45.

[11] Morgan D O. Principles of CDK regulation[J].Nature, 1995,374(6518):131-4.

[12] Boutros R, Dozier C, Ducommun B. The when and wheres of CDC 25 phosphatases[J].CurrOpinCellBiol,2006,18(2):185-91.

[13] Nigg E A. Mitotic kinases as regulators of cell division and its check-points [J].NatRevMolCellBiol,2001,2(1):21-32.

[14] Pines J. Mitosis: a matter of getting rid of the right protein at the right time [J].TCellBiol, 2006,16(1):55-63.