南海鳶烏賊墨汁多糖分離純化及組分分析

黃 卉，楊麗芝，楊賢慶*，李來好，郝淑賢，魏 涯，王錦旭

南海鳶烏賊墨汁多糖分離純化及組分分析

黃 卉，楊麗芝，楊賢慶*，李來好，郝淑賢，魏 涯，王錦旭

（中國水產科學研究院南海水產研究所，農業部水產品加工重點實驗室，國家水產品加工技術研發中心，廣東 廣州 510300）

目的：從南海鳶烏賊墨汁中分離純化多糖，并分析其多糖組分。方法：利用水提醇沉法得粗多糖，通過固相萃取層析法除色素對多糖進行純化，純化多糖依次經DEAE-52離子交換柱、Sephacryl HR-300凝膠柱分級純化，按峰收集得單一組分，采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）衍生化方法，通過超高效液相色譜分析多糖組分。結果：粗多糖經DEAE-52離子交換柱、Sephacryl HR-300凝膠柱后收集得到3 個糖組分，分別為SIP1、SIP2、SIP3；通過PMP衍生化方法分析單糖組成，得：SIP1是由D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖3 種單糖縮合而成；SIP2和SIP3分別是由D-甘露糖、鼠李糖、D-葡萄糖、D-半乳糖及L-（-）-巖藻糖5 種單糖按照不同比例縮合而成。

墨多糖；分離純化；組分分析

生物體內的糖類物質已被證明具有諸多生物活性，如抗菌[1]、抗氧化[2]、抗腫瘤[3]及提高機體免疫[4]等生物活性，隨著海洋生物醫學的發展，對糖類物質的研究逐漸深入，為探索糖類生物學功能及其抗性機理，對其結構分析刻不容緩，但是由于糖類物質極性強，結構相近，缺乏光學吸收基團，所以一直制約整個糖類領域的發展[5]。為改變糖類物質的光學靈敏度檢測，衍生化為糖類物質的分析提供了新技術，衍生化是使糖鏈帶上熒光或紫外基團，從而使糖類物質滿足光學檢測的靈敏度。

1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）在弱堿性條件下發生衍生化反應，糖鏈還原性末端與1、3取代基發生反應，1 個糖分子的還原端可與2 分子PMP形成穩定的衍生物，與其他酸性條件的衍生化試劑相比，其條件溫和、紫外吸收強、衍生物較穩定且無異構體，被廣泛用于糖類物質的分析[6]。PMP和其類似物1-（4-異丙基）苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮[7]、1-（2-萘基）-3-甲基-5-吡唑啉酮[8-9]、1,3-二苯基-5-吡唑啉酮[10]等對分析痕量糖鏈也均有明顯優勢。采用PMP衍生化方法對多糖組分分析時，可使糖類物質在波長24 nm處產生強烈的紫外吸收，且操作方便，重現性好，廣泛應用于糖類組分分析中[11-13]。PMP衍生法可對中性糖如甘露糖、木糖，堿性糖如氨基半乳糖、氨基葡萄糖，酸性糖如葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等11 種單糖同時測定，但除單糖中木糖和阿拉伯糖不能完全分離外，均可實現良好分離[11]，從而為物質多糖組分分析提供了可能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中國水產科學研究院南海水產研究所“南鋒”號調查船于2014年7月，南海海域捕撈鳶烏賊，取墨囊，凍藏于-20 ℃，備用。

DEAE-52纖維素 上海楷陽生物公司；Sephacryl HR-300丙烯葡聚糖凝膠、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl，DPPH） 美國Sigma公司；PMP 成都西亞試劑有限公司；D-阿拉伯糖（D-(-)-arabinose，D-Ara）、鼠李糖（L-rhamnose monohydrate，Rha）、肌醇、L-（－）-巖藻糖（L-(-)-fucose，L-（-）-Fuc） 上海源葉生物科技有限公司；D-木糖（D-xylose，D-Xyl）、D-甘露糖（D-Mannose，D-Man）、D-葡萄糖（D-glucose，D-Glc）、D-半乳糖（D-galactose，D-Gal）、乳糖（lactose，Lac） 成都植標化純生物技術有限公司；木瓜蛋白酶（6 000 U/mg） 上海楷陽生物公司；三羥甲基氨基甲烷（tri-hydroxymethyl aminomethane，Tris）、無水葡萄糖、苯酚、濃硫酸、氯仿、正丁醇、氯化鈉、無水乙醇、甲醇、三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鹽酸、乙酸銨、溴化鉀、氫氧化鈉均為國產分析純；乙腈為國產色譜純。

1.2 儀器與設備

AvantiJ26XP高速離心機 德國Sigma公司；Synergy全功能酶標儀 美國BioTek公司；UV2550紫外-可見分光光度計、IRAffinity-1紅外光譜儀 津島企業管理中國有限公司；EYELAN-1000旋轉蒸發儀 日本京理化器械株式會社；AKTApurifierUPC100蛋白純化儀美國GE公司；CBS-B多功能分部收集器 上海青浦滬西公司；ACQUITY超高效液相色譜 美國Waters公司；Alphal-4冷凍干燥器 德國Christ公司；N-EVAP24氮吹儀 美國Organomation Associate Inc公司。1.3 方法

1.3.1 南海鳶烏賊墨汁粗多糖提取工藝流程

取500 g鳶烏賊墨汁，加入1 kg蒸餾水，調節pH值為5.5，40 ℃熱水浸提4 h，4 ℃浸提12 h，10 000 r/min離心40 min（重復2 次），取上清液加2 倍體積Tris-HCl溶液，加1.0%（5 g）木瓜蛋白酶，酶解12 h（pH 6.8，60 ℃水浴振蕩），煮沸10 min，滅酶，10 000 r/min離心20 min除去蛋白，取上清液加入1/4體積的氯仿-正丁醇溶液（4∶1，V/V），攪拌器劇烈攪拌30 min，重復操作，直至除去雜質蛋白，離心，取上清液，旋轉蒸發濃縮至50 mL加4 倍無水乙醇醇沉過夜。10 000 r/min離心10 min，取沉淀抽濾，無水乙醇、丙酮洗沉淀，得粗多糖，冷凍干燥，備用。

1.3.2 鳶烏賊墨多糖的分離純化

1.3.2.1 固相萃取小柱層析

取鳶烏賊墨粗多糖1 g，加入超純水5 mL，80 ℃水浴加熱溶解25 min，5 000 r/min離心5 min，不溶物重復上述操作，合并2 次上清液，上已活化的C18固相萃取小柱，以除去部分色素，用超純水洗柱至3 個柱體積，收集濃縮液，備用，利用苯酚-硫酸法測定多糖含量[14]，并根據上柱前后總的糖含量之和，按下式計算損失率：

1.3.2.2 離子交換柱層析

取1 g經過固相萃取小柱的粗多糖濃縮液上DEAE-52纖維素離子交換柱（2.6 cm×50 cm），上樣后，依次用0～2 mol/L NaCl溶液分段梯度洗脫，自動部分收集器收集，直至無糖檢出，流速1 mL/min，每管5 mL，苯酚-硫酸法檢測洗脫液中多糖含量，隔管檢測，并繪制洗脫曲線，根據洗脫曲線按峰收集，濃縮各峰收集液，經8 000 D透析袋透析48 h，冷凍干燥[15-22]，備用并測量。

1.3.2.3 分子篩層析

分別將經離子交換柱的各個峰值多糖溶于超純水，再上樣于Sephacryl HR-300丙烯葡聚糖凝膠分子篩柱（1.6 cm×100 cm），超純水洗脫，自動部分收集器收集，流速1 mL/min，苯酚-硫酸法檢測洗脫液多糖含量，繪制標準曲線，根據洗脫曲線按峰收集洗脫液，濃縮，冷凍干燥得精品墨多糖[23-24]。

1.3.2.4 紅外光譜分析

取約1 mg墨多糖SIP1組分，加入適量干燥KBr粉末，在暖燈加熱條件下，放入瑪瑙研缽中均勻研細，放入壓片機中壓成均勻透明薄片。將此透明薄片放入傅里葉變換紅外光譜儀內，在400～4 000 cm-1區間進行掃描，采集紅外光譜圖。

1.3.2.5 單糖組分的分析方法-PMP衍生高效液相法[24-27]

混合單糖標樣的衍生：將乳糖及7 種單糖標準品用甲醇配制成0.5 mg/mL，分別取50 μL加入具塞試管中，然后在具塞試管中加入400 μL PMP（甲醇配制0.5 mol/L）和400 μL NaOH（0.3 mol/L）溶液，70 ℃水浴反應100 min，取出10 min冷卻至室溫，加入400 μL HCl（0.3 mol/L）溶液調節至中性，加入1 mL氯仿充分振蕩萃取，靜置，吸棄下層，重復此操作3 次，取上清液水相用0.45 μm微孔膜過濾，稀釋10 倍，上樣分析。

樣品制備：取鳶烏賊墨多糖樣品2 mg于可耐高溫具塞試管中，加入2 mL 2 mol/L TFA，充氮氣封管，110 ℃水解8 h，冷卻至室溫，50 ℃于氮吹儀中揮干TFA，加入1 mL甲醇溶液重復操作，以NaOH溶液調節至中性，取100 μL進行PMP衍生，PMP、NaOH和HCl量均改為100 μL，其他操作相同，以100 μL甲醇代替樣品作PMP衍生空白。

色譜條件：Waters ACQUITY超高效液相色譜；ACQUITY UPLC C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；紫外檢測器波長250 nm；流動相：A相為乙腈，B相為5 mmol/L的甲酸銨溶液，C相為乙腈-水（1∶9，V/V）；梯度洗脫程序：0～6 min，23.0% A、77.0% B、0% C；6～9.5 min，50.0% A、50.0% B、0% C；9.5～10 min，23.0% A、77.0% B、0% C；流速0.30 mL/min；柱溫25 ℃。

2 結果與分析

2.1 固相萃取小柱層析結果

表1 粗多糖經固相萃取小柱后多糖質量分數前后對比Table 1 Recovery and loss of polysaccharide during solid phase extraction

由于鳶烏賊墨多糖粗提物中含有較多色素雜質，如果直接上色譜柱容易堵塞填料，很難繼續上樣，增加了分離純化的難度，將墨汁粗多糖先經固相萃取小柱簡單分離后可以除去大部分色素，利于后續實驗的順利進行，由表1可得，鳶烏賊墨汁粗多糖經固相萃取小柱后，多糖損失為質量分數1.4%，多糖損失較小，損失率為5.4%。

2.2 離子交換柱層析結果

圖1 墨汁粗多糖在DEAE-52離子交換柱中的洗脫曲線Fig. 1 Elution curves of crude polysaccharides on DEAE-52 ion exchange column

取1 g經過固相萃取小柱的粗多糖濃縮液上DEAE-52纖維素離子交換柱，上樣后，依次用0～2 mol/L NaCl溶液分段梯度洗脫，自動部分收集器收集，如圖1所示。鳶烏賊墨多糖經DEAE-52纖維素離子交換柱后出現3 個糖峰，分別在第17、51管及第87管開始出現糖峰，并且可以看出峰1含量較高，峰2次之，峰3含量最少（已通過檢測冷凍干燥產品證實），依次稱之為：SIP1、SIP2、SIP3，分別收集3 個糖峰，冷凍干燥，備用。

2.3 分子篩層析結果

圖2 SIP1（A）、SIP2（B）和SIP3（C）在Sephacryl HR-300凝膠柱中的洗脫曲線Fig. 2 Elution curves of SIP1 (A), SIP2 (B), and SIP3 (C) on Sephacryl HR-300 gel column

分別取樣品SIP1、SIP2、SIP3組分上樣于Sephacryl HR-300丙烯葡聚糖凝膠分子篩柱，超純水洗脫，自動部分收集器收集，苯酚-硫酸法檢測洗脫液多糖含量，繪制標準曲線，其中樣品SIP1收集液第15～25管分別用超純水稀釋5 倍；SIP2收集液第15～17管稀釋2 倍，SIP3未進行稀釋。由圖2可知，SIP1、SIP2、SIP3三組分經Sephacryl HR-300凝膠柱后，各自只有一個糖峰，說明SIP1、SIP2、SIP3是單一組分。由圖2A可知，樣品SIP1組分經Sephacryl HR-300丙烯葡聚糖凝膠分子篩柱，從第7管開始出現糖峰，且隨著管號的增大吸光度增加，多糖含量增加，在第15～23管達到最大，隨后降低；而由圖2B、C可知，樣品SIP2、SIP3分別在第7、9管開始出現糖峰，但與SIP1相比，盡管樣品SIP1第15～25管分別用超純水稀釋5 倍，但是吸光度依舊很大，糖含量很高；SIP2與SIP3相比，SIP2吸光度高于SIP3，糖含量高于SIP3，分別按峰收集SIP1、SIP2和SIP3，冷凍干燥，備用。

2.4 紅外光譜結果

取經Sephacryl HR-300凝膠柱純化多糖SIP1，采用傅里葉變換紅外光譜儀在4 000～400 cm-1區間進行掃描，采集紅外光譜圖，如圖3所示。

圖3 鳶烏賊墨多糖分離組分SIP1的紅外吸收光譜圖Fig. 3 FTIR spectrum of SIP1

紅外吸收光譜中，4 000～1 333 cm-1區域被稱為特征譜帶區，該區域吸收峰比較稀疏，容易辨認，有機化合物的分子中一些主要的官能團的特征吸收多發生在此區域。由圖3可知，在SIP1的紅外吸收光譜圖中3 500～3 200 cm-1之間出現一個極強的峰，主要由于—OH基在形成氫鍵締合后，O—H鍵拉長，電偶極矩增大而形成的。此外，2 935.7、1 609.8 cm-1有較強吸收峰，前者是C—H鍵的伸縮振動，是糖的特征峰，表明多糖中含有—CH2—，后者為—COO—中C＝O非對稱伸縮振動或為C＝C或C＝N或結晶水的吸收峰，紅外吸收光譜上1 333～400 cm-1區域中的譜帶特別密集，通常稱為指紋區，反映了化合物在結構上的微小差別，1 400～1 200 cm-1的一些峰是C—H的變角振動[28]。

2.5 單糖組分分析

單糖結構相近，極性較強，且缺乏光學活性，給多糖的分離檢測增加了難度，研究者常將多糖水解后采用柱前或柱后衍生化色譜法進行分離和檢測，以改善其分離選擇性和提高檢測靈敏度，其中PMP柱前衍生化高效液相色譜法應用較為廣泛，其具有反應條件較溫和、分析效率高、分析時間短、檢測靈敏度較高等優點。

圖4 PMP衍生物空白對照（A）和8 種單糖-PMP衍生物（B）色譜圖Fig. 4 Chromatograms of PMP derivatives of eight monosaccharides

圖5 SIP1（A）、SIP2（B）、SIP3（C）水解樣品的PMP衍生化產物色譜圖Fig. 5 Chromatograms of PMP derivatives of acid hydrolysates of SIP1 (A), SIP2 (B) and SIP3 (C)

根據上述單糖組分分析方法進行PMP衍生化檢測單糖組分，結果如圖4A所示，在保留時間0.6～2.8 min之間有一些PMP峰，以此作為空白對照，由圖4B可得出，D-Man的保留時間為2.54 min；Rha的保留時間為3.50 min；Lac的保留時間為4.05 min；D-Glc的保留時間為4.92 min；D-Gal的保留時間為5.35 min；D-Ara的保留時間為5.85min；D-Xyl的保留時間為6.00；L-（-）-Fuc的保留時間為6.93 min。

從圖5A可得，樣品SIP1出峰時間分別為2.54、4.92、5.35 min，分別為D-Man、D-Glc、D-Gal 3種單糖，說明樣品SIP1是由D-Man、D-Glc、D-Gal 3 種單糖組成，其中D-Gal是主要組成部分；由圖5B可知，樣品SIP2單糖組成較為復雜，主要包括：D-Man、Rha、D-Gal、D-Glc及L-（-）-Fuc 5種單糖，出峰時間為別為2.54、3.50、5.35、4.92、6.93 min，其中L-（-）-Fuc含量較高，是主要組成部分，D-Gal、D-Glc含量甚微，猜測應是SIP1中沒有收集完全的糖組分，可以忽略不計；而由圖5C可得，樣品SIP3含有D-Man、Rha、D-Gal、D-Glc及L-（-）-Fuc 5種單糖，說明樣品SIP2和SIP3單糖組成相似，但是組成比例不等，其中L-（-）-Fuc也是主要組成成分，而Rha所占比例有所下降，由此可得，SIP1、SIP2、SIP3分別是由不同種類單糖按照不同比例縮合而成。

3 結 論

南海鳶烏賊墨汁粗多糖經分離提取、酶法結合上清液加入1/4氯仿-正丁醇溶液（4∶1，V/V）兩步去除雜質蛋白、固相萃取小柱層析除色素后，依次經過DEAE-52離子交換柱、Sephacryl HR-300凝膠柱，苯酚-硫酸法測多糖含量，按峰收集，經DEAE-52柱收集得到3 個峰組分，分別為SIP1、SIP2、SIP3，將SIP1、SIP2、SIP3分別過Sephacryl HR-300凝膠柱，分別得到單一峰組分。然后分別將SIP1、SIP2、SIP3組分進行PMP衍生，上樣于超高效液相色譜，通過與混標的色譜圖對比，分析單糖組分，得到：SIP1是由D-Man、D-Glc、D-Gal 3 種單糖按照一定比例縮合而成；SIP2和SIP3分別是由D-Man、Rha、D-Gal、D-Glc及L-（-）-Fuc 5 種單糖按照不同比例縮合而成，南海鳶烏賊墨多糖是由D-Man、D-Glc、D-Gal、Rha、L-（-）-Fuc 5 種單糖組成，PMP衍生化方法，除單糖中D-Xyl和D-Ara不能完全分離外，均可實現良好分離。

鳶烏賊生命周期短、繁殖率強、生長率高，廣泛分布于印度洋和太平洋的熱帶、亞熱帶海域，其中以南海海域數量較大，是一種具有潛力的生物資源[29-34]。隨著對鳶烏賊資源的開發利用，其加工副產物墨汁也逐步受到重視，墨汁中富含多糖等活性物質，多糖具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤等生物活性，隨著海洋生物醫學的發展，對糖類物質的研究逐漸深入，為探索糖類生物學功能及其抗性機理，對其結構分析刻不容緩，本實驗對鳶烏賊墨多糖進行了分離純化，得到其單糖組成，但因產品純度問題未能得到單糖組成的比例，今后應在此方向進行進一步的研究。

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[33] 張鵬, 楊吝, 楊炳忠, 等. 春季南沙海域鳶烏賊種群結構特征的研究[J]. 南方水產科學, 2015, 11(5)∶ 11-19. DOI∶10.3969/j.issn.2095-0780.2015.05.002.

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Separation, Purification and Monosaccharide Composition of Polysaccharides from the Ink of Sthenoteuthis oualaniensis in South China Sea

HUANG Hui, YANG Lizhi, YANG Xianqing*, LI Laihao, HAO Shuxian, WEI Ya, WANG Jinxu
(Key Laboratory of Aquatic Product Processing, Ministry of Agriculture, National R&D Center for Aquatic Product Processing,South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China)

Objective∶ To isolate and purify polysaccharides from the ink of Sthenoteuthis oualaniensis in the South China Sea, and to analyze the monosaccharide composition of the purified polysaccharides. Methods∶ Crude polysaccharides were isolated through water extraction followed by alcohol precipitation and passed through a solid phase extraction column to remove the pigment. The polysaccharides were fractionated and further purified into homogeneity by sequential chromatographies on DEAE-52 ion exchange and Sephacryl HR-300 columns. The monosaccharide composition was analyzed by ultra performance liquid chromatography (UPLC) after 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone (PMP) derivatization.Results∶ Three purified polysaccharides designated as SIP1, SIP2, and SIP3 were obtained. SIP1 was composed of D-mannose,D-glucose, and D-galactose while SIP2 and SIP3 were composed of D-mannose, rat sugar, D-glucose, D-galactose and L-(-)-fucose in different ratios.

sepia ink polysaccharides; separation and purification; monosaccharide analysis

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724019

TS254.4

A

1002-6630（2017）24-0118-06

黃卉, 楊麗芝, 楊賢慶, 等. 南海鳶烏賊墨多糖分離純化及組分分析[J]. 食品科學, 2017, 38(24): 118-123.

10.7506/spkx1002-6630-201724019. http://www.spkx.net.cn

HUANG Hui, YANG Lizhi, YANG Xianqing, et al. Separation, purification and monosaccharide composition of polysaccharides from the ink of Sthenoteuthis oualaniensis in South China Sea[J]. Food Science, 2017, 38(24)∶ 118-123. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724019. http∶//www.spkx.net.cn

2016-11-12

農業部財政重大專項（NFZX2013）；國家重點基礎研究發展計劃（973計劃）項目（2014CB441500）

黃卉（1980—），女，副研究員，博士，主要從事水產品加工與質量安全研究。E-mail：huanghuigd@aliyun.com

*通信作者：楊賢慶（1963—），男，研究員，學士，主要從事水產品加工與質量安全研究。E-mail：yxqgd@163.com