糖尿病腎病大鼠鐵超載對內(nèi)皮功能及氧化應(yīng)激的影響

韓立坤 李明舉 毛 宇 張?zhí)熨Y

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000)

糖尿病腎病大鼠鐵超載對內(nèi)皮功能及氧化應(yīng)激的影響

韓立坤 李明舉1毛 宇 張?zhí)熨Y

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000)

目的探討糖尿病腎病(DN)大鼠鐵超載后對內(nèi)皮功能及氧化應(yīng)激的影響。方法將采用隨機數(shù)字法30只健康雄性Wistar大鼠分為正常對照組(NC組)10只和糖尿病模型組20只，糖尿病模型組按65 mg/kg體重單次腹腔注射鏈脲佐菌素。將20只造模成功的大鼠仍按隨機數(shù)字法分為DN組10只和鐵超載組(Fe組)10只。NC組和DN組繼續(xù)給予普通全價顆粒飼料，F(xiàn)e組給予高鐵飼料，喂養(yǎng)12 w。實驗結(jié)束前1 d收集24 h尿液測量尿白蛋白，計算尿白蛋白排泄率(UAER)；心臟采血檢測血清鐵(SI)、總鐵結(jié)合力(TIBC)、組織鐵(TI)、內(nèi)皮素(ET)-1、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)等相關(guān)指標(biāo)；觀察腎臟及肝臟病理情況；制備腎組織勻漿檢測一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(T-SOD)及丙二醛(MDA)。結(jié)果Fe組大鼠的腎重/體重(KW/BW)顯著高于DN組(Plt;0.05)。Fe組血糖、UAER、Scr、BUN、SI、TI顯著高于DN組(Plt;0.01)，TIBC顯著低于DN組(Plt;0.01)；腎組織NO、NOS顯著低于DN組，ET-1顯著高于DN組(Plt;0.01)；T-SOD顯著低于DN組(Plt;0.01)，MDA顯著高于DN組(Plt;0.01)。結(jié)論鐵超載能促進DN的發(fā)生與發(fā)展，機制可能與血糖水平升高、內(nèi)皮功能障礙及氧化應(yīng)激有關(guān)。

鐵超載；糖尿病腎病；內(nèi)皮功能；氧化應(yīng)激

近年研究發(fā)現(xiàn)糖尿病慢性并發(fā)癥的共同機制是線粒體活性氧簇(ROS)生成過多〔1〕，氧化應(yīng)激在糖尿病腎病(DN)的發(fā)病機制中也具有重要的作用〔2〕。同時也有研究表明血管內(nèi)皮功能受損可能是DN的啟動因素〔3〕。鐵是人體內(nèi)含量最多的必需微量元素，由鐵產(chǎn)生的ROS可能是DN重要的損傷機制〔4〕，因此機體內(nèi)鐵超載可能會導(dǎo)致和加重DN的發(fā)生、發(fā)展〔5，6〕，但是鐵超載狀態(tài)下血管內(nèi)皮功能狀態(tài)的改變未見報道。本文旨在探討DN大鼠鐵超載是否可促進DN的進展及鐵超載時氧化應(yīng)激和血管內(nèi)皮功能狀態(tài)，從而闡明鐵促進DN進展的作用及機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級健康雄性Wistar大鼠30只〔購自長春億斯實驗動物研究所，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(吉)-2011-0004〕，體重(250±10)g，鼠齡6～7 w。

1.2主要儀器與試劑 PD-G001-1百捷血糖儀及試紙(臺灣臺北勤立生物科技股份有限公司)；BWS-5恒溫水槽與水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；HS-100C恒溫搖床(上海和呈儀器制造有限公司)；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度儀(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；IKA-YLTRA-TUTTAXT8型勻漿機(德國IKA公司)。鏈脲佐菌素(STZ)購自北京索萊寶科技有限公司。血清鐵(SI)試劑盒、總鐵結(jié)合力(TIBC)試劑盒、組織鐵(TI)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3DN模型的制備及分組 實驗大鼠普通全價顆粒飼料(購于北京華阜康生物科技股份有限公司)適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，模型組(n=20)禁食12 h后，按65 mg/kg體重計算，單次腹腔注射1%的STZ溶液(0.1 mol/L無菌枸櫞酸鈉緩沖液，按pH4.5配制，用前冰中低溫避光保存。現(xiàn)配現(xiàn)用，10 min內(nèi)用完)。正常對照組(NC，n=10)給予相同體積的無菌枸櫞酸鈉緩沖液單次腹腔注射。60 h后禁食12 h，自由飲水，尾靜脈采血，空腹血漿葡萄糖≥16.7 mmol/L且尿蛋白排泄率﹥20 mg/24 h提示DN造模成功〔7〕。將造模成功的20只大鼠采用隨機數(shù)字法分為鐵超載組(Fe，n=10)和DN組(n=10)。造模成功后先用普通全價顆粒飼料喂養(yǎng)1 w，1 w后Fe組大鼠給予高鐵飼料(在普通全價顆粒飼料的基礎(chǔ)上每1 000 g添加金屬元素鐵1 000 mg，購于北京華阜康生物科技股份有限公司)，NC組和DN組大鼠繼續(xù)給予普通全價顆粒飼料喂養(yǎng)；實驗期間每7 d稱量體重，每4 w用代謝籠收集24 h尿液并測定空腹血糖(FPG)，持續(xù)12 w。在整個實驗過程中，大鼠自由攝食和飲水，不使用任何降糖藥物及皮下注射胰島素。12 w后采血分離血清，測SI、血清鐵蛋白，F(xiàn)e組明顯增高，確定造模成功。

1.4標(biāo)本收集 實驗結(jié)束前1 d各組大鼠禁食、自由飲水用代謝籠準(zhǔn)確收集24 h尿液測出尿量，新鮮尿液以3 000 r/min，4℃離心10 min，去除沉淀，-20℃保存，以檢測尿白蛋白定量并計算尿白蛋白排泄率(UAER)。實驗結(jié)束時稱量體重，按50 mg/kg體重腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，心臟穿刺采血，注入一次性真空抗凝采血管中，靜置后以3 500 r/min，4℃離心15 min，取上清后存放于-20℃冰箱中保存待測。

1.5指標(biāo)檢測 SI、TIBC、TI、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、內(nèi)皮素(ET)1、SOD、MDA、Scr、BUN和UAER等相關(guān)指標(biāo)，嚴(yán)格按照各項指標(biāo)的試劑盒說明書對其進行測定并計算。

1.6腎臟指數(shù)測定及腎臟組織勻漿制備 心臟采血后迅速摘除雙側(cè)腎臟，用冰生理鹽水沖洗后濾紙吸干。腎臟剔除被膜后稱量質(zhì)量，計算臟器指數(shù)。腎臟指數(shù)(%)=腎臟質(zhì)量(KW，mg)/體質(zhì)量(BW，g)。取部分腎組織稱重，按質(zhì)量與體積1∶9的比例，量取冷生理鹽水，用勻漿機充分研碎使組織勻漿化。將制備好的10%組織勻漿，以3 500 r/min，4℃離心10 min，用移液器抽取離心后勻漿液的上清液，存放于-20℃冰箱中保存待測。

1.7肝臟、腎臟組織病理學(xué)觀察 心臟采血后迅速摘除肝臟，24 h后肝組織行普魯士藍染色觀察肝組織內(nèi)鐵沉積情況；腎臟摘除后左腎沿縱軸剖開，立即用4%多聚甲醛固定，進行蘇木素-伊紅(HE)染色觀察病理形態(tài)學(xué)變化。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組一般體征及腎重指數(shù)比較 造模成功大鼠開始出現(xiàn)明顯的多飲、多食、多尿、逐漸消瘦、精神萎靡，至實驗結(jié)束DN組、Fe組各死亡1只。12 w末與NC組相比，F(xiàn)e組大鼠BW明顯降低，腎重指數(shù)(KW/BW)明顯升高(Plt;0.01)。與DN組相比，F(xiàn)e組大鼠BW及KW差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05)；但KW/BW升高(Plt;0.05)。見表1。

2.2各組大鼠血糖、腎功能、UAER及鐵超載比較 DN及Fe組血糖與NC組相比明顯升高(Plt;0.01)；與DN組相比，F(xiàn)e組大鼠的血糖也明顯升高(Plt;0.01)。與NC組相比，DN組及Fe組UAER、Scr和BUN升高(Plt;0.05)；與DN組相比，F(xiàn)e組UAER、Scr和BUN仍升高(Plt;0.05)。與NC組相比，DN組大鼠SI、TI和TIBC差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05)；Fe組SI和TI明顯升高(Plt;0.01)，TIBC明顯降低(Plt;0.01)。與DN組相比，F(xiàn)e組大鼠的SI和TI升高(Plt;0.05)，TIBC明顯降低(Plt;0.01)。見表2。

表1 3組大鼠BW、KW、KW/BW的比較

與NC組比較：1)Plt;0.01；與DN組比較：2)Plt;0.05

表2 3組大鼠血糖、腎功能、尿微量白蛋白排泄率及鐵超載情況

與NC組相比:1)Plt;0.01，2)Plt;0.05；與DN組比較:3)Plt;0.01，4)Plt;0.05

2.3各組大鼠腎臟組織中NO、NOS和血液ET-1的變化 與NC組相比，DN組大鼠腎臟組織NO、NOS明顯降低，ET-1明顯升高(Plt;0.01)；與DN組相比，F(xiàn)e組大鼠的NO、NOS降低(Plt;0.05)，ET-1明顯升高(Plt;0.01)。見表3。

2.4各組大鼠腎組織SOD、MDA含量的變化 與NC組相比，DN組大鼠的T-SOD明顯降低，MDA明顯升高(Plt;0.01)；與DN組相比，F(xiàn)e組大鼠的T-SOD明顯降低，MDA明顯升高(Plt;0.01)。見表4。

表3 3組大鼠NO、NOS及血ET-1情況

與NC組相比:1)Plt;0.01；與DN組比較:2)Plt;0.01，3)Plt;0.05

2.5各組大鼠肝臟、腎臟組織的病理改變 光鏡下觀察普魯士藍染色肝組織，可見NC組肝細胞形態(tài)規(guī)則，肝小葉輪廓清晰；DN組肝細胞脂肪變性，肝小葉結(jié)構(gòu)尚完整；Fe組肝臟內(nèi)可見明顯的褐色鐵沉積，肝細胞脂肪變性、淋巴細胞浸潤、排列紊亂，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，纖維組織增生和出血性壞死。見圖1。

表4 3組大鼠T-SOD、MDA情況

與NC組相比：1)Plt;0.001；與DN組比較：2)Plt;0.01

光鏡下觀察HE染色腎組織，可見NC組腎小球結(jié)構(gòu)正常，系膜和基質(zhì)未見明顯病理改變；DN組基底膜厚薄不均，系膜基質(zhì)增多、腫脹；Fe組腎小球基底膜彌漫性增厚，系膜細胞增生，系膜外基質(zhì)沉積，腎小管擴張，管腔變窄，上皮細胞呈空泡樣變性，腎間質(zhì)存在炎性細胞和淋巴細胞浸潤。見圖2。

圖1 大鼠肝臟普魯士藍染色(10×10)

圖2 各組大鼠的腎臟HE染色(10×10)

3 討 論

鐵是人體內(nèi)含量最多的必需微量元素，人體攝入富含鐵元素的食物可使機體對鐵的吸收增加，但是機體缺乏有效的排泄鐵的途徑，久而久之機體鐵超載，而鐵超載對內(nèi)分泌代謝、心血管、神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、腎臟等系統(tǒng)器官產(chǎn)生多種影響，導(dǎo)致多種疾病發(fā)生及進展。DN是常見的糖尿病慢性微血管并發(fā)癥之一，通常指由于糖尿病引起的腎小球基底膜增厚，系膜擴張以及胞外基質(zhì)增生，導(dǎo)致腎小球高濾過和蛋白尿，其進展可能與炎癥、凋亡、氧化應(yīng)激、纖維化等主要因素有關(guān)〔8，9〕。本研究結(jié)果與之前的研究相似〔10〕，表明腎臟組織內(nèi)鐵沉積可以導(dǎo)致腎臟損傷進一步加重，鐵超載對于DN的促進并不完全因為是高鐵狀態(tài)下血糖水平更高而導(dǎo)致，可能還存在其他的因素。

鐵超載時過量的鐵會沉積于肝臟、胰腺，引起氧化損傷，從而導(dǎo)致胰島素抵抗、損害胰島β細胞，最終促進DM的發(fā)生〔11〕，因此鐵超載與胰島素和葡萄糖代謝異常有關(guān)〔12〕。本研究結(jié)果也表明，鐵超載時DM大鼠的血糖會進一步升高，而糖代謝紊亂進一步加重了DM大鼠的腎臟微血管病變。而也有研究表明鐵超載后DM大鼠的血糖水平與單純DM大鼠血糖比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05)〔13〕，研究結(jié)果的不一致可能與鐵負荷的劑量有關(guān)。

高血糖可通過各種炎癥信號通路、iNOS等途徑引起內(nèi)皮細胞功能異常，而血管內(nèi)皮功能受損在DN的發(fā)病過程中起到重要的作用〔3〕。NO和ET-1是一對最為重要的內(nèi)皮依賴性舒血管因子和縮血管因子，NOS是NO合成過程中的關(guān)鍵酶，決定NO的含量。高濃度的NO是胰島β細胞損傷的終末效應(yīng)分子，也可能是導(dǎo)致DN早期腎小球血流動力學(xué)異常的主要介質(zhì)〔14〕。當(dāng)血管內(nèi)皮細胞嚴(yán)重受損時，iNOS表達降低，NO產(chǎn)生減少。而DN的嚴(yán)重程度與ET-1水平呈正相關(guān)，選擇性阻斷ET受體既能阻止腎血管收縮和高濾過，又能阻止蛋白尿的進展和腎結(jié)構(gòu)的破壞〔15〕。本研究結(jié)果說明鐵超載促進DN進展與內(nèi)皮功能障礙有關(guān)。鐵超載、高血糖和高胰島素血癥具有協(xié)同作用，可同時增加ROS活性〔16〕，而iNOS和ROS的產(chǎn)生是DN進展的一個重要因素〔17〕，同時鐵在機體內(nèi)能加速脂質(zhì)過氧化過程促進機體的脂質(zhì)過氧化〔18〕。MDA是脂質(zhì)過氧化過程中生成的一類交聯(lián)性很強的具有生物毒性的醛類物質(zhì)。它能夠通過其碳基與膜蛋白質(zhì)、核酸及磷脂等形成Schiff堿，從而導(dǎo)致血管壁和基底膜的增厚。MDA含量可反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度，也可間接反映ROS攻擊并損傷細胞的程度。本研究證明鐵超載促進DN的發(fā)生與發(fā)展與脂質(zhì)過氧化增多有關(guān)。SOD是生物體內(nèi)最重要的抗氧化酶之一，是機體清除iNOS的第一道防線。鐵超載能顯著提高ROS生成〔19〕，使機體處于iNOS狀態(tài)造成組織損傷，進而消耗SOD。本研究的結(jié)果與此相同，顯示鐵超載大鼠SOD明顯降低，表明機體失去了ROS的產(chǎn)生和清除之間的動態(tài)平衡，引起iNOS含量增強，進一步加重大鼠的腎臟病變。

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〔2017-07-18修回〕

(編輯 郭 菁/滕欣航)

R587.2

A

1005-9202(2017)22-5515-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.013

內(nèi)蒙古自治區(qū)教育廳基金資助項目(NJZY11205)

1 河南省確山縣人民醫(yī)院

張?zhí)熨Y(1975-)，男，主任醫(yī)師，主要從事眼科研究。

韓立坤(1976-)，女，主任醫(yī)師，主要從事糖尿病及慢性并發(fā)癥研究。