液態發酵對西農9940苦蕎主要成分及其抗氧化活性的強化作用

汪雪嬌，孫旭春，蘭永麗，李騰宇，師 帥，楊 霞，馮憲超,*，李志西,*

液態發酵對西農9940苦蕎主要成分及其抗氧化活性的強化作用

汪雪嬌1，孫旭春1，蘭永麗1，李騰宇1，師 帥2，楊 霞3，馮憲超1,*，李志西1,*

（1.西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.山西杏花村汾酒集團有限責任公司，山西 汾陽 032200；3.成都市青白江區市場和質量監督管理局，四川 成都 610300）

利用液態發酵技術富集苦蕎渣中的營養物質，測定分析西農9940苦蕎粉及其經液態發酵后所得苦蕎渣的蛋白質、粗脂肪、礦物質、粗纖維、灰分、總黃酮、總酚含量以及氨基酸和脂肪酸組成，并以總還原能力、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl，DPPH）自由基和2,2’-聯氮-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽自由基（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate) radical，ABTS＋·）清除能力為指標對抗氧化活性進行綜合評價。結果表明苦蕎渣的蛋白質、粗脂肪、灰分、粗纖維、礦物質含量均顯著提高，且液態發酵過程不改變苦蕎粉的氨基酸及脂肪酸組成。苦蕎渣的總酚含量為1 343.22 mg/100 g，顯著高于苦蕎粉559.76 mg/100 g，總黃酮含量為2 186.06 mg/100 g，顯著低于苦蕎粉2 464.10 mg/100 g，蘆丁和槲皮素含量的測定也進一步證明發酵后苦蕎渣的總黃酮含量顯著降低，但其總還原能力、DPPH自由基和ABTS＋·清除能力顯著高于苦蕎粉，說明經過發酵后苦蕎渣的抗氧化能力更強。

苦蕎粉；發酵；多酚；黃酮；抗氧化活性

苦蕎是一種重要的蓼科雜糧作物，主要種植在中國西南部，如云南、四川、貴州[1]，種植面積約為2.5×105～3×105hm2，此外，在山西、陜西、重慶、寧夏、甘肅也有分布。苦蕎富含多種營養成分，其蛋白質含量顯著高于水稻、小麥、高粱、小米和玉米，且氨基酸種類豐富，其中賴氨酸含量高達64 mg/g，為大米的2.7 倍。苦蕎富含多不飽和必需脂肪酸（亞油酸），礦物質（K、Mg），VB1、VC、VE和D-手性肌醇[2-3]。此外，研究發現，苦蕎中含有大量黃酮類化合物，如蘆丁、槲皮素等[4-6]，具有降膽固醇、抗氧化和清除自由基活性，以及抑制脂肪堆積、抗高血壓、抗炎、減少結腸癌發生等作用[7]。近年來，越來越多的人重新開始關注苦蕎的利用[8]。其中，通過發酵技術生產富含功能性成分的苦蕎酒是常用的手段之一。在發酵過程中，淀粉最終被利用產生酒精，一些生物活性物質，例如類黃酮等也隨之溶于酒中，但是大部分的物質，例如蛋白質、粗纖維、大部分糖類、多酚類物質卻富集于苦蕎渣中，得不到充分的利用[9]。

中國是白酒的生產和消費大國，據統計，2013年中國白酒年產量達到1 200萬 t，而每年產生的酒渣達到2 500萬 t左右[10]。大量的廢棄酒渣轉化利用不足造成了資源的浪費。目前，酒渣的再利用途徑主要包括生產有機肥、發酵飼料、食用菌、燃料棒、活性炭和食醋等[10-11]。本研究旨在利用液態發酵技術富集苦蕎渣中的營養物質，為后續提取苦蕎渣蛋白、多酚類等物質提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西農9940由西北農林科技大學農學院提供，樣品經除雜精選后，粉碎，過40 目篩，備用。

糖化酶（酶活力100 000 U/g） 湖南鴻鷹翔生物股份有限公司；液化酶（酶活力20 000 U/mL） 湖南省津市新型發酵責任有限公司；蘆丁、槲皮素、沒食子酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipheny1-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-聯氮-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS） 美國Sigma公司；甲醇、氯化鈣、無水乙醚、濃硫酸、濃鹽酸、硫酸鉀、硫酸銅、茚三酮、苯酚、氫氧化鈉、氫氧化鉀、正辛醇、亞硫酸鈉、氫氧化鈉、氯化鉀、冰醋酸、磷酸、磷酸二氫鉀、無水乙醇、無水碳酸鈉、抗壞血酸、K2S2O8均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

T-203電子天平 美國丹佛公司；FW100高速萬能粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司；202-00干燥箱 北京化玻聯醫療器械有限公司；150A恒溫培養箱 江蘇常州華普達教學儀器有限公司；TD5A臺式離心機 湖南凱達科學儀器有限公司；WYT-4手持糖度計 福建省泉州光學儀器廠；HH-S4數顯恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；DS20凱氏定氮儀 瑞典FOSS公司；Solaar M6原子吸收分光光度計 美國熱電公司；AFS-1201雙道原子熒光分光光度計 北京海光公司；UV-1700紫外-可見分光光度計 日本京都島津制作所；KH5200B超聲波清洗器 昆山禾創超聲儀器有限公司；LC-15C高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 苦蕎渣的制備

液化：苦蕎粉和水按1∶7（kg/L）混合，加入原料量2‰的CaCl2，采用兩段加酶法加入液化酶，液化階段以液化醪與碘液反應不變藍為終點；糖化：將液化醪降溫至60 ℃，加入糖化酶，60～62 ℃條件下糖化4～6 h，用手持糖度計測定糖化醪糖度；酒精發酵：將活性干酵母（添加量為3‰，以苦蕎粉干質量計）用2%的糖水活化，加入已降至35 ℃的糖化醪中，35 ℃發酵4 d；離心：將發酵所得的酒，用高速離心機3 900 r/min離心10 min，倒掉上清液，取出沉淀，即得苦蕎渣；干燥：50 ℃條件下烘干苦蕎渣24 h，粉碎后儲存于4 ℃冰箱中，備用。

1.3.2 主要成分測定

參考國標法，測定苦蕎粉及發酵后得到的苦蕎渣的水分、蛋白質、粗脂肪、礦物質、粗纖維、灰分含量以及氨基酸組成、脂肪酸組成。

1.3.3 體外抗氧化提取液的制備

準確稱取苦蕎粉及苦蕎渣樣品各1 g，置于50 mL三角瓶中，各加入體積分數80%乙醇溶液20 mL混勻，75 ℃超聲輔助提取20 min，3 800 r/min離心10 min，取出上清液，沉淀重復以上操作，取出并合并2 次得到的上清液，定容到50 mL容量瓶中，密封冷藏保存，備用[12]。

1.3.4 總黃酮含量測定

根據NaNO3-AlCl3法[13-14]稍作修改。以蘆丁質量濃度X（mg/mL）為橫坐標，于波長510 nm處測定吸光度Y為縱坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程：Y=12.599X＋0.045 9（R2=0.999 5）。根據標準曲線計算樣品提取液的總黃酮含量，結果以每100 g干基樣品中蘆丁當量毫克數表示（mg/100 g）。

1.3.5 總酚含量測定

采用Folin-Ciocalteu法測定總酚含量[15]，以沒食子酸質量濃度C（mg/mL）為橫坐標，于波長760 nm處測定吸光度Y為縱坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程：Y=123.48X＋0.130 4（R2=0.998 5）。根據標準曲線計算樣品提取液的總酚含量，結果以每100 g干基樣品中沒食子酸當量毫克數表示（mg/100 g）。

1.3.6 總還原能力測定

參照范金波等[14]的鐵氰化鉀法。以VC質量濃度X（mg/mL）為橫坐標，于波長700 nm處測定吸光度Y為縱坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程：Y=0.092 1X＋0.017 8（R2=0.998 0）。根據標準曲線計算樣品提取液的總還原能力，以100 g干基樣品中所含VC當量毫克數表示（mg/100 g）。

1.3.7 DPPH自由基清除能力測定

參照張小娜等[16]方法，稍作修改。以VC質量濃度X（mg/mL）為橫坐標，DPPH自由基清除率Y（%）為縱坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程：Y=6.576 6X-1.355 3（R2=0.997 9）。取100 μL稀釋4 倍的樣品提取液，按照制作標準曲線同樣的步驟測定樣品提取液的吸光度，計算樣品提取液的DPPH自由基清除率，樣品的自由基清除能力以100 g干基樣品中所含VC當量毫克數表示（mg/100 g）。DPPH自由基清除率按公式（1）計算：

式中：A樣品為樣品提取液在波長517 nm處的吸光度；A空白為提取樣品的溶劑80%乙醇溶液在波長517 nm處的吸光度。

1.3.8 ABTS＋·清除能力測定

參照張小娜等[16]的方法，稍作修改。以VC質量濃度X（mg/mL）為橫坐標，ABTS＋·清除率Y為縱坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程：Y=5.105 6X-1.657 8（R2=0.998 4）。取100 μL稀釋一定倍數的樣品提取液，按照制作標準曲線的步驟測定樣品提取液的吸光度，計算樣品提取液的ABTS＋·清除率，樣品的自由基清除能力以100 g干基樣品中所含VC當量毫克數表示（mg/100 g）。ABTS＋·清除率按公式（2）計算：

式中：A樣品為樣品提取液在波長734 nm處的吸光度；A空白為提取樣品的溶劑80%乙醇溶液在波長734 nm處的吸光度。

1.3.9 高效液相色譜測定提取液中蘆丁、槲皮素含量

采用高效液相色譜法作定量分析。色譜柱：Shim-Pack VP-ODS C18（150 nm×4.6 mm，5 μm）；進樣量10 μL，柱溫25 ℃，流速1.0 mL/min；流動相為0.5%乙酸-甲醇溶液（35∶65，V/V），檢測器波長361 nm；樣品進樣前經過0.5 μm微孔膜過濾，根據出峰時間和峰面積對樣品中的蘆丁、槲皮素進行定性、定量分析。

1.4 數據處理

采用SPSS 20.0軟件和Excel 2010軟件對實驗數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 苦蕎粉及苦蕎渣主要成分比較分析

表1 苦蕎粉與苦蕎渣中主要營養成分的測定結果Table 1 Main nutritional components of tartary buckwheat flour and tartary buckwheat residue

苦蕎酒中蛋白質質量濃度為0.085 mg/mL，說明發酵后只有極少量的蛋白質等成分溶于酒中，而大部分富集在了苦蕎渣中。因此，分別對苦蕎粉及苦蕎渣的水分、蛋白質、粗脂肪、礦物質、粗纖維和灰分進行測定，如表1所示。苦蕎粉的水分質量分數為11.33%，而苦蕎渣的水分質量分數為5.92%，本研究中其他成分的測定結果均以干質量計，水分含量不會對其造成影響。

苦蕎粉蛋白質質量分數為10.97%，高于王敏等[17]的研究結果（苦蕎蛋白質質量為9.34%）。發酵后苦蕎渣的蛋白質質量分數為40.63%，顯著高于苦蕎粉（3.7 倍），原因是在液態發酵過程中苦蕎粉中的淀粉被液化酶（α-淀粉酶）水解生成糊精，再經糖化酶（葡萄糖淀粉酶）糖化生成葡萄糖，進而被酵母利用產生酒精，從而對蛋白質等成分起到濃縮作用[18-19]。為了探究苦蕎發酵前后氨基酸含量和組成的變化，利用氨基酸分析儀測定氨基酸含量變化。由表2可以看出，谷氨酸含量最高，其次是天冬氨酸和精氨酸，與郭曉娜[20]和張麗君[21]等測得的苦蕎蛋白質中非必需氨基酸含量較高的是谷氨酸和天冬氨酸的結果相一致。發酵后苦蕎渣中的氨基酸含量顯著增加，并且發酵前后各氨基酸在總氨基酸中所占的百分比基本相同，說明液態發酵過程沒有改變苦蕎蛋白質的氨基酸組成和配比。苦蕎蛋白質的18 種氨基酸組成更加均衡合理、配比適宜，特別是蛋氨酸、谷氨酸、組氨酸、賴氨酸、精氨酸和天冬氨酸含量較為豐富[14]。

表2 苦蕎粉與苦蕎渣中氨基酸的質量分數Table 2 Amino acid composition of tartary buckwheat flour and tartary buckwheat residue

表3 苦蕎粉與苦蕎渣中脂肪酸的質量分數Table 3 Fatty acid composition of tartary buckwheat flour and tartary buckwheat residue

由表1可知，西農9940苦蕎粉粗脂肪質量分數為4.53%，其含量略高于Zhu Fan[8]報道的苦蕎粗脂肪含量（2.8%），這可能和苦蕎的遺傳性、生育特性以及生長環境如地理位置和生長季節有關[22]。苦蕎渣粗脂肪質量分數為12.65%，是苦蕎粉脂肪含量的2.8 倍，同蛋白質一樣，液態發酵過程對粗脂肪起到了富集作用。從表3可以看出，在苦蕎發酵前后均能檢測到5 種脂肪酸，其質量分數由高到低依次是亞油酸＞油酸＞棕櫚酸＞α-亞麻酸＞硬脂酸，與郎桂常[23]的測定結果相一致。8 個樣品脂肪酸中不飽和脂肪酸的含量豐富，其中亞油酸和油酸占總脂肪酸含量的85.5%，遠高于小麥粉中兩者的含量（64%左右）[17]。不飽和脂肪酸高度穩定，具有抗氧化作用。發酵前后樣品中各脂肪酸占總脂肪酸百分比差異不大，說明發酵過程基本沒有改變苦蕎的脂肪酸組成。

表4 苦蕎粉與苦蕎渣中礦質元素的含量Table 4 Mineral element composition of tartary buckwheat flour and tartary buckwheat residuemg/kg

由表4可知，苦蕎粉和苦蕎渣中富含多種礦質營養元素。其中含量最多的常量元素為K，其次為Ca，最低的為Mg，苦蕎粉和苦蕎渣中K含量分別為3 740.92、5 321.19 mg/kg兩者均遠高于小麥粉中K含量1 950 mg/kg和玉米粉中K含量2 700 mg/kg[24]。含量最高的微量元素為Fe，其次為Zn，最低的為Mn，苦蕎粉和苦蕎渣中Fe含量分別為101.1、827.19 mg/kg，遠高于禾谷類的小麥粉（42 mg/kg）、大米（24 mg/kg）和玉米（16 mg/kg），相對于其他主糧，苦蕎中鐵含量豐富，能充分保證人體制造血紅素對鐵元素的需要，這對于防止缺鐵性貧血具有重要的作用。發酵后得到的苦蕎渣中礦物質的總含量均顯著大于苦蕎粉中礦物質總含量，發酵過程使礦物元素在苦蕎渣中富集，苦蕎渣可添加于動物飼料中作為必需礦物元素的一個良好來源。

由表1可知，西農9940苦蕎粉的灰分質量分數為2.50%，而苦蕎渣的灰分質量分數為5.40%。苦蕎渣的粗纖維質量分數為3.82%，高于小麥和玉米中粗纖維含量，是相應苦蕎粉（1.40%）的2.7 倍。通過液態發酵，苦蕎粉中的礦質元素、粗纖維富集在了苦蕎渣中。食用蕎麥纖維具有降血脂特別是降低血清總膽固醇及低密度脂蛋白膽固醇的功效，同時，在降低血糖和改善糖耐量等方面也具有很好的作用[19-21]。因此，苦蕎渣可作為富含膳食纖維的食物來源。

2.2 抗氧化能力分析

由圖1A可看出，西農9940苦蕎粉中總黃酮含量為2 464.10 mg/100g，測定結果與Liu Benguo等[25]的研究中苦蕎籽粒黃酮質量分數高達2.42%相接近。苦蕎渣中總黃酮含量分別為2 186.06 mg/100 g，低于苦蕎粉中總黃酮的含量。原因可能是發酵過程中，苦蕎中的黃酮類物質如蘆丁、山柰酚等少量溶于苦蕎酒中造成了總黃酮含量的減少。表5進一步表明，發酵后得到的苦蕎渣中蘆丁含量遠低于苦蕎粉，而槲皮素含量大大增加，蘆丁的減少與蘆丁降解酶有關，苦蕎籽粒中存在天然的高活性β-糖苷酶-蘆丁降解酶是一種專一性酶，主要作用于蘆丁對其他黃酮不起作用，在高水分活度條件下β-糖苷酶-蘆丁降解酶激活迅速將蘆丁分解為槲皮素和蕓香糖，而在液化、糖化、發酵過程中都有大量的水參與，所以蘆丁發生降解，槲皮素含量增加[26]。然而，苦蕎粉的總還原能力、DPPH自由基清除能力和ABTS＋·清除能力均小于苦蕎渣，這是因為黃酮含量多少與蘆丁含量呈一一對應關系，而蘆丁的含量與抗氧化活性并不成正比[27]。槲皮素的抗氧化性強于蘆丁，發酵后苦蕎渣中槲皮素含量大大增加，所以苦蕎渣的抗氧化能力強于苦蕎粉[2]。

由圖1B可以看出，西農9940苦蕎粉中總酚含量為559.76 mg/100 g，而發酵后的苦蕎渣中總酚含量為1 343.22 mg/100 g，無論是苦蕎粉還是苦蕎渣，總酚含量明顯高于玉米、小麥、小米、大米等谷物總酚含量[28]。發酵后得到的苦蕎渣中總酚含量顯著大于發酵前苦蕎粉，液態發酵過程使多酚類物質在苦蕎渣中富集，苦蕎渣富含植物多酚，是制備植物多酚的一個優良來源。

如圖1C所示，西農9940苦蕎粉的總還原能力為1 854.65 mg/100 g，發酵后得到的苦蕎渣總還原能力為2 576.83 mg/100 g，顯著高于苦蕎粉的總還原能力。一種化合物具備抗氧化能力的最明顯體現是該化合物的還原能力[29]，由實驗結果可以看出，苦蕎渣還原能力強于苦蕎粉，因此苦蕎渣具有更強的抗氧化能力。

由圖1D可以看出，西農9940苦蕎粉的DPPH自由基的清除能力為2 115.05 mg/100 g，顯著低于發酵后苦蕎渣的DPPH自由基清除能力（2 782.70 mg/100 g）。說明它們降低羥自由基、烷自由基或過氧自由基有效濃度、打斷脂質過氧化鏈反應的作用更大[30]。

由圖1E可以看出，發酵前西農9940苦蕎粉的ABTS＋·清除能力為1 667.28 mg/100 g，顯著低于發酵后得到的苦蕎渣對ABTS＋·的清除能力（2 823.60±99.18） mg/100 g。苦蕎渣對ABTS＋·的清除能力為苦蕎粉的1.7 倍，說明苦蕎渣具有更強的體外抗氧化能力。

圖1 苦蕎粉與苦蕎渣抗氧化能力比較分析Fig. 1 Comparative analysis of antioxidant capacity of tartary buckwheat flour and tartary buckwheat residue

表5 高效液相色譜測定苦蕎粉和苦蕎渣中蘆丁、槲皮素含量Table 5 Rutin and quercetin contents of tartary buckwheat flour and tartary buckwheat residue mg/100 g

3 結 論

本研究利用苦蕎粉經糖化、液化、酒精發酵、離心、干燥得到苦蕎渣，在整個液態發酵過程中，酵母只利用了淀粉液化所得的葡萄糖，其他成分如蛋白質、粗脂肪、礦物質、粗纖維、酚類物質并沒得到充分的利用，而是富集在了苦蕎渣中，所以苦蕎渣起到了濃縮營養物質的作用。相對于發酵前的苦蕎粉，發酵后得到的苦蕎渣中蛋白質、粗脂肪、礦物質（如K、Ca、Fe、Cu）、粗纖維含量均顯著增加，且脂肪酸組成和氨基酸組成未發生變化。結果顯示，發酵后苦蕎渣中的總酚含量顯著增加，且總還原能力、DPPH自由基和ABTS＋·清除能力均高于苦蕎粉，說明苦蕎渣的抗氧化能力更強，而總黃酮含量顯著降低，高效液相色譜結果也顯示發酵后蘆丁減少、槲皮素增加，但總黃酮含量依然低于發酵前苦蕎粉黃酮含量。

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Liquid-State Fermentation Increases the Main Components and Antioxidant Activity of Xinong 9940 Tartary Buckwheat

WANG Xuejiao1, SUN Xuchun1, LAN Yongli1, LI Tengyu1, SHI Shuai2, YANG Xia3, FENG Xianchao1,*, LI Zhixi1,*
(1. College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China;2. Shanxi Xinghuacun Fenjiu Group Co. Ltd., Fenyang 032200, China;3. Organization Department of CPC Chengdu Qingbaijiang District Committee, Chengdu 610300, China)

In order to enrich nutrients in tartary buckwheat residue by liquid-state fermentation, the contents of protein, crude fat, minerals, crude fiber, ash, total flavonoids, total phenolics, amino acid composition and fatty acid composition in Xinong 9940 tartary buckwheat flour and its residue left after being subjected to liquid-state fermentation were analyzed and the antioxidant activity was evaluated by total reducing capacity, 1,1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl (DPPH) radical scavenging,2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate) (ABTS) radical scavenging assays. The results showed that protein,crude fat, ash, crude fiber, minerals contents of buckwheat residue increased significantly after fermentation. Furthermore,liquid-state fermentation did not change the amino acid and fatty acid composition of buckwheat flour. The total phenolic content of tartary buckwheat residue was 1 343.22 mg/100 g, which was significantly higher than that of buckwheat flour(559.76 mg/100 g), and the total flavonoids content was 2 186.06 mg/100 g, which was significantly lower than that of buckwheat flour (2 464.10 mg/100 g). Moreover, the contents of the flavonoids rutin and quercetin significantly decreased after fermentation. However, the total reducing capacity, DPPH radical scavenging capacity, and ABTS+· scavenging ability were significantly higher than those of tartary buckwheat flour. These results indicated that tartary buckwheat residue showed stronger antioxidant after fermentation.

tartary buckwheat flour; fermentation; polyphenols; flavonoids; antioxidant activity

2016-11-12

國家自然科學基金面上項目（31771991）；國家自然科學基金青年科學基金項目（31601497）；

2016年度第59批中國博士后科學基金面上項目（2016M591857）；

國家肉品質量安全控制工程技術研究中心開放基金項目（M2015K06；M2016K01）；

中央高校基本科研業務費專項（2452015062）

汪雪嬌（1990—），女，碩士，研究方向為糧食工程與發酵技術創新。E-mail：wangxuejiao173@163.com

*通信作者：馮憲超（1981—），男，副教授，博士，研究方向為食品蛋白質結構與功能。E-mail：fengxianchao1@hotmail.com

李志西（1958—），男，教授，博士，研究方向為糧食工程與發酵技術創新。E-mail：lizhixi@nwsuaf.edu.cn

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724011

TS201.2

A

1002-6630（2017）24-0068-06

汪雪嬌, 孫旭春, 蘭永麗, 等. 液態發酵對西農9940苦蕎主要成分及其抗氧化活性的強化作用[J]. 食品科學, 2017,38(24)∶ 68-73. DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724011. http∶//www.spkx.net.cn

WANG Xuejiao, SUN Xuchun, LAN Yongli, et al. Liquid-state fermentation increases the main components and antioxidant activity of Xinong 9940 tartary buckwheat[J]. Food Science, 2017, 38(24)∶ 68-73. (in Chinese with English abstract)DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724011. http∶//www.spkx.net.cn