殼聚糖絮凝澄清工藝與醇沉工藝對黨參水提液的影響

彭穎+雷昌+唐穎楠+周莉莉+夏新華

摘要：目的 探索殼聚糖絮凝澄清工藝與醇沉工藝對黨參水提液中主要化學成分的影響。方法 以黨參炔苷含量、浸膏得率及HPLC指紋圖譜各組分的相對表觀含量作為評價指標，考察殼聚糖絮凝澄清工藝與醇沉工藝2種純化工藝對黨參水提液的影響。結果 殼聚糖絮凝澄清工藝處理的黨參水提液其浸膏得率明顯高于醇沉工藝，且對極性較強組分的保留效果顯著優于醇沉工藝；醇沉工藝對黨參炔苷保留量稍高于殼聚糖絮凝澄清工藝，且對極性較弱組分的保留效果較好。結論 上述2種工藝對黨參水提液中主要化學成分的影響存在一定的規律，可為黨參及其他中藥水提液純化工藝的合理選擇提供參考。

關鍵詞：黨參；純化工藝；黨參炔苷；指紋圖譜；相對表觀含量

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.12.020

中圖分類號：R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）12-0081-04

Effects of Chitosan Flocculation Clarification Process and Alcohol Precipitation Process on Water Extract of Codonopsis Radix PENG Ying， LEI Chang， TANG Ying-nan， ZHOU Li-li， XIA Xin-hua （School of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China）

Abstract： Objective To explore the effects of chitosan flocculation clarification process and alcohol precipitation process on the principal chemical constituents of water extract of Codonopsis Radix. Methods The influence of two purification processes on water extract of Codonopsis Radix was investigated through lobetyolin contents， extract yield， and relative apparent content of each component in HPLC fingerprint as evaluation indexes. Results Chitosan flocculation clarification process showed a significantly higher extract yield of water extract compared with alcohol precipitation process， and it has a markedly better retention effect for strong polarity constituents； alcohol precipitation process exhibit a little better retention effect for lobetyolin and a better retention effect for weak polarity constituents. Conclusion The above two processes have some regularity in the influence on the main chemical constituents in the water extract of Codonopsis Radix， which can provide some guidance for the reasonable choice of the purification process for water extracts of Codonopsis Radix， and other TCM water extracts.

Key words： Codonopsis Radix； purification process； lobetyolin； fingerprints； relative apparent content

中藥制劑生產常需要采用適合的方法對中藥水提液進行純化處理，以達到去粗取精、提高療效、減少用藥量等目的。近年來，有關中藥水提液純化的研究頗多，發展較快，尤其是醇沉工藝與吸附澄清工藝[1]。醇沉工藝的應用較早，技術相對成熟，在工業化生產中使用最為廣泛。該工藝對中藥水提液中的多糖、淀粉、蛋白質具有良好的沉淀效果，大大推進了中藥湯劑向口服液等現代劑型的轉變。但也存在醇耗成本高、工藝流程長、藥液損失大、溶劑殘留大、成品穩定性差等諸多弊端[2-5]。因此，目前許多醫藥工作者正致力于尋求更高效經濟的替代方法[6-7]。殼聚

基金項目：國家自然科學基金（30973955）

通訊作者：夏新華，E-mail：xiaxinhua001@163.com

糖是吸附澄清工藝的常用澄清劑之一，殼聚糖絮凝澄清工藝在沉淀體系中大顆粒物質時對多糖的保留效果較好，同時可利用天然高分子膠體的保護作用，極大提高體系的澄明度和穩定性[8-9]，因此，較醇沉工藝而言，具有成本低、沉淀速度快、沉淀效果好且儲存穩定等諸多優點，顯示出良好的應用前景。

本試驗以黨參為研究對象，比較醇沉工藝與殼聚糖絮凝澄清工藝對黨參水提液中黨參炔苷保留率和浸膏得率的影響，同時結合HPLC指紋圖譜，考察二者對黨參水提液化學成分的影響規律，為黨參水提液純化工藝的優選提供依據，也可為中藥水提液純化工藝的合理選擇提供一定指導。endprint

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀，二元泵，手動進樣器，UV檢測器，色譜工作站（Agilent公司），KQ-600型超聲波清洗器（昆山市淀山湖檢測儀器廠），800型離心沉淀器（長沙市科偉儀器廠），CP114電子天平（上海奧豪斯儀器有限公司），DF101-S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市英峪予華儀器廠），DZF-6050型真空干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）。

黨參炔苷對照品（批號111732-200904，中國食品藥品檢定研究院），黨參飲片（批號20110707007，湖南三片葉植物開發有限公司），殼聚糖（批號F20091203，國藥集團化學試劑有限公司），乙腈為色譜純，乙醇、冰醋酸為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 黨參水提液的制備

稱取黨參飲片600 g，第1次加12倍量水煎煮2 h，第2次加8倍量水煎煮1 h，過濾，合并2次提取液，65 ℃減壓濃縮至2000 mL，離心后取上清液，備用。

2.2 黨參水提液的純化處理

2.2.1 醇沉工藝處理 取上述黨參水提液900 mL（相當于原藥材300 g），等分成3份，分別濃縮至相對密度約為1.15、1.20、1.25（60 ℃），每份再等分為3份，邊攪拌邊緩緩加入95%乙醇使藥液含醇量分別達50%、60%、70%，充分攪拌混合后靜置24 h使沉降充分，過濾，除去沉淀物，收集濾液，備用。

2.2.2 殼聚糖絮凝澄清工藝處理 取上述黨參水提液900 mL（相當于原藥材300 g），等分成3份，分別調節藥液的濃度（原藥材量與藥液體積之比）為1∶2、1∶4、1∶6，每份再等分3份，于水浴加熱至70 ℃，分別將適量（0.4、0.8、1.2 mL/g）的1%殼聚糖溶液邊攪拌邊緩緩加入，充分攪拌混合后靜置24 h使絮凝充分，過濾，除去絮凝物，收集濾液，備用。

2.3 浸膏得率測定

分別取上述醇沉工藝與殼聚糖絮凝澄清工藝處理的樣品溶液，真空濃縮，并于65 ℃真空干燥至恒重，計算浸膏得率。

2.4 黨參炔苷含量測定

2.4.1 色譜條件 色譜柱為Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 ?m），流動相為乙腈-水（20∶80），檢測波長268 nm，進樣量10 ?L，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃。理論板數按黨參炔苷峰計算應不低于3000。

2.4.2 對照品溶液的制備 精密稱取黨參炔苷對照品適量，用甲醇溶解并定容至50 mL，即得濃度為0.301 0 mg/mL的黨參炔苷對照品貯備液，于冰箱中冷藏備用。

2.4.3 供試品溶液的制備 取“2.3”項下黨參干浸膏約1.5～2.0 g置于錐形瓶中，加甲醇10 mL，精密稱定，超聲處理（功率 240 W，頻率45 kHz）30 min后放冷，再次稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾并收集續濾液。從中取5 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，0.45 ?m微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.4.4 方法學考察 按上述HPLC色譜條件，對黨參水提液中黨參炔苷進行含量測定的方法學考察，包括線性關系、精密度、穩定性、重復性及加樣回收率試驗。結果顯示：黨參炔苷在0.3～3.0 ?g范圍內具有良好的線性關系，回歸方程為Y=1513.0X+25.817（r2=0.999 4），精密度、穩定性及重復性試驗的RSD分別為3.08%、3.24%、1.51%，加樣回收率試驗黨參炔苷的平均回收率與RSD分別為100.1%、2.88%，表明采用該法測定黨參水提液中黨參炔苷含量穩定可靠，重復性好。

2.4.5 樣品含量測定 稱取2種純化后的黨參干浸膏樣品適量，按上述方法測定，計算黨參炔苷含量。

2.5 2種工藝測定結果比較

經醇沉工藝處理后的9份樣品中黨參炔苷含量和浸膏得率平均值分別為295 ?g/g原藥材和29.72%；經殼聚糖絮凝澄清工藝處理后的樣品中黨參炔苷含量和浸膏得率平均值分別為285 ?g/g原藥材和37.08%。可見，經殼聚糖絮凝澄清工藝處理的黨參水提液其浸膏得率明顯高于醇沉工藝。結果見表1、表2。

對正交試驗浸膏得率數據進行方差齊性檢驗，P=0.174，表明2組數據方差齊；再作雙側t檢驗，P=9.67×10-5，表明浸膏得率的2組數據有極顯著差異。對正交試驗黨參炔苷含量數據進行方差齊性檢驗，P=0.188，表明2組數據方差齊，再作雙側t檢驗，P=0.167，表明2組數據無顯著差異。但從黨參炔苷含量平均值可以看出，醇沉工藝對黨參炔苷的保留率略高于殼聚糖絮凝澄清工藝。

2.6 2種工藝對黨參化學成分的影響比較

2.6.1 色譜條件 色譜柱為Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 ?m），流動相為乙腈-0.1%醋酸水溶液，檢測波長為268 nm，進樣量為10 ?L，柱溫：30 ℃。梯度洗脫程序見表5。

2.6.2 2種工藝樣品HPLC指紋圖譜比較 分別取上述醇沉工藝與殼聚糖絮凝澄清工藝純化后的黨參干浸膏樣品適量，制備供試品溶液，按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，得到黨參水提液經2種純化工藝處理所得樣品的HPLC指紋圖譜共有模式圖（見圖1），其主要色譜峰基本一致，表明2種純化樣品所含化學成分基本相同。但2種純化工藝對樣品中化學成分含量的影響大小卻難以從HPLC指紋圖譜中直觀看出。

2.6.3 2種工藝樣品HPLC指紋圖中各組分相對表觀含量比較 以黨參炔苷色譜峰（7號峰）作參比，根據黨參炔苷對照品溶液的濃度及峰面積積分值，計算黨參水提液2種純化工藝樣品HPLC指紋圖譜中各色譜峰（各組分）的表觀含量，再按照以下公式求出兩2種純化工藝樣品各色譜峰組分的相對表觀含量[11]。以峰號為橫坐標，平均相對表觀含量為縱坐標，繪制樣品中各組分平均相對表觀含量的折線圖（見圖2）。endprint

C_rj^i=（C_aj^i）/（（C_a1^i+C_a2^i）/2）×100%

式中： 為相對表觀含量，指樣品j（j=1，2）中組分i的表觀含量相對于兩樣品的組分i表觀含量之和的平均值的比值。

由圖2分析可知，2種工藝對黨參水提液中在HPLC色譜柱中保留時間較短的極性大的組分（1～3號峰）的保留效果差別較大（殼聚糖絮凝澄清工藝顯著高于醇沉工藝），對保留時間居中的中等極性組分（4～6號峰）的保留效果幾無差別，對保留時間較長的極性小的組分（7～8號峰）的保留效果存在一定影響（醇沉工藝稍高于殼聚糖絮凝澄清工藝）。

3 討論

比較而言，醇沉工藝對黨參水提液中黨參炔苷的保留率稍高于殼聚糖絮凝澄清工藝，這可能與黨參炔苷的極性相對偏低，在乙醇中有更好的溶解性相關。但在浸膏得率方面，殼聚糖絮凝澄清工藝明顯優于醇沉工藝，這可能與殼聚糖絮凝澄清工藝對糖類的保留效果較好有關[9-10]。

HPLC指紋譜中各組分相對表觀含量數據分析表明，2種純化工藝對黨參水提液中各化學成分的影響存在一定規律性：殼聚糖絮凝澄清工藝對水提液中極性大的組分保留效果優于醇沉工藝，對于中等極性組分的保留效果與醇沉工藝相差不大，而對極性小的組分保留效果則差于醇沉工藝。這與本課題組前期研究結果基本一致[11-13]。黨參多糖與皂苷類成分是黨參中的主要藥理活性成分，根據本研究結果可以推測，與醇沉工藝比較，殼聚糖絮凝澄清工藝可提高黨參水提藥液中極性較大組分（如黨參多糖與皂苷類成分）的保留效果，從而有助于保存藥性，值得進一步研究。

為便于依據HPLC指紋圖譜對2種純化工藝樣品各組分的含量進行更直觀的分析比較，本文引入了組分“表觀含量”和“相對表觀含量”的概念。組分的“表觀含量”指根據HPLC色譜圖中某組分的峰面積積分值，采用已知的參比物（如黨參炔苷）為對照所計算的某組分的含量值，它并非組分的真實含量，但可表征其含量大小。“相對表觀含量”是指待比較的2種樣品中，某樣品中某組分的表觀含量相對于兩樣品中同一組分的表觀含量之和的平均值的比值。若樣品中某組分的相對表觀含量>100%，則表明該組分的含量高于另一相比較的樣品，反之則低于另一樣品。將兩樣品各組分的相對表觀含量數據在同一坐標系中進行繪圖（如折線圖），較HPLC色譜圖更能清晰直觀地顯示出二者各組分含量的差異，從而有利于比較2種工藝對中藥水提液中主要化成分的影響規律。

中藥水提液的主要特點是成分復雜、雜質較多、有效成分含量低，因而選擇合理的純化工藝對中藥水提液進行前處理是中藥制劑生產中尤為關鍵的一環。殼聚糖絮凝澄清工藝近年受到廣泛關注，是一種被認為有望推廣的新型中藥水提液純化方法。但由于其發展時間相對較短，研究相對較少，因此有待進一步深入研究，以促進其在中藥生產中的實際應用。

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（收稿日期：2017-05-10）

（修回日期：2017-06-12；編輯：陳靜）endprint