整合素連接激酶經磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路促進胃癌細胞增殖和遷移

劉文宗 何 譜 邵明亮 張 巍

(石家莊市第五醫院胸腹外科，河北 石家莊 050021)

整合素連接激酶經磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路促進胃癌細胞增殖和遷移

劉文宗 何 譜 邵明亮1張 巍2

(石家莊市第五醫院胸腹外科，河北 石家莊 050021)

目的探討整合素連接激酶(ILK)對胃癌細胞增殖、侵襲的影響及相關機制。方法利用基因轉染建立過表達ILK基因的HGC-27及KATO Ⅲ胃癌細胞株；細胞計數試劑(CCK)8和Transwell實驗研究上調ILK基因表達對HGC-27及KATO Ⅲ細胞增殖和遷移能力的作用；Western 印跡實驗檢測上調ILK基因表達是否可影響HGC-27及KATOⅢ細胞Akt及p-Akt蛋白的表達。結果上調ILK基因表達可顯著促進HGC-27及KATO Ⅲ細胞的增殖和遷移能力；上調ILK基因表達可明顯上調HGC-27及KATO Ⅲ細胞p-Akt蛋白水平。結論ILK經磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路參與及影響胃癌細胞的致癌潛能。

胃癌；整合素連接激酶；磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路

胃癌是人類消化系統最常見的惡性腫瘤，其在所有惡性腫瘤中的發病及病死率高居第二位，僅次于肺癌〔1〕。我國是胃癌的高發區，據研究表明，僅2015年我國胃癌發病率及死亡率就分別高達679.1/10 萬和498.0/10 萬〔2〕。臨床醫治胃癌的主要手段是外科手術結合放、化療的綜合療法，但隨著人們對胃癌發病機制的不斷探索，化療聯合分子靶向治療已逐步應用于胃癌的臨床治療并取得良好療效〔3,4〕。整合素連接激酶(ILK)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其可經多條信號轉導途徑影響及參與腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移等生物行為〔5～7〕。本實驗通過構建上調ILK基因表達的胃癌細胞株，研究該基因對胃癌細胞惡性表型的影響及其相關機制，從而為胃癌臨床診斷確立新的分子標記物，并可為胃癌治療提供全新的分子靶點。

1 材料與方法

1.1實驗用細胞及主要材料 RPMI1640 培養基(Hyclone，美國)，胎牛血清(NQBB，美國)，人胃癌細胞HGC-27及KATO Ⅲ(中國科學院細胞庫，中國)，Transwell小室(Corning，美國)，兔抗ILK多克隆抗體、鼠抗增殖細胞核抗原(PCNA)單克隆抗體、兔抗蛋白激酶(PK)B單克隆抗體及兔抗磷酸化PK(p-PK)B多克隆抗體(Santa Cruz，美國)，鼠抗β-肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗鼠及山羊抗兔IgG(博士德，中國)；細胞計數試劑-8(CCK-8，博士德，中國)。

1.2細胞轉染實驗 分別將HGC-27及KATO Ⅲ細胞培養于24孔板各孔中(1.5×105個/孔)，細胞所用培養基為含5%熱滅活胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640；待細胞培養至24 h，移除培養基，加入含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640完全培養基，并向各孔中分別加入0.5 ml ILK質粒和空質粒病毒轉染液；待上述細胞培養72 h后，向培養基中加入嘌呤霉素(終濃度為5 ng/μl)進行篩選；于篩選后7 d，行Wstern印跡實驗以評價轉染效率。

1.3細胞增殖實驗 將ILK質粒和空質粒轉染的HGC-27和KATOⅢ細胞按4×103個/孔均勻鋪于96孔板各孔，細胞所用培養基為100 μl RPMI1640完全培養基；待細胞培養至24、48、72和96 h，向每孔中加入10 μl CCK-8試劑，然后將孔板放入37℃培養箱中孵育2 h；用酶標儀測得450 nm波長吸光度。

1.4細胞遷移實驗 將ILK質粒和空質粒轉染的HGC-27和KATOⅢ細胞按2×104個/室均勻鋪于Transwell小室中，小室中培養基為100 μl不含血清的RPMI1640；將小室置于24孔板各孔中，各孔中的培養基為600 μl含10%胎牛血清的RPMI1640；將孔板放入37℃培養箱中培養24 h；用脫脂棉簽小心擦掉小室內表面未遷移過的細胞；乙醇結晶紫染色25 min，自來水沖洗、晾干后在光學顯微鏡下拍照并進行計數。

1.5Western印跡實驗 提取細胞總蛋白并測定蛋白濃度，將50 μg細胞總蛋白加入12%的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠泳道中行垂直電泳；待溴酚藍泳動至下層膠下1/3處時，將凝膠中蛋白轉印到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上；37℃環境下將膜置于5%脫脂奶中封閉45 min；磷酸緩沖液-吐溫(PBS-T)室溫洗膜5 min×4次；4℃環境下分別用ILK(1∶500)、PCNA(1∶500)、PKB(1∶500)、p-PKB和β-actin(1∶1 000)一抗對膜孵育過夜；次日用PBS-T室溫洗膜5 min×4次；37℃環境下分別用HRP標記的二抗對膜孵育40 min；PBS-T室溫洗膜15 min×4次；向膜上滴加增強化學發光(ECL)試劑反應1～2 min；在凝膠成像系統中曝光、拍照及計算蛋白相對表達量。

1.6統計分析 應用的統計軟件SPSS19.0進行q檢驗。

2 結 果

2.1過表達ILK細胞的鑒定 嘌呤霉素篩選7 d后，Wstern印跡結果所示，空質粒轉染HGC-27細胞(HGC-27-Control)中ILK基因表達(1.109±0.114)明顯低于ILK質粒轉染HGC-27細胞(HGC-27-ILK，1.970±0.105)。同樣，空質粒轉染KATOⅢ細胞(KATOⅢ-Control)中ILK基因表達(0.796±0.108)明顯低于ILK質粒轉染KATOⅢ細胞(KATOⅢ-ILK，1.763±0.255)(均Plt;0.01)，故表明成功創建了上調ILK基因表達的胃癌細胞株。見圖1。

2.2過表達ILK增強胃癌細胞增殖 CCK-8實驗所示，HGC-27-Control組細胞生長至48、72、96 h后其吸光度值明顯低于HGC-27-ILK組(Plt;0.05)。另外，KATOⅢ-Control組細胞生長至72、96 h后其吸光度值明顯低于KATOⅢ-ILK組(Plt;0.05)。這說明，上調ILK基因的表達可顯著促進胃癌細胞HGC-27和KATO Ⅲ的增殖活性。見表1。

2.3過表達ILK增強胃癌細胞遷移 Transwell 實驗所示，24 h后HGC-27-Control組與HGC-27-ILK組遷移的細胞數〔(51.80±3.70)個和(63.40±10.36)個〕差異顯著(Plt;0.05)；KATO Ⅲ-Control組與KATO Ⅲ-ILK組遷移的細胞數〔(73.80±7.39)個和(89.40±11.10)個〕差異顯著(Plt;0.05)。

2.4過表達ILK上調p-PKB表達 Western 印跡結果表明，HGC-27-Control中p-PKB基因表達(0.644±0.116)明顯低于HGC-27-ILK(0.995±0.076)；KATO Ⅲ-Control組p-PKB基因表達(0.315±0.062)明顯低于KATO Ⅲ-ILK組(0.759±0.105)(均Plt;0.01)。見圖2。

圖1 ILK穩定轉染細胞的鑒定

組別24h48h72h96hHGC-27-Control組0.4628±0.03640.6598±0.04851.3458±0.09341.9457±0.0732HGC-27-ILK組0.4714±0.02720.8117±0.05841)1.4969±0.07391)2.1543±0.11321)KATOⅢ-Control組0.6350±0.05251.1431±0.04751.5674±0.04852.1330±0.0517KATOⅢ-ILK組0.6649±0.05091.1918±0.10171.6904±0.07062)2.2254±0.06082)

與HGC-27-Control比較：1)Plt;0.05；與KATO Ⅲ-Control比較：2)Plt;0.05

圖2 過表達ILK上調HGC-27和KATOⅢ細胞p-PKB表達

3 討 論

ILK是1996年Hannigan等在運用酵母雙雜交技術進行整合素β1蛋白研究過程中鑒定出的具有絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶活性的細胞內蛋白質，該基因位于人類染色體的11p15.5-p15.4位置上，可編碼相對分子量為36 000的功能性蛋白質〔8〕。ILK可被整合素及生長因子等信號分子經磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)依賴形式而活化，激活的ILK可使其下游分子PKB和糖原合成酶激酶(GSK)3磷酸化，從而介導來自生長因子、細胞與細胞外基質(ECM)彼此間協同刺激信號的轉導過程，并最終影響細胞的生理、生化功能〔9〕。人類的一些惡性腫瘤如胃癌、結腸癌、肺癌、前列腺癌、黑色素瘤等都存在ILK 基因的表達上調，并且其表達水平與腫瘤惡性進程、轉移程度等臨床病理參數具有明顯相關性〔10〕。Oloumi等〔11〕報道，上調或活化ILK基因的腫瘤細胞具有非貼壁生長活性，并且轉移、侵襲和成瘤能力顯著提高。而當應用RNAi下調ILK基因表達可抑制腫瘤細胞的增殖、轉移和侵襲等惡性表型〔12〕。Liu等〔13〕研究表明，應用RNAi下調卵巢癌細胞ILK后，凋亡相關基因如B細胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3的表達也被下調。由此可見，ILK還可調控細胞凋亡進程。

PKB又稱Akt，它是PI3K/PKB通路的重要信號分子，PI3K/PKB通路被人們普遍認為是腫瘤細胞存活的關鍵信號途徑，在腫瘤的惡性發展中發揮不可替代的作用。Yamamoto等〔14〕研究結腸癌發現，活化的PI3K/Akt途徑可經膜型基質金屬蛋白酶1(MT1-MMP)致使腫瘤細胞侵襲及轉移能力顯著增強。當應用PI3K/PKB途徑靶向小干擾RNA可顯著抑制卵巢癌細胞的增殖、遷移及侵襲〔15〕。最近的一項研究也報道了PI3K/PKB在胃癌中的重要作用，當將小RNA-196b(miR-196b)轉染胃癌細胞后，細胞PI3K/PKB蛋白水平和G0/G1期比值可被上調，同時細胞的增殖、克隆形成及遷移能力也明顯增強〔16〕。同樣，本實驗結果表明，HGC-27及KATOⅢ胃癌細胞株過表達ILK基因可顯著促進其增殖和遷移能力，同時過表達細胞株的p-PKB水平也顯著提高。由此表明，與上述RNA-196b實驗結果一樣，ILK可經PI3K/AKT途徑參與胃癌發生與發展過程。該研究成果可幫助人們更深入認識胃癌的分子機制，從而可為胃癌的臨床診斷和治療提供全新的分子標記物和靶點。

1Jemal A,Bray F,Center MM,etal.Global cancer statistics〔J〕.CA Cancer J Clin,2011;61(2):69-90．

2Chen W,Zheng R,Baade PD,etal.Cancer statistics in China,2015〔J〕.CA Cancer J Clin,2016;66(2):115-32.

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4Fanotto V,Ongaro E,Rihawi K,etal.HER-2 inhibition in gastric and colorectal cancers:tangible achievements,novel acquisitions and future perspectives〔J〕.Oncotarget,2016;7(42):69060-74.

5Yan Z,Yin H,Wang R,etal.Overexpression of integrin-linked kinase (ILK) promotes migration and invasion of colorectal cancer cells by inducing epithelial-mesenchymal transition via NF-κB signaling〔J〕.Acta Histochem,2014;116(3):527-33.

6Persad S,Attwell S,Gray V,etal.Inhibition of integrin-linked kinase (ILK) suppresses activation of protein kinase B/Akt and induces cell cycle arrest and apoptosis of PTEN-mutant prostate cancer cells〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2000;97(7):3207-12.

7Persad S,Attwell S,Gray V,etal.Inhibition of integrin-linked kinase (ILK) suppresses activation of protein kinase B/Akt and induces cell cycle arrest and apoptosis of PTEN-mutant prostate cancer cells〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2000;97(7):3207-12.

8Hannigan GE,Leung-Hagesteijn C,Fitz-Gibbon L,etal.Regulation of cell adhesion and anchorage-dependent growth by a new beta1-integrin-linked protein kinase〔J〕.Nature,1996;379(6560):91-6.

9Papanikolaou S,Bravou V,Gyftopoulos K,etal.ILK expression in human basal cell carcinoma correlates with epithelial-mesenchymal transition markers and tumour invasion〔J〕.Histopathology,2010;56(6):799-809．

10Booton R,Ward T,Ashcroft L,etal.ERCC1 mRNA expression is not associated with response and survival after platinum-based chemotherapy regimens in advanced non-small cell lung cancer〔J〕.J Thorac Oncol,2007;2(10):902-6.

11Oloumi A,Mcphee T,Dedhar S.Regulation of E-cadherin expression and beta-catenin/Tcf transcriptional activity by the integrin-linked kinase〔J〕.Biochem Biophys Acta,2004;1691(1):1-15.

12Muranyi AL,Dedhar S,Hogge DE.Targeting integrin linked kinase and FMS-like tyrosine kinase-3 is cytotoxic to acute myeloid leukemia stem cells but spares normal progenitors〔J〕.Leuk Res,2010;34(10):1358-65.

13Liu Q,Xiao L,Yuan D,etal.Silencing of the integrin-linked kinase gene induces the apoptosis in ovarian carcinoma〔J〕.J Recept Signal Transduct Res,2012;32(2):120-7.

14Yamamoto H,Noura S,Okami J,etal.Overexpression of MT1-MMP is insufficient to increase experimental liver metastasis of human colon cancer cells〔J〕.Int J Mol Med,2008;22(6):757-61.

15Huang J,Zhang L,Greshock J,etal.Frequent genetic abnormalities of the PI3K/AKT pathway in primary ovarian cancer predict patient outcome〔J〕.Genes Chromosomes Cancer,2011;50(8):606-18.

16Li NA,Wang W,Xu B,etal.miR-196b regulates gastric cancer cell proliferation and invasion via PI3K/AKT/mTOR signaling pathway〔J〕.Oncol Lett,2016;11(3):1745-9.

〔2016-11-13修回〕

(編輯 王一涵)

R735.2

A

1005-9202(2017)22-5536-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.021

黑龍江省衛生廳科研課題(2013326)

1 介入醫學科 2 研究中心

張 巍(1976-)，女，副主任醫師，醫學博士，主要從事腫瘤早期診斷研究。

劉文宗(1982-)，男，主治醫師，醫學碩士，主要從事普外科疾病診治研究。