高效液相色譜法測定金振口服液中6種成分含量

楊智慧 ，程 誠 ，姚 青

（1.江蘇省連云港市藥品檢驗所，江蘇 連云港 222006； 2.江蘇康緣藥業股份有限公司，江蘇 連云港 222001）

高效液相色譜法測定金振口服液中6種成分含量

楊智慧1，程 誠1，姚 青2

（1.江蘇省連云港市藥品檢驗所，江蘇 連云港 222006； 2.江蘇康緣藥業股份有限公司，江蘇 連云港 222001）

目的 建立測定金振口服液中黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、甘草酸、大黃素和大黃酚6種成分含量的高效液相色譜法。方法 色譜柱為Phenomenex C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 m），流動相為甲醇（A） －0.05% 磷酸溶液(B)，梯度洗脫，流速為 1.0 mL ／min，柱溫為 30 ℃，波長切換時間序列采樣（黃芩苷 0 ～15.0 min、280 nm，蘆薈大黃素、大黃酸 15.0 ～35.0 min、254 nm，甘草酸 35.0 ～39.8 min、237 nm，大黃素、大黃酚 39.8～50.0 min、254 nm）。結果 黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、甘草酸、大黃素和大黃酚進樣量分別在 0.043 2～2.162 5 g，0.012 8 ～0.638 0 g，0.018 5 ～0.926 0 g，0.035 8 ～1.792 5 g，0.049 8 ～2.488 0 g，0.052 9 ～2.643 5 g 范圍內與峰面積線性關系良好，平均加樣回收率 分別為 98.84% ，99.49% ，99.89% ，100.31% ，99.55% ，99.54% ， RSD 分別為 1.10% ，1.03% ，1.49% ，1.23%，0.98%，1.19%（n＝9）。結論 該方法簡單快捷，準確可靠，可用于金振口服液的質量控制。

高效液相色譜法；金振口服液；黃芩苷；蘆薈大黃素；大黃酸；甘草酸；大黃素；大黃酚

金振口服液收載于2015年版《中國藥典(一部)》，由山羊角、平貝母、大黃、黃芩、青礞石、石膏、人工牛黃、甘草8味中藥組方，具有清熱解毒、祛痰止咳的功效[1]，主要用于小兒急性支氣管炎的治療。方中大黃含有多種蒽醌類化合物，具有瀉下攻積、清熱瀉火的功效，主要成分為大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸等，用于實熱積滯等癥[2－6]；黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，主要成分為黃芩苷，用于濕溫、暑濕等癥[7－9]；甘草具有補脾益氣、祛痰止咳的功效，主要成分為甘草酸、甘草苷，用于脾胃虛弱、倦怠乏力等癥[10－11]。現行標準僅對黃芩中的黃芩苷以高效液相色譜（HPLC）法進行了含量控制?；谥兴幘哂卸嘟M分、多靶點、協同作用的特點[12－14]，本研究中以黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、甘草酸、大黃素和大黃酚作為指標成分，采用HPLC法，通過波長切換法實現同時測定6種成分的含量，簡單快捷，準確可靠，為該藥品質量控制提供參考?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀，包括G－1311C型高壓四元泵，G－1329B型自動進樣器，G－1316A型柱溫箱，G1315D型二極管陣列檢測器（DAD）及 EZChrom Elite3.3.2.1037 色 譜 工 作 站 （ 美 國 Agilent公 司 ）；BP211D型電子天平（德國Sartorius公司）；SK250HP型超聲儀（上海利導超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

黃芩苷對照品（批號為 110715－201318，純度為93.3%），蘆薈大黃素對照品（批號為 110795－201007，純度為 98.0%），大黃酸對照品（批號為 110757－200206），甘草酸銨對照品（批號為 110731－200615），大黃素對照品（批號為110756－200110），大黃酚對照品（批號為 110796－201319，純度為 99.6%），均購自中國食品藥品檢定研究院；金振口服液（江蘇康緣藥業股份有限公司，批號分別為 160721，160906，161108）；水為高純水；磷酸（分析純，北京化工廠，批號為160512）；甲醇(色譜純，批號為160201)由Fisher Scientific提供；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A） －0.05% 磷酸溶液（B）梯度洗脫（0～12 min，48%A；12～15 min，48%A→65%A；15～40 min，65%A；40～45 min，65%A→48%A；45～50 min，48%A）；流速：1.0 mL ／min；檢測波長：280 nm （0 ～ 15.0min，黃芩苷），254 nm （15.0 ～ 35.0 min，蘆薈大黃素、大黃酸），237 nm（35.0 ～ 39.8 min，甘草酸），254 nm （39.8 ～50.0 min，大黃素、大黃酚）；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：取各對照品適量，精密稱定，加甲醇制成黃芩苷 432.5 μg ／mL，蘆薈大黃素 127.6 μg ／mL，大黃素 185.2 μg ／mL，甘草酸 358.5 μg ／mL，大黃素497.6 μg ／mL，大黃酸 528.7 μg ／mL 的混合對照品貯備液，4℃貯存，備用。精密吸取上述貯備液5 mL置50 mL窬量瓶中，加甲醇稀釋，定容，搖勻，即得混合對照品溶液。

供試品溶液：取樣品（批號為161108）5支的內容物，混勻，精密量取10 mL，精密加入甲醇－鹽酸（10∶1）混合液 90 mL，稱定質量，超聲（250 W，50 kHz）提取60 min，放冷，再稱定質量，用甲醇 － 鹽酸（10 ∶1）混合液補足減失質量，搖勻，濾過，取續濾液，作為供試品溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：按處方比例分別稱取除大黃、除黃芩和除甘草以外的其余中藥材，按金振口服液的制備工藝分別制備缺大黃、缺黃芩和缺甘草的陰性樣品，并按供試品溶液的制備及測定方法進行處理和測定。結果陰性樣品溶液色譜中，在與供試品溶液色譜中黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、甘草酸、大黃素和大黃酚相應保留時間位置上未見色譜峰，說明其他藥材對測定無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關系考察：取混合對照品貯備液 5，2，1，0.5，0.2，0.1 mL，分別置 10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制得6個質量濃度的系列混合對照品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。以對照品的進樣量（X）為橫坐標、峰面積值（Y）為縱坐標，進行線性回歸，結果見表1。

表1 線性關系、定量限和檢測限考察結果（n＝6）

檢測限和定量限考察：將黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、甘草酸、大黃素和大黃酚的混合對照品溶液逐級稀釋后進樣分析，當信噪比(S／N)為10時，計算各成分定量限（LOQ），S／N為3時測定各成分檢測限（LOD）。結果見表1。

精密度試驗：精密量取同一混合對照品溶液10 μL，重復進樣6次，分別測定其峰面積。結果黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、甘草酸、大黃素和大黃酚含量的 RSD分別為 1.36% ，0.98% ，1.28% ，1.15% ，0.96% ，1.19%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取樣品（批號為160721），按供試品溶液制備方法制備溶液，室溫放置，分別于 0，1，3，5，8，12 h時進樣10 μL，測定峰面積。結果黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、甘草酸、大黃素和大黃酚含量的 RSD分別為1.16% ，0.98%，1.13% ，1.40%，1.33% ，1.08%（n ＝6），表明供試品溶液在12 h內穩定。

重復性試驗：精密量取同一批（批號為160721）樣品，依法制備供試品溶液6份，測定含量。結果黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、甘草酸、大黃素和大黃酚的平均含量分別為 0.397 5，0.126 2，0.185 8，0.397 6，0.499 8，0.587 0 g／L， RSD 分 別 為 1.07% ，1.05% ，1.12% ，0.99%，1.15%（n ＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密量取已知含量的樣品（批號為160906）內容物 5 mL，共 9份，每3份1組，分別精密加入上述混合對照品貯備液3 mL和甲醇－鹽酸（10∶1）混合液92 mL，混合對照品貯備液5 mL和甲醇－鹽酸（10∶1）混合液90 mL，混合對照品貯備液8 mL和甲醇－鹽酸（10∶1）混合液87 mL，按擬訂色譜條件進行測定，按外標法計算加樣回收率。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n＝9）

2.4 樣品含量測定

依法對3批樣品中的黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、甘草酸、大黃素和大黃酚含量進行測定。結果見表3。

表3 3批樣品含量測定結果（g／L）

3 討論

3.1 提取條件選擇

[8]，比較了加熱回流法、冷浸提取法和超聲提取法3種方法，分別以甲醇、70%甲醇溶液、甲醇－鹽酸（10∶1）混合液和甲醇 － 鹽酸（10∶1）混合液為提取溶劑，分別提取 30，45，60，80 min，結果表明，甲醇 － 鹽酸（10∶1）混合液超聲提取60 min后黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、甘草酸、大黃素和大黃酚的提取效率最高。

3.2 流動相選擇

有機相曾比較甲醇和乙腈，結果在相同梯度條件下使用甲醇作有機相，目標化合物能獲得更好的分離效果。水相比較了0.1%磷酸溶液和0.05%磷酸溶液，結果表明，使用0.05%磷酸溶液作水相，目標化合物各色譜峰出峰時間適宜且分離度和峰形均明顯優于0.1%磷酸溶液。

3.3 檢測波長選擇

根據黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、甘草酸、大黃素和大黃酚紫外吸收掃描結果，為進一步提高測定的靈敏度和準確性，本研究中采用了檢測波長切換技術，選擇在黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、甘草酸、大黃素和大黃酚的最大吸收波長處進行檢測，即280 nm（0～15.0 min，黃芩苷），254 nm（15.0 ～35.0 min，蘆薈大黃素、大黃酸），237 nm（35.0 ～39.8 min，甘草酸），254 nm（39.8 ～50.0 min，大黃素、大黃酚）。

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Simultaneous Determination of 6 Components in Jinzhen Oral Solution by HPLC

Yang Zhihui1,Cheng Cheng1,Yao Qing2
(1.Lianyungang Institute for Drug Control,Lianyungang,Jiangsu,China 222006; 2.Jiangsu Kangyuan Pharmaceutical Company Limtied,Lianyungang,Jiangsu,China 222001)

Objective To establish an HPLC method for simultaneous determination of baicalin,aloeemodin,rhein,glycirrizic acid,emodin and chrysophanol in Jinzhen Oral Solution.Methods The chromatographic column was Phenomenex C18column(250 mm × 4.6 mm,5 μm),the mobile phase was methanol(A)－ 0.05% phosphoric acid solution (B)with gradient elution,the flow rate was 1.0 mL ／min,the column temperature was 30 ℃ ,the detection wavelength was 280 nm for baicalin(0－15.0 min),254 nm for aloeemodin and rhein(15.0 － 35.0 min),237 nm for glycirrizic acid(35.0 － 39.8 min),254 nm for emodin and chrysophanol(39.8 － 50.0 min).Results The linear range of baicalin,aloeemodin,rhein,glycirrizic acid,emodin and chrysophanol were 0.043 2 －2.162 5 μg,0.012 8 － 0.638 0 μg,0.018 5 － 0.926 0 μg,0.035 8 － 1.792 5 μg,0.049 8 － 2.488 0 μg,0.052 9 － 2.643 5 μg,respectively.The average recovery rates were 98.84%,99.49%,99.89%,100.31%,99.55%,99.54%,respectively,theRSDs were 1.10%,1.03%,1.49%,1.23%,0.98%,1.19%(n ＝ 9).Conclusion This method is simple and fast,which can be used for quality control of Jinzhen Oral Solution.

HPLC;Jinzhen Oral Solution;baicalin;aloeemodin;rhein;glycirrizic acid;emodin;chrysophanol

R284.1；R286

A

1006－4931(2017)23－0022－04

10.3969 ／j.issn.1006 － 4931.2017.23.007

楊智慧，女，大學本科，研究方向為藥物分析，（電話）0518－85836780（電子信箱）814120942＠qq.com。

2017－07－10；

2017－08－31)