金銀花過氧化物酶的三相分離純化及酶學性質

羅 磊，董金龍，朱文學*，薛依涵，關寧寧，張 寬，姬青華

金銀花過氧化物酶的三相分離純化及酶學性質

羅 磊，董金龍，朱文學*，薛依涵，關寧寧，張 寬，姬青華

（河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023）

采用三相分離法提取純化金銀花中過氧化物酶，結果表明最優純化條件為pH 5.60、硫酸銨質量濃度39.49 g/100 mL、提取液與叔丁醇體積比1∶1.38，在該條件下純化倍數為5.849，回收率為87.64%。金銀花過氧化物酶比活力為1 021.6 U/mg，色素清除率為92%；酶學性質研究表明：金銀花過氧化物酶最適溫度為30 ℃，熱穩定范圍為10～40 ℃；最適pH值為5，pH值穩定范圍為4～7。在金銀花過氧化物酶催化的雙底物酶促反應中，當H2O2濃度一定時，酶對愈創木酚的Km值為8.12 mmol/L，vmax值為1.71 mmol/（min·L）。當愈創木酚濃度一定時，H2O2的Km值為0.822 mmol/L，vmax值為1.38 mmol/（min·L）。金銀花過氧化物酶與底物的親和力由強到弱依次是鄰苯三酚、鄰苯二酚、聯甲氧基苯胺、愈創木酚。Ca2＋、Cu2＋、Zn2＋對金銀花過氧化物酶有激活作用，Mg2＋、Mn2＋、檸檬酸、抗壞血酸、L-半胱氨酸、亞硫酸鈉、偏重亞硫酸鈉、十二烷基磺酸鈉對金銀花過氧化物酶有不同程度的抑制作用。

金銀花；過氧化物酶；三相分離法；酶學性質

金銀花（Lonicera japonica Thunb.）為忍冬科植物忍冬的花蕾或初開的花，具有抑菌、抗病毒[1-3]、抗氧化[4-5]等作用，作為一種“藥食同源”原料廣泛用于食品生產[6-7]。新鮮金銀花在儲藏和干燥加工過程中，常發生不同程度的褐變，造成功效成分降解，導致藥用價值的降低[8]。研究表明這種品質劣變是在多酚氧化酶和過氧化物酶（peroxidase，POD）等相關酶的作用下，酚類物質氧化為醌，醌類物質聚合形成褐色素而引起的[9-10]。目前金銀花酶促褐變引起功效成分損失的具體途徑尚未研究清楚，提取純化相關酶對于金銀花酶促褐變機理研究具有一定意義。

三相分離法是通過向粗提取液中加入一定比例的鹽和有機溶劑使混合液產生明顯的三相，使部分蛋白聚集在有機相和水相間的沉淀層，低分子質量色素、膜脂等溶解在有機層，糖類、部分蛋白質溶解在水層，從而達到提取純化目標物質的方法[11-12]。研究表明三相分離法適用于部分植物組織中酶的初步純化[12-16]，此外三相分離法也可用于分離純化油性樹脂[17]、熊果酸、齊墩果酸[18]等天然物質。將三相分離法應用于植物組織中天然物質的純化是一種較新的分離純化技術[19]，具有一定的應用前景。

本研究用三相分離法分離純化金銀花中的POD，一方面有助于純化參與酶促褐變的相關酶，為進一步深入研究金銀花中酶促褐變途徑提供依據；另一方面對擴展三相分離體系在植物組織中酶的純化方面的應用具有積極意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮金銀花采摘于洛陽市孟津縣益豐金銀花種植基地。

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、無水乙醇、甘油、甲叉雙丙稀酰胺、過氧化氫、丙烯酰胺 天津市德恩化學試劑有限公司；硫酸銨、甘氨酸 江蘇強盛功能化學股份有限公司；愈創木酚 上海源葉生物科技有限公司；磷酸、鹽酸、三羥甲基氨基甲烷 洛陽昊華化學試劑有限公司；叔丁醇、堿性品紅、偏重亞硫酸鈉、活性炭天津市科密歐化學試劑有限公司；考馬斯亮藍G-250、考馬斯亮藍R-250 上海強順化學試劑有限公司；牛血清白蛋白 上海藍季科技發展有限公司；溴酚藍 天津市致遠化學試劑有限公司；四甲基乙二胺 北京吉美生物技術有限公司；過硫酸銨 天津市大茂化學試劑廠；高碘酸鈉、三氯乙酸 南京化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

HR2850攪拌機 飛利浦電子公司；PHS-3C型精密pH計 上海越平科學儀器有限公司；2400紫外-可見分光光度計 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；H1850R湘儀臺式高速冷凍離心機 湖南長沙湘儀離心機儀器有限公司；DYCZ-24DN垂直板電泳槽、電泳儀 北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 金銀花POD的提取

稱取一定量新鮮無損金銀花，按照料液比1∶7（g/mL）加入4 ℃的pH值為6的磷酸鹽緩沖液打漿2 min，4 ℃、9 000 r/min離心15min，收集上清液即為粗酶液，將粗酶液分裝凍存備用。

1.3.2 三相分離法純化POD

取20 mL酶的粗提取液，在100 r/min攪拌條件下緩慢加入一定量的硫酸銨，待硫酸銨固體充分溶解之后用1 mol/L的HCl或NaOH溶液調節混合液的pH值，然后按照一定體積比加入叔丁醇，繼續攪拌10 min，將混合液轉移至離心管中，4 ℃靜置1 h，4 000 r/min離心10 min。離心之后可以觀察到混合液分為明顯的三相，即上層的有機相、中間的沉淀層和下層的水相，用吸管吸除上層的有機相和下層水相。中間沉淀層用1 mL的pH值為6的磷酸鹽緩沖液溶解，透析除去鹽和有機溶劑，分別測定總蛋白含量和酶活力[11-12,16]。

1.3.3 單因素試驗

首先固定硫酸銨質量濃度30 g/100 mL、提取液與叔丁醇體積比1∶1，考察pH值（3、4、5、6、7、8）對金銀花POD回收率和純化倍數的影響。在最優pH值條件下，固定提取液與叔丁醇體積比1∶1，考察硫酸銨質量濃度（20、30、40、50、60 g/100 mL）對金銀花POD回收率和純化倍數的影響。然后在最優pH值及硫酸銨質量濃度條件下，考察提取液與叔丁醇體積比（1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5）對金銀花POD回收率和純化倍數的影響。

1.3.4 金銀花POD提取純化的響應面試驗

根據單因素試驗結果，使用Box-Behnken試驗設計，分析pH值、硫酸銨質量濃度、粗提取液與叔丁醇體積比在三相分離中對金銀花POD分離純化的影響。試驗設計的因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素及水平Table 1 Factors and levels used for Box-Behnken design

1.3.5 酶活力測定

在比色杯中，先加入2 mL pH值為5的磷酸鹽緩沖液，然后加入1 mL體積分數0.5%愈創木酚和0.1 mL體積分數0.1% H2O2溶液，最后加0.1 mL粗酶液，蓋上蓋子在比色皿中迅速混合均勻，30 ℃條件下在470 nm波長處測定吸光度，每隔20 s計1 次數，以吸光度每分鐘變化0.01為1 個酶活力單位[20]。

1.3.6 蛋白質含量的測定

采用Bradford的考馬斯亮藍G-250比色法[21]測定蛋白質含量，用牛血清蛋白制作標準曲線，以595 nm波長處的吸光度為縱坐標，以標準蛋白質質量（mg）為橫坐標繪制標準曲線[22]，根據標準曲線方程計算出樣品中蛋白質質量。以標準蛋白質質量對吸光度進行線性回歸得回歸方程為：y=8.333x＋0.034 3，R2=0.998 1。

1.3.7 脫色效果測定

[23]，通過全波長掃描，將418 nm作為金銀花褐變色素測定波長，實驗發現在418 nm波長處無掃描峰，選擇在360、380、400、420、460 nm測定粗提取液吸光度，將粗提取液稀釋不同的倍數，以使吸光度在0.2～0.8范圍內，選擇線性最優的波長作為測定色素含量的最佳波長。脫色效果以色素清除率表示，計算公式如下[24]：

式中：a、b分別為粗提取液和透析液的稀釋倍數；V1為粗提取液體積；V2為透析液體積。1.3.8 聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗

對粗提取液及經三相分離法提取純化的金銀花POD進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，凝膠分別用考馬斯亮藍染色、愈創木酚和H2O2溶液組成的底物溶液進行活性染色[25]，以及高碘酸-Schiff試劑反應（periodic acid schiff reaction，PAS）染色[26]。

1.3.9 金銀花POD酶學性質測定

1.3.9.1 金銀花POD最適溫度及熱穩定性

分別在10～70 ℃溫度下測定酶活力，以酶活力最高為100%。酶液在10～70 ℃條件下保溫1 h后，迅速冷卻至室溫，測定殘余酶的活力，以未保溫處理4 ℃條件下放置1 h的酶活力為100%[27]。

1.3.9.2 金銀花POD最適pH值及pH值穩定性

在不同pH值的緩沖溶液中測定酶活力，以酶活力最高者為100%。用不同pH值的緩沖溶液稀釋酶液，4 ℃放置1 h，測定殘余酶的活力，以酶活力最高者為100%[27]。

1.3.9.3 底物濃度對金銀花POD反應速率的影響

在最適條件下使酶促反應體系的愈創木酚濃度分別為3.33、1.67、1.11、0.83、0.67、0.56、0.48 mmol/L，測得不同愈創木酚濃度下酶促反應的速率，以愈創木酚濃度的倒數為橫坐標，以反應速率的倒數為縱坐標，求出金銀花POD在該條件下的米氏常數Km值和最大速率vmax值[27-28]。

在最適條件下使酶促反應體系的H2O2溶液濃度分別為0.333、0.167、0.111、0.083、0.067、0.056、0.048 mmol/L，測得H2O2溶液不同濃度下酶促反應的速率，以H2O2溶液濃度的倒數為橫坐標，以反應速率的倒數為縱坐標，求出金銀花POD在該條件下的米氏常數Km值和vmax值。

H2O2溶液濃度測定用經草酸鈉標定的高錳酸鉀溶液進行滴定。產物濃度[27]以愈創木酚氧化產物四聯甲氧基連酚的消光系數ε470nm為26.6 mmol·cm·mL計算。

1.3.9.4 金銀花POD的底物特異性

在酶反應體系中分別以愈創木酚、鄰苯二酚、鄰苯三酚、聯甲氧基苯胺為酶反應底物，測定不同底物濃度下酶促反應速率，用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法，計算不同底物條件下酶促反應米氏方程，根據Km值判斷金銀花POD的底物專一性。

1.3.9.5 抑制劑和金屬離子對金銀花POD活性的影響

在酶反應體系中加入0.1 mL不同濃度的抑制劑（檸檬酸、抗壞血酸、L-半胱氨酸、亞硫酸鈉、偏重亞硫酸鈉、十二烷基磺酸鈉）及金屬離子（NaCl、CaCl2、MgSO4、ZnSO4、CuSO4、MnSO4），在不同化合物濃度（0.1、1、10 mmol/L）條件下測定對酶活力的影響，以不添加化合物組為對照組，計算相對酶活力，測定不同化合物對金銀花POD的激活及抑制作用。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 pH值對金銀花POD回收率和純化倍數的影響

圖1 pH值對金銀花POD回收率和純化倍數的影響Fig. 1 Effect of pH on purification fold and activity recovery of POD

在三相分離體系的參數優化中，pH值常作為首要考慮的因素[11]。由圖1可知，回收率和純化倍數都呈現先上升再下降的趨勢，在pH 3～4和6～7之間變化程度較大，在pH值為6時達到最佳的提取純化效果。原因可能是體系的分配效果常在目標蛋白等電點附近發生明顯的變化[11-12]。當體系的pH值大于目標蛋白的等電點時，蛋白質因為攜帶負電荷而趨向于向水相層移動，當體系的pH值小于目標蛋白的等電點時，蛋白質因為攜帶正電荷而聚集在有機相層與水相層間的沉淀層。此外，當蛋白質攜帶正電荷時易與SO42-發生結合，而使蛋白結構緊縮而沉淀析出，這與pH值對常規鹽析的影響作用類似。因此，在pH值為5～6時，有較好的提取純化效果，當pH值大于6時，提取純化效果下降。在pH值為3時效果較差可能是金銀花POD在偏酸性環境下失活引起的。

2.1.2 硫酸銨對金銀花POD回收率和純化倍數的影響

圖2 硫酸銨質量濃度對金銀花POD回收率和純化倍數的影響Fig. 2 Effect of ammonium sulfate concentration on purification fold and activity recovery of POD

由圖2可知，在硫酸銨質量濃度為40 g/100 mL時，回收率和純化倍數達到最大值，分別達到75.4%和5.36。三相分離體系對于蛋白質的分離純化作用主要是鹽析、有機溶劑沉淀、等電點沉淀、滲透和離子的親液作用等[12]。SO42-通過結合溶液中的自由水，使蛋白質的疏水基團暴露，隨著鹽濃度增大蛋白質由于疏水作用而聚集沉淀。因此，當硫酸銨質量濃度大于40 g/100 mL時，純化倍數下降較快，回收率緩慢下降。

2.1.3 提取液與叔丁醇體積比對金銀花POD回收率和純化倍數的影響

圖3 提取液與叔丁醇體積比對金銀花POD回收率和純化倍數的影響Fig. 3 Effect of ratio of crude extract to t-butanol on purification fold and activity recovery of POD

從圖3可以看出，提取液與叔丁醇體積比從1∶0.5改變到1∶1時，回收率和純化倍數上升較快，提取液與叔丁醇體積比為1∶1.5時，回收率和純化倍數達到最大值，分別為77.4%和5.67。叔丁醇因分子體積較大不能進入蛋白質分子結構內部，因而不易引起酶失活。此外可以與水互溶的叔丁醇在硫酸銨溶液中可以產生明顯的分層，所以通常選擇叔丁醇作為在三相分離體系中的有機溶劑[11]。叔丁醇可以從水相層吸收一定量的水而使硫酸銨濃度增大而引起沉淀層蛋白增多，同時，水相與有機相的濃度梯度增大可能會引起回收率和純化倍數的減小[12,14]。因此回收率和純化倍數隨體積比的變化呈現先上升再下降的趨勢。

2.2 金銀花POD提取純化的響應面結果

2.2.1 模型建立與顯著性檢驗結果

表2 Box-Behnken試驗設計與結果Table 2 Box-Behnken design with experimental results

采用Design-Expert V8.05數據處理軟件對表2試驗結果進行多元回歸擬合，經回歸擬合后，得到純化倍數R1和回收率R2對提取液pH值（X1），硫酸銨質量濃度（X2）、提取液與叔丁醇體積比（X3）的二次多項式回歸方程為：

對回歸模型進行方差分析，結果見表3和表4。由表3可知，純化倍數二次回歸模型的F值為381.432，P值小于0.000 1，表明模型達到了極顯著水平；失擬項檢驗F值為2.873，P值大于0.05，說明失擬項差異不顯著，擬合不足是不顯著的；試驗模型的決定系數R2值為0.997，說明試驗結果與模型預測結果有著良好的一致性。因此可用此模型來分析和預測金銀花POD純化倍數。由表4可知，回收率二次回歸模型的F值為226.161，P值小于0.000 1，表明模型達到了極顯著水平；失擬項檢驗F值為4.183，P值大于0.05，說明失擬項差異不顯著，擬合不足是不顯著的；試驗模型的決定系數R2值為0.996，說明試驗結果與模型預測結果有著良好的一致性。因此可用此模型來分析和預測金銀花POD回收率。

由回歸方程系數顯著性檢驗可知所考察的3 個因素對回收率和純化倍數均有一定影響。X1、X2、X3、X12、、、X1X3對純化倍數有極顯著的影響；X1、X1X3、、、對回收率有極顯著的影響，X2對回收率有顯著的影響。根據F值可判斷3 個因素對純化倍數和回收率影響的主次順序依次是pH值、硫酸銨質量濃度、提取液與叔丁醇體積比。

表3 純化倍數回歸模型的方差分析顯著性檢驗Table 3 Analysis of variance and significance test for the established regression model for purification fold

表4 回收率回歸模型的方差分析顯著性檢驗Table 4 Analysis of variance and significance test for the established regression model for activity recovery

2.2.2 模型雙因素交互作用效應分析

應用Design-Expert V8.05繪制各指標與影響顯著的兩個自變量間的響應面和等高線圖，考察擬合響應面的形狀，分析交互項對回收率和純化倍數的影響。由圖4可知，pH值（X1）和提取液與叔丁醇體積比（X3）之間的交互作用對回收率和純化倍數的影響達到極顯著水平，原因可能是pH值影響分離體系中目標蛋白所帶電荷，提取液與叔丁醇體積比影響硫酸銨濃度及兩相間濃度梯度[12,14]，兩者相互作用，影響提取純化效果。

利用Design-Expert V8.05進行工藝參數的優化組合，由回歸方程優化得出因素水平的最優組合為pH5.60、硫酸銨質量濃度39.49 g/100 mL、提取液與叔丁醇體積比1∶1.38。在該條件下純化倍數為5.849，回收率為87.64%。新鮮金銀花中POD比活力為2 086.5 U/g，經三相法分離純化，POD比活力為1 021.6 U/mg。

圖4 交互作用對回收率和純化倍數影響的響應面和等高線圖Fig. 4 Response surface and contour plots showing the intereactive effects of factors on activity recovery and purification fold

2.3 金銀花POD的非變性凝膠電泳結果

圖5 金銀花POD聚丙烯酰胺凝膠電泳Fig. 5 PAGE pattern of POD from Lonicera japonica Thunb.

從圖5可以看出，經過三相分離法的初步純化，部分雜蛋白被去除。由于POD可將愈創木酚氧化為紅褐色物質，從活性染色結果可以看到2 條較明顯紅褐色條帶，說明該品種金銀花具有2 種POD同工酶。由于POD是一類含有血紅素輔基的糖蛋白[29]，因此通過PAS染色，可呈現紫色[30]。

2.4 脫色效果測定結果

圖6 不同波長下色素濃度與吸光度關系Fig. 6 Relationship between pigment concentration and absorbance values at different wavelengths

金銀花勻漿后極易發生褐變，產生大量色素，這些褐色素易與纖維素離子交換樹脂結合，且較難洗脫，對進一步純化產生影響。三相分離法對色素物質有一定分離效果，可用于褐色素的清除。由圖6可知，在380、400、420、440、460 nm波長范圍內對色素濃度與吸光度進行線性擬合，R2分別為0.974 2、0.976 0、0.988 2、0.971 2、0.961 6，在420 nm波長處色素濃度與吸光度的線性關系最優，因此選擇420 nm作為色素濃度測定波長。在回歸方程優化得出因素水平的最優組合條件下色素清除率可達92%。

2.5 金銀花POD最適溫度及熱穩定性分析

圖7 溫度對金銀花POD相對酶活力的影響及熱穩定性Fig. 7 Effect of temperature on activity and stability of the POD enzyme

從圖7可以看出，金銀花POD相對酶活力在10～70 ℃范圍內呈現先上升再下降的趨勢，相對酶活力在30 ℃時達到最大值，在溫度超過50 ℃后相對酶活力下降迅速，70 ℃時相對酶活力只有33%。從金銀花POD熱穩定性曲線可以看出在10～40 ℃范圍內相對酶活力較為穩定，40 ℃時相對酶活力為77.1%，同時溫度大于40 ℃后，酶穩定性迅速下降，70 ℃保溫1 h，相對酶活力為7.7%。

2.6 金銀花POD最適pH值及pH值穩定性分析

圖8 pH值對金銀花POD相對酶活力的影響及pH值穩定性Fig. 8 Effect of pH on activity and stability of the POD enzyme

從圖8可以看出，金銀花POD在pH 4～7范圍內有較高活性，該酶的最適pH值為5，在pH值為4時相對酶活力為87%，pH值為6時相對酶活力為84%；從pH值穩定性曲線中可以看出在pH值在2～5范圍內酶穩定性變化明顯，相對酶活力從20%上升到100%，pH值在5～9范圍內酶穩定性變化較緩慢，相對酶活力從100%變化到71%。可能是pH值小于4的酸性環境對金銀花POD分子結構穩定性影響較大，在pH 4～7的堿性環境中酶的分子構象較穩定。

2.7 底物濃度對金銀花POD反應速率的影響

圖9 愈創木酚（a）和H2O2（b）對金銀花POD反應速率影響的雙倒數曲線Fig. 9 Lineweaver-Burk plots for the POD enzyme with guaiacol (a)and H2O2 (b) as substrates

POD催化的酶促反應屬于雙底物酶促反應，固定一種底物的濃度，測定不同濃度的另一種底物對反應速率的影響，用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法，可以得到兩條雙倒數曲線，雙倒數曲線中橫軸截距為-1/Km，縱軸截距為1/vmax。由圖9金銀花POD的雙倒數曲線可以求出當H2O2溶液濃度一定時，POD對愈創木酚的Km值為8.12 mmol/L，vmax值為1.71 mmol/（min·L）。當愈創木酚溶液濃度一定時，H2O2的Km值為0.822 mmol/L，vmax值為1.38 mmol/（min·L）。Km值是酶促反應速率達到最大反應速率一半時的底物濃度，可以代表酶與底物的親和能力[27]。因此可以看出H2O2溶液對于金銀花POD的親和能力大于愈創木酚溶液。

2.8 金銀花POD的底物專一性

表5 金銀花POD的底物特異性Table 5 Substrate specificity of the POD enzyme

分別以愈創木酚、鄰苯二酚、鄰苯三酚、聯甲氧基苯胺作為反應底物，用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法可以得到不同底物條件下酶促反應的米氏方程，米氏常數Km可以代表酶與底物的親和能力，Km值愈小，表明酶與底物的親和力越強，從表5可以看出，金銀花POD與底物的親和力由強到弱依次為鄰苯三酚、鄰苯二酚、聯甲氧基苯胺、愈創木酚。

2.9 抑制劑和金屬離子對金銀花POD活力的影響

表6 不同化合物對金銀花POD相對酶活力的影響Table 6 Effects of various compounds on the activity of the POD enzyme

從表6可以看出，Ca2＋、Cu2＋、Zn2＋對金銀花POD有一定激活作用，其中Ca2＋在較低濃度條件下可以起到激活作用，Zn2＋在較高濃度條件下可以起到激活作用，Cu2＋的激活作用隨濃度增大逐漸增強。Mg2＋、Mn2＋對金銀花POD有抑制作用，其中Mn2＋抑制作用較強。Na＋對酶的作用不明顯。抑制劑檸檬酸、抗壞血酸、L-半胱氨酸、亞硫酸鈉、偏重亞硫酸鈉對金銀花POD均有一定抑制作用，抑制作用隨濃度增大逐漸增強，在10 mmol/L濃度下，抗壞血酸和L-半胱氨酸可以完全抑制酶活性。表面活性劑十二烷基磺酸鈉對金銀花POD有一定抑制作用，且在高濃度條件下抑制作用較強。

3 結 論

在單因素試驗的基礎上經響應面優化得出各因素水平的最優組合為pH 5.60、硫酸銨質量濃度39.49 g/100 mL、提取液與叔丁醇體積比為1∶1.38。在該條件下純化倍數為5.849，回收率為87.64%。該條件下POD比活力為1 021.6 U/mg。

420 nm可作為金銀花褐變產生色素的測定波長。三相分離法對褐變色素具有較好的清除效果，在最優純化效果條件下色素清除率為92%。

對金銀花POD最適溫度和熱穩定性研究表明酶的最適溫度30℃，該酶在10～40 ℃范圍內穩定性較好，相對酶活力在75%以上，當溫度高于40 ℃酶活力下降迅速。對最適pH值和pH值穩定性研究表明酶的最適pH值為5，酶在pH值小于4的酸性環境中酶活力下降迅速，pH值在4～7范圍內有較好的穩定性。當H2O2溶液濃度一定時，酶對愈創木酚的Km值為8.12 mmol/L，vmax值為1.71 mmol/（min·L）。當愈創木酚溶液濃度一定時，H2O2溶液的Km值為0.822 mmol/L，vmax值為1.38 mmol/（min·L）。H2O2溶液對于金銀花POD的親和能力大于愈創木酚。金銀花POD與底物的親和力由強到弱依次是鄰苯三酚、鄰苯二酚、聯甲氧基苯胺、愈創木酚。Ca2＋、Cu2＋、Zn2＋對金銀花POD有一定激活作用，Mg2＋、Mn2＋、檸檬酸、抗壞血酸、L-半胱氨酸、亞硫酸鈉、偏重亞硫酸鈉、十二烷基磺酸鈉對金銀花POD均有一定抑制作用。

參考文獻：

[1] 王清, 朱萱萱, 張赤兵, 等. 金銀花提取物抗菌作用的實驗研究[J]. 中國醫藥導刊, 2008, 10(9): 1428-1430. DOI:10.3969/j.issn.1009-0959.2008.09.068.

[2] 康旭, 李冬生, 鄧川, 等. 金銀花提取液抑菌活性的研究[J]. 安徽農業科學,2010, 38(27): 14935-14936. DOI:10.3969/j.issn.0517-6611.2010.27.046.

[3] RAHMAN A, KANG S C. In vitro control of food-borne and food spoilage bacteria by essential oil and ethanol extracts of Lonicera japonica Thunb.[J]. Food Chemistry, 2009, 116(3): 670-675.DOI:10.1016/j.foodchem.2009.03.014.

[4] 關炳峰, 譚軍, 周志娣. 金銀花提取物的抗氧化作用與其綠原酸含量的相關性研究[J]. 食品工業科技, 2007, 28(10): 127-129.DOI:10.3969/j.issn.1002-0306.2007.10.037.

[5] 楊利軍, 田迪英. 11 種中草藥抗氧化活性與黃酮含量相關性研究[J].食品工業科技, 2008(1): 119-120; 123.

[6] 馬雪梅, 吳朝峰. 河南省金銀花產業發展現狀及思路[J]. 湖北農業科學,2012, 51(6): 1185-1188. DOI:10.3969/j.issn.0439-8114.2012.06.030.

[7] 石鉞, 石任兵, 陸蘊如. 我國藥用金銀花資源、化學成分及藥理研究進展[J]. 中國藥學雜志, 1999, 34(11): 724-727. DOI:10.3321/j.issn:1001-2494.1999.11.002.

[8] 羅磊, 郭曉園. 金銀花中綠原酸的研究進展[J]. 農產品加工,2008(8): 60-62. DOI:10.3969/j.issn.1671-9646-C.2008.08.037.

[9] 侯爽爽, 羅磊. 金銀花熱風干燥過程中顏色的劣變機理[J]. 農產品加工學刊, 2010(10): 63-65. DOI:10.3969/j.issn.1671-9646(X).2010.10.019.

[10] PALMA-OROZCO G, ORTIZ-MORENO A, DORANTES-ALVAREZ L, et al. Purification and partial biochemical characterization of polyphenol oxidase from mamey (Pouteria sapota)[J]. Phytochemistry,2011, 72: 82. DOI:10.1016/j.phytochem.2010.10.011.

[11] DENNISON C, LOVRIEN R. Three phase partitioning: concentration and purification of proteins[J]. Protein Expression and Purification 1997, 11(2): 149-161. DOI:10.1006/prep.1997.0779.

[12] SAGU S T, NSO E J, HOMANN T, et al. Extraction and purification of beta-amylase from stems of Abrus precatorius by three phase partitioning[J]. Food Chemistry, 2015, 183: 144-153. DOI:10.1016/j.foodchem.2015.03.028.

[13] 魏勝華, 錢偉, 孟娜, 等. 三相法從苦杏仁中分離制備β-葡萄糖苷酶[J].精細化工, 2016(5): 530-535. DOI:10.13550/j.jxhg.2016.05.009.

[14] ZER B, AKARDERE E, ELEM E B, et al. Three-phase partitioning as a rapid and efficient method for purification of invertase from tomato[J]. Biochemical Engineering Journal, 2010, 50(3): 110-115.DOI:10.1016/j.bej.2010.04.002.

[15] GAGAOUA M, BOUCHERBA N, BOUANANE-DARENFED A, et al. Three-phase partitioning as an efficient method for the purification and recovery of ficin from Mediterranean fig (Ficus carica L.) latex[J].Separation and Purification Technology, 2014, 132(20): 461-467.DOI:10.1016/j.seppur.2014.05.050.

[16] VEAL M D, RATHOD V K. Three phase partitioning a novel technique for purification of peroxidase from orange peels (Citrus sinenses)[J]. Food and Bioproducts Processing, 2015, 94: 284-289.DOI:10.1016/j.fbp.2014.03.007.

[17] VARAKUMAR S, UMESH K V, SINGHAL R S. Enhanced extraction of oleoresin from ginger (Zingiber officinale) rhizome powder using enzyme-assisted three phase partitioning[J]. Food Chemistry, 2017,216: 27-36. DOI:10.1016/j.foodchem.2016.07.180.

[18] VETAL M D, SHIRPURKAR N D, RATHOD V K. Three phase partitioning coupled with ultrasound for the extraction of ursolic acid and oleanolic acid from Ocimum sanctum[J]. Food and Products Processing, 2014, 92(4): 402-408. DOI:10.1016/j.fbp.2013.09.002.

[19] RACHANA C R, JOSE V L. Three phase partitioning-a novel protein purification method[J]. International Journal of Chemtech Research,2014, 6(7): 3467-3472.

[20] 孫潔. 金銀花干燥過程與酶及活性成分的相關性研究[D]. 濟南: 山東農業大學, 2014: 16.

[21] BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry, 1976, 72: 248-254. DOI:10.1006/abio.1976.9999.

[22] 錢博. 乳粉蛋白質快速檢測方法研究[D]. 杭州: 浙江大學, 2006: 23.

[23] 羅磊, 康新艷, 朱文學, 等. 熱泵遠紅外聯合干燥金銀花的工藝優化及品質控制[J]. 食品科學, 2016, 37(18): 6-12. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618002.

[24] 苑艷輝. 豆豉纖溶酶發酵條件的優化及雙水相萃取工藝的研究[D].無錫: 江南大學, 2006: 48.

[25] 劉娜娜. 金銀花中多酚氧化酶和過氧化物酶的分離純化及特性研究[D]. 合肥: 安徽農業大學, 2013: 23-24.

[26] 張世雄, 程立均. 一種改進的糖蛋白染色鑒別方法的建立[J]. 中國生物制品學雜志, 2012(1): 108-110.

[27] 徐芝勇. 大豆過氧化物酶的酶學特性與應用研究[D]. 杭州: 浙江大學, 2006: 31-32.

[28] 鄧波, 鄧放明. 藕帶過氧化物酶的分離純化及酶學性質[J]. 食品與機械, 2016, 32(2): 20-23. DOI:10.13652/j.issn.1003-5788.2016.02.005.

[29] 許可. 海芋過氧化物酶的分離純化及其性質研究[D]. 廣州: 華南農業大學, 2010: 5-15.

[30] 王玉琪, 巫光宏, 林先豐, 等. 多糖和糖蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳染色方法的改進[J]. 植物生理學通訊, 2009, 45(2): 169-172.DOI:10.13592/j.cnki.ppj.2009.02.007.

Purification of Peroxidase from Lonicera japonica Thunb. by Three Phase Partitioning and Enzymatic Properties

LUO Lei, DONG Jinlong, ZHU Wenxue*, XUE Yihan, GUAN Ningning, ZHANG Kuan, JI Qinghua
(College of Food and Bioengineering, Hennan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China)

Three phase partitioning was used to extract and purify peroxidase (POD) from Lonicera japonica Thunb. The optimal conditions were obtained as follows: pH 5.60, ammonium sulfate concentration 39.49 g/100 mL, and ratio of crude extract to t-butanol (V/V), 1:1.38. Under these conditions, the activity recovery was 87.64% with a purification factor of 5.849, and the specific activity of purified peroxidase was 1 021.6 U/mg. By using three phase partitioning, 92% pigment was removed. Enzymatic properties revealed that the optimum temperature for this enzyme was 30 ℃ and the optimum pH was 5. The enzyme was stable in the temperature range of 10-40 ℃ and in the pH range of 4-7. In the presence of both guaiacol and H2O2, Michaelis constants (Km) and maximum reaction rates (vmax) of the enzyme were 8.12 mmol/L and 1.71 mmol/(min·L) for guaiacol, and 0.822 mmol/L and and 1.38 mmol/(min·L) for H2O2at a fixed concentration of the other substrate, respectively. The affinity of the enzyme to various substrates was in the decreasing order: pyrogallol ＞catechol ＞ bimethoxy aniline ＞ guaiacol. The peroxidase activity was activated by Ca2+, Cu2+and Zn2+but inhibited by Mg2+,Mn2+, citric acid, ascorbic acid, L-cysteine, sodium sulphite and sodium metabisulphite.

Lonicera japonica Thunb.; peroxidase; three phase partitioning; enzymatic properties

10.7506/spkx1002-6630-201724004

TS201.2

A

1002-6630（2017）24-0020-08

羅磊, 董金龍, 朱文學, 等. 金銀花過氧化物酶的三相分離純化及酶學性質[J]. 食品科學, 2017, 38(24): 20-27.

10.7506/spkx1002-6630-201724004. http://www.spkx.net.cn

LUO Lei, DONG Jinlong, ZHU Wenxue, et al. Purification of peroxidase from Lonicera japonica Thunb. by three phase partitioning and enzymatic properties[J]. Food Science, 2017, 38(24)∶ 20-27. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724004. http∶//www.spkx.net.cn

2016-11-15

國家自然科學基金聯合基金項目（U1304330）

羅磊（1976—），男，教授，博士，研究方向為食品營養成分與活性物質。E-mail：13623896431@139.com

*通信作者：朱文學（1967—），男，教授，博士，研究方向為食品加工與功能食品。E-mail：zwx@haust.edu.cn