茶葉籽油酚類化合物分離純化組分分析及HepG2細(xì)胞增殖活性抑制

王俐娟，梁杏秋，王曉琴,2,*

茶葉籽油酚類化合物分離純化組分分析及HepG2細(xì)胞增殖活性抑制

王俐娟1，梁杏秋1，王曉琴1,2,*

（1.華僑大學(xué)化工學(xué)院，福建 廈門 361021；2.華僑大學(xué) 油脂及天然產(chǎn)物研究所，福建 廈門 361021）

以茶葉籽油為材料，采用60%甲醇溶液提取酚類化合物，經(jīng)硅膠柱層析后，選取Sephadex LH-20柱對(duì)酚類化合物進(jìn)行分離純化，并采用反相高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)技術(shù)分析純化后酚類化合物的組分。以HepG2細(xì)胞為供試細(xì)胞，結(jié)合主成分分析，初步確定茶葉籽油中具有抑制癌細(xì)胞活性的酚類化合物。結(jié)果表明，Sephadex LH-20柱分離的3 個(gè)組分中，F(xiàn)r1組分所含5 種化合物主要為兒茶素類或黃酮類，其中兒茶素類占62.60%；Fr2組分主要含酚酸類及黃酮類；Fr3組分中黃酮類占78.70%。Fr1、Fr2、Fr3組分抑制HepG2細(xì)胞增殖的IC50值分別為1.76%、16.24%及12.35%。對(duì)Fr1、Fr2、Fr3組分中酚類化合物及各組分IC50值進(jìn)行主成分分析，表明茶葉籽油中兒茶素、蘆丁為主要HepG2細(xì)胞增殖活性抑制成分。

茶葉籽油；酚類化合物；分離純化；HepG2；抗增殖

茶葉籽油來(lái)源于山茶屬植物茶（Camellia sinensis O.Ktze.）的種子，其油脂包括多種人體必需脂肪酸、生育酚、植物甾醇和酚類化合物等活性組分[1-2]，是我國(guó)衛(wèi)生部認(rèn)定的新資源食品。目前對(duì)茶葉籽油酚類化合物的研究資料主要集中在總含量及主要組分的分離，對(duì)茶葉籽油中酚類化合物的組成及生物活性研究報(bào)道較少。Fazel等[3]采用高效液相色譜技術(shù)對(duì)伊朗南方地區(qū)茶葉籽油酚類化合物進(jìn)行分析鑒定，共鑒定出8 種酚類化合物。本課題組測(cè)定了28 種不同品種茶葉籽毛油中茶多酚含量，得出其含量達(dá)16.7～529.3 mg沒(méi)食子酸/kg，同時(shí)對(duì)茶葉籽油微量活性物質(zhì)與抗氧化作用進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)茶葉籽油酚類化合物具有強(qiáng)抗氧化活性[1,4]。

研究報(bào)道表明氧化是產(chǎn)生慢性疾病如癌癥、老化的主要原因之一，具有強(qiáng)抗氧化活性的多酚類化合物，通常具有抑制腫瘤作用[5-6]。Raquel等[7]通過(guò)橄欖油中酚類化合物對(duì)結(jié)腸腺癌Caco-2/TC7細(xì)胞增殖抑制作用研究，表明橄欖油中酚類化合物可使Caco-2/TC7細(xì)胞阻滯在G0/G1和S期，誘導(dǎo)Caco-2/TC7細(xì)胞凋亡，并提高對(duì)致癌物的解毒作用。Maurya等[8]研究表明槲皮素可誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2中p53因子從而抑制磷脂酰肌醇-3激酶和蛋白激酶C發(fā)揮人肝癌HepG2細(xì)胞的抑制增殖作用。同時(shí)有報(bào)道指出酚類化合物可參與表觀遺傳機(jī)制如DNA甲基化、蛋白質(zhì)組乙酰化、miRNA的調(diào)控，具有廣泛臨床應(yīng)用價(jià)值[9-10]。茶葉提取物含多種天然酚類化合物，其通過(guò)干擾相關(guān)酶活性及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制癌細(xì)胞增殖機(jī)制已有報(bào)道[11-12]，而茶葉籽油因與茶葉同源，富含天然多酚，它潛在的生理活性作用仍有待探索。本實(shí)驗(yàn)對(duì)茶葉籽油酚類化合物進(jìn)行分離純化，采用反相高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)技術(shù)分析組成及含量，結(jié)合HepG2供試細(xì)胞抗增殖實(shí)驗(yàn)和主成分分析，對(duì)其抗腫瘤細(xì)胞增殖活性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

茶葉籽油自制：采摘成熟茶葉籽自然晾干后冷榨。

沒(méi)食子酸、羥基酪醇、4-羥基苯乙酸、咖啡酸、苯甲酸、肉桂酸、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)阿拉丁生物科技有限公司；表兒茶素沒(méi)食子酸酯、兒茶素、表兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、槲皮素、山柰酚標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司。

粗孔（ZCX-Ⅱ）硅膠 青島裕民源硅膠試劑廠；LH-20葡聚糖凝膠 美國(guó)GE公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶 美國(guó)Hyclone公司；3-（4,5-二甲基-2-噻唑基）-2,5-二苯基溴化四唑（methylthiazolyldiphenyltetrazolium bromide，MTT）試劑 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；人肝癌細(xì)胞（HepG2） 中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

TDL-60B臺(tái)式低速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；Multlskan酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司；HF90型CO2培養(yǎng)箱上海力申科學(xué)儀器有限公司；LC-20高效液相色譜儀日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取沒(méi)食子酸、羥基酪醇等14 種標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，分別用10 mL色譜純甲醇定容，得到各標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取1.0 mL上述標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇定容至50 mL，得多酚混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)將混合標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇稀釋成不同質(zhì)量濃度梯度。用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，用于色譜定性和定量分析。

1.2.2 樣品前處理

參照橄欖油和山茶油[13-16]的前處理方法，得到茶葉籽油多酚化合物粗提液，再依次用硅膠柱和Sephadex LH-20柱分離純化其中的多酚化合物。準(zhǔn)確稱取50 g茶葉籽油，加入50 mL正己烷搖勻，加入50 mL提取液（50%乙醇溶液）于旋渦混合器中充分振蕩3 min后，3 500 r/min離心10 min，棄去正己烷萃取層，以除去脂溶性物質(zhì)。重復(fù)提取3 次，合并甲醇粗提液于35 ℃條件下旋蒸濃縮至干后，用石油醚-乙酸乙酯（9∶1，V/V）溶液溶解定容至10 mL，得茶葉籽油多酚化合物粗提液。

多酚化合物粗提液經(jīng)硅膠柱層析[17-18]，用石油醚-乙酸乙酯溶液（9∶1、3∶1、3∶2、1∶1、0∶1，V/V）進(jìn)行梯度洗脫，以50 mL/份收集洗脫液，以1%三氯化鐵與2%鐵氰化鉀的等體積混合物作為顯色劑，環(huán)己烷-乙酸乙酯-乙酸（10∶2∶0.5，V/V）溶液為展開系統(tǒng)，在硅膠板上分別點(diǎn)樣分析，相同的組分合并，將收集到的組分真空旋蒸濃縮。濃縮液過(guò)Sephadex LH-20柱，用氯仿-甲醇（1∶1，V/V）溶液等梯度洗脫，10 mL/份收集洗脫液，得Fr1、Fr2、Fr3組分，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，置于-20 ℃條件下待測(cè)。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：WondaSil反相C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-乙腈-乙酸（5∶5∶0.1，V/V）溶液（A），0.2%乙酸溶液（B），采用表1中多級(jí)線性梯度洗脫程序，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，進(jìn)樣量10 μL，每次進(jìn)樣前平衡5 min。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedures

1.2.4 色譜峰定性、定量

線性關(guān)系考察：將配制好的梯度混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按1.2.3節(jié)色譜條件進(jìn)樣分析。每個(gè)樣重復(fù)進(jìn)樣3 次，以對(duì)照品的質(zhì)量濃度（mg/L）對(duì)峰面積Y進(jìn)行線性回歸分析。

在相同色譜條件下，首先將14 種單體酚分別進(jìn)樣，確定各單體酚的保留時(shí)間和出峰順序，對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣，得混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖，再將茶葉籽油多酚純化組分Fr1、Fr2、Fr3分別進(jìn)行測(cè)試，得各組分對(duì)應(yīng)色譜圖。首先將標(biāo)準(zhǔn)品和各組分中峰的保留時(shí)間進(jìn)行比較，初步定性鑒定出未知物；然后向多酚純化組分中分別單一加入該初步鑒定的單體酚進(jìn)行測(cè)試，將得到的色譜圖與各組分對(duì)應(yīng)色譜圖進(jìn)行比較，根據(jù)峰高是否增加來(lái)驗(yàn)證各個(gè)組分，完成茶葉籽油提取物中酚類化合物的定性。最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程計(jì)算茶葉籽油多酚純化組分Fr1、Fr2、Fr3中鑒定出來(lái)的酚類化合物含量。

1.2.5 茶葉籽油酚類化合物不同組分對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

采用MTT法檢測(cè)茶葉籽油酚類化合物不同組分對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。將HepG2細(xì)胞接種于DEME培養(yǎng)基中，37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，以0.25%胰酶消化進(jìn)行傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL，接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL。將流分Fr1、Fr2、Fr3減壓蒸干，分別用25 μL甲醇溶解后，加入DEME培養(yǎng)基使終體積為5 mL作為母液，分別配制含不同體積分?jǐn)?shù)的茶葉籽油酚類化合物組分（2.5%、5%、10%、15%、20%、25%）的培養(yǎng)基，甲醇溶液的體積分?jǐn)?shù)不超過(guò)0.5%。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，每孔加入100 μL上述不同體積分?jǐn)?shù)梯度的Fr1、Fr2、Fr3多酚化合物組分，甲醇溶劑對(duì)照組加入分別含0.1%、0.2%、0.5%甲醇的DEME培養(yǎng)基，空白對(duì)照組加入DEME培養(yǎng)基，均設(shè)6 個(gè)平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后每孔加10 mg/mL MTT 10 μL，繼續(xù)孵育4 h，棄去培養(yǎng)基，加入與初始體積等量的Formazan溶解液，利用酶標(biāo)儀在570 nm和630 nm雙波長(zhǎng)檢測(cè)各孔吸光度，用Bliss法按下式計(jì)算細(xì)胞抑制率（IC50值）：

2 結(jié)果與分析

2.1 茶葉籽油多酚化合物定性定量分析

圖1 14 種酚類化合物混合標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖Fig. 1 Liquid chromatograms of mixture of 14 phenolic standards

根據(jù)前人的研究結(jié)果[19-21]，選定本實(shí)驗(yàn)中14 種單體酚作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品。采用1.2.3節(jié)色譜條件，能有效分離14 種標(biāo)準(zhǔn)品，如圖1所示。分別以各個(gè)混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的質(zhì)量濃度x（mg/L）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸分析，根據(jù)信噪比為3時(shí)，測(cè)得各組分檢出限，如表2所示。同一混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液平行測(cè)定6 次，各峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）在0.2%～10.8%之間，保留時(shí)間的RSD在0.1%～2.1%之間，表明該方法具有較好的精密度（重復(fù)性）。

表2 14 種酚類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限Table 2 Regression equations, correlation coefficients, linear ranges and detection limits for 14 phenolics

2.2 茶葉籽油多酚化合物純化組分分析

Fr1、Fr2、Fr3組分分別采用1.2.3節(jié)色譜條件進(jìn)行分析，如圖2所示。比較各組分與混合標(biāo)準(zhǔn)品峰的保留時(shí)間及加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，確定各組分組成，同時(shí)根據(jù)表2中線性回歸方程計(jì)算各組分中具體物質(zhì)相對(duì)含量，如表3所示。Fr1組分中含兒茶素、山柰酚、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、肉桂酸、槲皮素，主要分屬兒茶素類及黃酮類，其中兒茶素類化合物占62.60%；Fr2組分含山柰酚、肉桂酸、兒茶素、沒(méi)食子酸、咖啡酸及表兒茶素沒(méi)食子酸酯，山柰酚占50.70%；Fr3組分含9 種酚類物質(zhì)，其中黃酮類化合物（蘆丁、槲皮素、山柰酚）占78.70%。由于油脂中酚類化合物存形式復(fù)雜，所以對(duì)于茶葉籽油中單個(gè)酚類化合物的分離純化，有待在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中開發(fā)。

圖2 茶葉籽油多酚純化組分Fr1（A）、Fr2（B）、Fr3（C）的液相色譜圖Fig. 2 Liquid chromatograms of Fr1 (A), Fr2 (B), and Fr3 (C) from tea seed oil

表3 茶葉籽油多酚純化組分Fr1、Fr2、Fr3中各酚類化合物相對(duì)含量Table 3 Phenolic constituents of Fr1, Fr2 and Fr3

2.3 茶葉籽油酚類化合物對(duì)HepG2細(xì)胞體外增殖活性抑制效果

體積分?jǐn)?shù)0.1%、0.2%、0.5%甲醇溶劑對(duì)照組的細(xì)胞相對(duì)成活率分別是99.91%、99.76%、99.48%，與各組分實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞成活率相比，可視為無(wú)影響。有關(guān)研究也表明，在細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)中，甲醇溶液的體積分?jǐn)?shù)控制在0.5%以下，可避免其毒性對(duì)實(shí)驗(yàn)造成假陽(yáng)性結(jié)果[22]。研究表明茶中兒茶素、黃酮類化合物在高質(zhì)量濃度條件下存在細(xì)胞毒性，可能與其在高濃度條件下引起的促氧化作用相關(guān)[23-24]。閆敬娜等[25]通過(guò)亞甲基藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)表明茶葉多酚提取物對(duì)受試細(xì)胞的無(wú)毒性劑量范圍為0～500 μg/mL，香菇柄多酚主要為兒茶素、沒(méi)食子酸、咖啡酸、蘆丁、阿魏酸和槲皮素，與茶葉籽油分離純化組分中多酚組成類似，其在質(zhì)量濃度不小于1.71 mg/mL時(shí)對(duì)HepG2顯示細(xì)胞毒性[26]，本實(shí)驗(yàn)中茶葉籽油酚類化合物組分質(zhì)量濃度均在上述無(wú)毒性范圍內(nèi)。

圖3 茶葉籽油酚類化合物純化組分對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響Fig. 3 Effect of purified phenolic constituents from tea seed oil on proliferation of HepG2 cells

采用1.2.5節(jié)方法，考察茶葉籽油酚類化合物Fr1、Fr2、Fr3組分分別對(duì)HepG2癌細(xì)胞增殖活性抑制作用，如圖3所示。Fr1、Fr2、Fr3組分對(duì)應(yīng)的抑制癌細(xì)胞增殖的IC50值分別為1.76%、16.24%及12.35%，各組分對(duì)HepG2癌細(xì)胞的抑制活性大小排列順序?yàn)镕r1＞Fr3＞Fr2，F(xiàn)r1組分能明顯抑制HepG2癌細(xì)胞活性。

圖4 茶葉籽油酚類化合物主成分分析圖Fig. 4 Principal component analysis for identification of antiproliferative phenols in tea seed oil

結(jié)合2.2節(jié)中已知的Fr1、Fr2、Fr3組分多酚化合物具體組成，與其對(duì)應(yīng)的IC50值進(jìn)行主成分分析，比較各酚類化合物對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞系的體外抑制活性，如圖4所示。Fr1～Fr3組分中酚類化合物被分為兩大主成分，所提取到特征值能達(dá)到90%以上的貢獻(xiàn)率，其中第1主成分的貢獻(xiàn)率為65.87%，大于第2主成分貢獻(xiàn)率（34.13%），對(duì)第1主成分貢獻(xiàn)最大的化合物是兒茶素、蘆丁及槲皮素，對(duì)第2主成分貢獻(xiàn)較大的化合物為沒(méi)食子酸、肉桂酸。表明茶葉籽油中的兒茶素類與黃酮類化合物對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖起主要抑制作用，尤以兒茶素、蘆丁、槲皮素為主。茶葉多酚如兒茶素及黃酮類化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖活性抑制作用已被廣泛報(bào)道，研究表明，未分離純化的茶葉多酚提取物對(duì)多種腫瘤細(xì)胞如HepG2、A549、MGC803細(xì)胞均具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及抑制增殖作用[27-28]，此外兒茶素、槲皮素單獨(dú)作用于腫瘤細(xì)胞時(shí)，也表現(xiàn)出顯著的癌細(xì)胞增殖抑制作用[29-30]。本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)，在茶葉籽油中分離純化的茶多酚及黃酮類化合物也存在抑制癌細(xì)胞增殖作用。

3 結(jié) 論

茶葉籽油酚類化合物經(jīng)硅膠柱、Sephadex LH-20柱分離純化，得到組分Fr1、Fr2、Fr3。采用反相高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)技術(shù)分析表明：Fr1主要含兒茶素類化合物，占比達(dá)62.60%；Fr2除主要的黃酮類，還含有部分酚酸類化合物，如肉桂酸占25.6%；Fr3中主要含黃酮類，其中蘆丁相對(duì)含量高達(dá)64.10%。Fr1～Fr3組分對(duì)HepG2細(xì)胞的IC50值分別為1.76%、16.24%及12.35%，表明Fr1抑制HepG2細(xì)胞活性最顯著，其次為組分Fr3，結(jié)合主成分分析，得出茶葉籽油中的黃酮類及兒茶素類化合物具有較強(qiáng)的HepG2細(xì)胞增殖活性抑制作用，尤以兒茶素、蘆丁為主要活性物質(zhì)。本研究初步證實(shí)茶葉籽油酚類化合物具有抗腫瘤作用，可為茶葉籽油酚類化合物及活性研究提供基礎(chǔ)資料，同時(shí)為茶葉籽資源深度開發(fā)提供參考。

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Isolation and Purification of Phenolic Compounds from Tea Seed Oil and Their Antiproliferative Activity on HepG2 Cells

WANG Lijuan1, LIANG Xingqiu1, WANG Xiaoqin1,2,*
(1. College of Chemical Engineering, Huaqiao University, Xiamen 361021, China;2. Institute of Oil and Natural Product, Huaqiao University, Xiamen 361021, China)

Phenolic compounds from tea seed oil were extracted with 60% methanol and purified by sequential chromatography on silica gel and Sephadex LH-20 columns. The composition of purified phenolics was determined by RPHPLC-DAD. Phenolic compounds with antiproliferative effect on HepG2 cells were identified by principal component analysis. The results showed that as one of the three fractions separated by Sephadex LH-20, Fr1 contained 5 phenolic compounds including catechins (accounting for 62.60% of the total amount) and flavonoids. Fr2 mainly included phenolic acids and flavonoids; flavonoids represented 78.70% of Fr3. IC50values of Fr1, Fr2, and Fr3 for the proliferation inhibition of HepG2 cells were 1.76%, 16.24%, and 12.35%, respectively. Principal component analysis showed that rutin and catechin were the major constituents in tea seed oil that had a significantly strong ability to inhibit cell viability.

tea seed oil; phenolic componds; isolation and purification; HepG2; antitumor activity

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724016

TS225.1

A

1002-6630（2017）24-00101-06

王俐娟, 梁杏秋, 王曉琴. 茶葉籽油酚類化合物分離純化組分分析及HepG2細(xì)胞增殖活性抑制[J]. 食品科學(xué), 2017,38(24): 101-106.

10.7506/spkx1002-6630-201724016. http://www.spkx.net.cn

WANG Lijuan, LIANG Xingqiu, WANG Xiaoqin. Isolation and purification of phenolic compounds from tea seed oil and their antiproliferative activity on HepG2 cells[J]. Food Science, 2017, 38(24)∶ 101-106. (in Chinese with English abstract)DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724016. http∶//www.spkx.net.cn

2016-11-07

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31601403）；福建省科技計(jì)劃高校產(chǎn)學(xué)合作項(xiàng)目（2017N51010055）；廈門市科技計(jì)劃項(xiàng)目（3502220161230）；華僑大學(xué)中青年教師科研提升資助計(jì)劃項(xiàng)目（ZQN-PY417）；華僑大學(xué)研究生科研創(chuàng)新能力培育計(jì)劃資助項(xiàng)目（1400215009）

王俐娟（1993—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橛椭疤烊划a(chǎn)物。E-mail：Wang-Lijuan@foxmail.com

*通信作者：王曉琴（1977—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)橛椭疤烊划a(chǎn)物。E-mail：wangxiaoqin77@sohu.com