單萜烯物質檢測方法建立及自選酵母KDLYS9-16對單萜烯產生的影響

李 艷，周立華

單萜烯物質檢測方法建立及自選酵母KDLYS9-16對單萜烯產生的影響

李 艷1,2，周立華1

（1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018；2.河北省發酵工程技術研究中心，河北 石家莊 050018）

采用液液萃取法結合氣相色譜氫火焰離子檢測器建立一種可同時檢測葡萄酒中13 種游離態單萜烯類物質的方法，并采用所建方法檢測了商品菌SC和自選菌KDLYS9-16兩種釀酒酵母發酵的河北省沙城和昌黎2 個產區的赤霞珠和美樂葡萄酒中的單萜烯類物質。結果顯示，方法的R2為0.996 7～0.999 3，檢出限為0.580～1.073 mg/L，相對標準偏差為0.58%～3.18%，回收率為89.98%～107.34%。4 種葡萄酒中的單萜烯類物質質量濃度都比發酵前的葡萄汁中高，尤以采用自選高產β-D-葡萄糖苷酶釀酒酵母KDLYS9-16發酵的昌黎產區赤霞珠干紅葡萄酒中最高，達到2.855 mg/L，比葡萄汁中增加約3.1 倍。赤霞珠葡萄及葡萄酒中單萜烯物質質量濃度比美樂葡萄高，沙城產區的2 種葡萄汁中單萜烯類物質質量濃度比昌黎的高，選用不同菌種發酵的葡萄酒中單萜烯物質質量濃度和種類不同。綜上，本研究建立方法簡單、靈敏性高、重復性好，可用于葡萄及葡萄酒中單萜烯類物質的檢測。

液液萃取；氣相色譜氫火焰離子檢測器；單萜烯類物質；葡萄酒香氣

萜烯類物質具有特殊的香氣，是葡萄酒中重要的香氣成分[1-4]，主要包括單萜烯類、倍半萜烯類以及二萜烯類化合物等[5]。葡萄酒中的香氣成分主要以游離態和結合態香氣前體物的形式存在，結合態物質本身沒有香氣，必須經過分解釋放才能產生香氣[6]。通常葡萄漿果中以葡萄糖苷鍵形式存在的結合態萜烯類香氣物質的含量比游離態萜烯類的呈香物質豐富[7]。研究表明，結合態萜烯類香氣糖苷物質是葡萄酒活性香氣成分的儲備庫，比其對應的游離態配基多幾倍，甚至幾十倍[8]。β-D-葡萄糖苷酶對葡萄中與糖苷結合的萜類物質進行水解，從而釋放糖苷及單萜烯、倍半萜烯類等提高葡萄酒的香氣[9-11]，進而增加葡萄酒的香氣物質含量，提高葡萄酒的感官品質。

目前對于單萜烯的檢測方法及種類還不夠全面，對高產β-D-葡萄糖苷酶的釀酒酵母對單萜烯類物質產生的影響的研究較少。本研究是在建立一種以葡萄酒為基礎的檢測單萜烯物質的方法，并對高產β-D-葡萄糖苷酶自選酵母的單萜烯的產生影響進行了研究，為今后對該菌的商業應用提供數據支持。

本研究建立一種可同時檢測葡萄酒中13 種單萜烯類物質的方法，并對選自不同產區的不同釀酒葡萄，采用自選高產β-D-葡萄糖苷酶的釀酒酵母和商品酵母菌發酵的葡萄酒中單萜烯類物質進行檢測，判斷檢測方法的準確性和產區、葡萄品種以及酵母菌對葡萄酒中單萜烯類物質的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒葡萄：美樂和赤霞珠葡萄，2015年葡萄成熟季節，分別采摘于河北省昌黎和沙城葡萄酒產區，基礎檢測數據見表1。

表1 釀酒葡萄基礎數據Table 1 Basic data of wine grapes

釀酒酵母KDLYS9-16：自選高產β-D-葡萄糖苷酶釀酒酵母，本研究室分離篩選于河北省沙城葡萄酒產區，GenBank登錄號KX119943；SC：商品釀酒酵母購自意大利Esseco公司。

α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、D-（＋）-樟腦、L-薄荷醇、右旋香芹酮、（Z）-香葉基丙酮、（E）-香葉基丙酮（均為分析純） 成都艾科達化學試劑有限公司；芳樟醇、香葉醇（均為分析純） 東京化成工業株式會社；香茅醇、橙花醇（均為分析純） 美國Acros Organics USA公司；α-萜品醇（分析純） 梯希愛（上海）化成工業發展有限公司；二氯甲烷、偏重亞硫酸鉀（均為分析純） 天津市永大化學試劑有限公司；HE果膠酶（食品級） 法國Laffort公司。

1.2 儀器與設備

GC 7820A配有氫火焰檢測器 美國安捷倫公司；RE52CS-1旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；DC-12氮吹儀 上海安譜科技儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 干紅葡萄酒釀造過程

干紅葡萄酒釀造采用傳統工藝于實驗室釀造，基本工藝流程為[12]：釀酒葡萄→分選→除梗→手工破碎→加入果膠酶和SO2（果膠酶加量40 mg/L，SO2加量50 mg/L），室溫浸漬過夜→接種酵母酒精發酵（酵母菌接種量1×106個/mL）→壓榨分離皮渣→葡萄原酒去沉淀→過濾→封存檢測。

1.3.2 單萜烯類物質標準曲線的建立

以二氯甲烷為溶劑配制單萜烯類物質標準溶液，質量濃度為α-蒎烯464 mg/L、β-蒎烯828 mg/L、月桂烯778 mg/L、D-（＋）-樟腦634 mg/L、芳樟醇858 mg/L、L-薄荷醇748 mg/L、α-萜品醇494 mg/L、右旋香芹酮558 mg/L、香茅醇494 mg/L、橙花醇496 mg/L、（Z）-香葉基丙酮319 mg/L、香葉醇354 mg/L和（E）-香葉基丙酮478 mg/L的混合標準溶液原液，然后稀釋1、2、5、10、50、100 倍和1 000 倍，利用這7 個梯度稀釋后的溶液建立標準曲線，進行氣相色譜氫火焰離子檢測器（gas chromatography-flame ion detector，GC-FID）分析，以單萜烯類物質質量濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標畫圖。

1.3.3 單萜烯類物質的萃取[13]

分別取葡萄果汁和葡萄酒各50 mL，倒入250 mL分液漏斗中，加入等體積二氯甲烷萃取24 h，萃取過程中反復振蕩達到充分混合，靜置分層后分離萃取液和萃余液，萃取液倒入圓底燒瓶中，封口待用。萃余液再分別加入30 mL溶劑進行第2次和第3次萃取，均萃取24 h。將3 次萃取液合并，用旋轉蒸發儀濃縮至3 mL左右，轉入5 mL試管中，再用2 mL溶劑洗滌圓底燒瓶，洗液一并倒入試管中，氮吹至1 mL以下，再補充溶劑至1mL，用0.45 μm膜過濾，濾液用于香氣物質檢測，此樣品為濃縮50 倍。每個樣品平行檢測3 次。1.3.4 GC-FID分析條件

Agilent 7820A GC-FID，色譜柱為HP-INNOWAX（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為氮氣，流速1 mL/min；升溫程序：初始溫度為50 ℃，保持10 min；以3 ℃/min升溫至140 ℃，保持10 min；以5 ℃/min升溫至200 ℃，保持1 min；然后以10 ℃/min升至250 ℃，保持1 min。

色譜參數[14]：1 μL樣品不分流進樣，進樣口溫度250 ℃；檢測溫度280 ℃；尾吹氣流量25 mL/min；氫氣流量40 mL/min；空氣流量400 mL/min。

1.3.5 標準曲線參數的測定

回收率用來評價測定方法的準確度，一般測定方法為向已知物質質量濃度的樣品中加入純目標物質，利用儀器測定濃度，然后進行分析，按公式（1）計算[15-16]：

檢出限為所建立的方法所能檢測到的目標物質的最低質量濃度，本研究檢出限的測定時通過不斷稀釋標準樣品，直至無法檢測到為止，此時的質量濃度為該物質的檢出限，為該物質檢測與否的一個界點。

1.3.6 葡萄汁和葡萄酒中單萜烯類物質質量濃度測定

本研究檢測的樣品包括河北省沙城產區和昌黎產區的美樂葡萄和赤霞珠葡萄，以及分別采用商品酵母菌SC和自選高產β-D-葡萄糖苷酶的釀酒酵母KDLYS9-16釀造的4 種干紅葡萄原酒，共計12 個樣品，每個樣品做3 個平行，定量時取3 次測定結果的平均值，按公式（2）計算：

葡萄汁發酵后的葡萄酒中單萜烯類物質相對增加量按公式（3）計算：

1.4 數據處理

利用Origin 8.0軟件對實驗數據進行線性回歸處理。

2 結果與分析

2.1 單萜烯類物質標準曲線

以單萜烯類物質質量濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，使用Origin 8.0軟件進行線性回歸，得到GC-FID分析線性關系，結果見表2。13 種單萜烯類物質混合標準品的GC圖見圖1。

表2 單萜烯類物質的GC-FID分析結果Table 2 Figures of merit of GC-FID for detecting monoterpenes

圖1 單萜烯標準品分離GC圖Fig. 1 GC Chromatogram for standard mixture of monoterpenes

由圖1可知，通過儀器數據計算13 種單萜烯類物質的標準品分離度都大于1.5，且峰形窄尖，分離效果較好，符合分離檢測的標準，說明檢測方法適于對這13 種單萜烯類物質進行分析檢測。

由表2可知，13 種單萜烯類物質標準曲線的線性關系較好，R2在0.996 7～0.999 3之間，說明線性方程可用于物質定量。

方法的檢出限一般為該物質質量濃度基線噪聲的3 倍，在實驗中可以反映對待測目標物質的靈敏性，測得的檢出限越小，說明儀器方法對所要測定的物質靈敏性越高，所建方法對目標物質比較適合[17-18]。表2中各種單萜烯類物質的檢出限在0.580～1.073 mg/L之間，滿足檢測要求，說明所建方法的靈敏性適合對目標物質的檢測。方法的重復性可以用目標物質的相對標準偏差（relative standard devition，RSD）來表示，RSD越小說明重復性越好，所建方法的各種單一物質的RSD都在0.58%～3.18%之內，RSD較小，說明方法的重復性較好。

所建方法的回收率為89.98%～107.34%，說明該方法對物質的定性與定量均較準確，適于對單萜烯類物質的檢測。

2.2 葡萄汁和葡萄酒中單萜烯類物質的測定結果

表3 葡萄汁和葡萄酒中單萜烯類物質的質量濃度Table 3 Monoterpene concentrations in grape juice and wine mg/L

圖2 葡萄汁與葡萄酒中13 種單萜烯類物質質量濃度的變化Fig. 2 Comparative concentrations of 13 monoterpenes in grape juice and wine

萜烯及C13-降異戊二烯類物質對葡萄酒品種香氣的形成起到了決定關鍵的作用，這類物質通常都具有濃郁的香氣和較低的感官閾值[19]，這些物質是釀酒葡萄原料中潛在的非常重要的香氣成分，對葡萄酒品質起著舉足輕重的作用。由表3和圖2可以看出，沙城和昌黎產區的美樂和赤霞珠葡萄汁、分別經過SC和KDLYS9-16酵母發酵后的美樂和赤霞珠干紅葡萄酒等12 個樣品中分別檢測到5、7、9、6、8、11、4、7、10、7、7 種和11 種單萜烯類物質，發酵后葡萄酒中的單萜烯物質種類和總質量濃度普遍明顯增加，且自選菌高于商品菌。由表3可以看出，經自選菌發酵的昌黎赤霞珠干紅葡萄酒中單萜烯類物質質量濃度增加最多，達到308.88%，而經SC發酵后的沙城美樂葡萄酒中質量濃度增加最高僅為90.80%，由此表明自選菌在增香上優于商品菌，具有很好的增香效果，并且對赤霞珠干紅酒的作用要好于對美樂葡萄酒的增香作用。

2.2.1 自選菌對沙城產區葡萄酒中單萜烯質量濃度的影響

沙城產區美樂葡萄經過2 種酵母的發酵作用后，單萜烯類物質的質量濃度和種類數都呈現了增加的趨勢，葡萄汁中的總質量濃度為0.502 mg/L，經過SC和KDLYS9-16酵母發酵后分別增長為0.959 mg/L和1.416 mg/L。在葡萄汁和葡萄酒中均檢測到芳樟醇、α-萜品醇、香茅醇和香葉醇，且質量濃度有明顯增大，尤其芳樟醇的質量濃度在KDLYS9-16發酵后的葡萄酒中為0.391 mg/L，說明這些物質在葡萄中天然存在一部分游離態，同時也存在結合態。結合態的物質經酵母的發酵作用而水解為游離態，使質量濃度增加；月桂烯和（Z）-香葉基丙酮只在經KDLYS9-16發酵后的葡萄酒中被檢出，說明了自選菌發酵過程中釋放的酶可以水解月桂烯和（Z）-香葉基丙酮結合態物質釋放單體，這2 種物質是典型的油脂香型物質。

沙城產區赤霞珠葡萄汁和葡萄酒中單萜烯物質質量濃度明顯高于美樂葡萄，葡萄汁中總質量濃度為0.750 mg/L，商品菌SC發酵后總質量濃度達到1.142 mg/L，而KDLYS9-16發酵后總質量濃度達到2.454 mg/L，在果汁的基礎上提高了227.05%。2-茨酮、芳樟醇、α-萜品醇、香茅醇、橙花醇和香葉醇是葡萄汁和葡萄酒中都具有的，在葡萄汁中芳樟醇的質量濃度最高為0.206 mg/L，經過自選菌發酵后增加了198%，達到0.614 mg/L，成為沙城產區赤霞珠葡萄酒中質量濃度最高的單萜烯物質，這些物質是閾值很低的物質[20-23]，使葡萄酒呈現了濃郁的玫瑰花香和果香[24-28]；L-薄荷醇、右旋香芹酮和（E）-香葉基丙酮僅在KDLYS9-16發酵的葡萄酒中被檢出，說明該菌在發酵過程中產生的β-D-葡萄糖苷酶可以水解這3 種物質的結合態，釋放出游離態單體物質，而SC酵母則不具備這種水解作用；此外，α-蒎烯、2-茨酮在美樂葡萄汁中則未被檢出，而2 種發酵酒中都被檢出，說明它們是發酵的產物，從質量濃度上來說，自選菌高于商品菌。

沙城產區的美樂葡萄和赤霞珠葡萄經過2 種酵母的發酵作用后，單萜烯類物質質量濃度都增加，以自選菌發酵的葡萄酒中增加顯著，尤其赤霞珠葡萄單萜烯類物質質量濃度從葡萄汁中的0.750 mg/L增加為葡萄酒中的2.454 mg/L，且種類從6 種增加到11 種。通過實驗分析可知，自選高產β-D-葡萄糖苷酶酵母菌KDLYS9-16對沙城產區的美樂和赤霞珠葡萄酒增香作用優于商品菌SC。

2.2.2 自選菌對昌黎產區葡萄酒中單萜烯質量濃度的影響

昌黎美樂葡萄汁及葡萄酒中總共檢測出10 種單萜烯物質，有4 種為3 個樣品所共有，分別為芳樟醇、香茅醇、橙花醇和香葉醇，其中芳樟醇在樣品中質量濃度最高，在KDLYS9-16發酵酒中質量濃度最高為0.645 mg/L，是葡萄汁中質量濃度的3.12 倍。香葉醇從葡萄汁經過SC酵母發酵后質量濃度沒有明顯增加，而經過KDLYS9-16發酵后質量濃度大量增加，從0.093 mg/L增加到0.207 mg/L，增加了122.58%；月桂烯、L-薄荷醇和（Z）-香葉基丙酮僅在KDLYS9-16的發酵酒中被檢測到，總質量濃度為0.074 mg/L，這些物質分別具有香脂香氣、薄荷香氣和香葉氣息[29]；另外，α-蒎烯、2-茨酮和α-萜品醇是經過酵母發酵后產生，α-蒎烯的質量濃度在2 種菌的發酵酒中相差不大，說明該物質不會因β-D-葡萄糖苷酶的存在而急劇的增加。2-茨酮和α-萜品醇的質量濃度經KDLYS9-16發酵后增加，尤其α-萜品醇的質量濃度SC菌發酵酒中為0.077 mg/L，而KDLYS9-16發酵酒中0.318 mg/L，說明β-D-葡萄糖苷酶可以促進α-萜品醇由結合態水解為游離態。

由圖2可以看出，昌黎產區赤霞珠經KDLYS9-16發酵后單萜烯的質量濃度增加最多，從葡萄汁中的0.698 mg/L增加到葡萄酒中的2.855 mg/L，相對增加量為309%，而對照菌SC酵母的發酵酒中的單萜烯物質質量濃度在葡萄汁的基礎相對增加量為58.09%，變化不大。與其他實驗組相似，芳樟醇無論在葡萄汁還是葡萄酒中單萜烯的質量濃度都最高，在經KDLYS9-16發酵后的葡萄酒中質量濃度高達0.825 mg/L，是葡萄汁中質量濃度的3.29 倍，由于其閾值為25 μg/L[30]，所以芳樟醇對昌黎赤霞珠亞種16發酵酒風味香氣影響較大，使酒體花香比較突出，此外，香茅醇、α-萜品醇和香葉醇在KDLYS9-16發酵酒中的質量濃度也較高，僅次于芳樟醇，分別達到0.617、0.367 mg/L和0.305 mg/L，是葡萄汁中質量濃度的6.86、11.12 倍和2.40 倍，這3 種物質使KDLYS9-16發酵酒具有了花香、果香和青葉油香。α-蒎烯、月桂烯、L-薄荷醇、右旋香芹酮和（E）-香葉基丙酮僅存在于KDLYS9-16發酵酒中，在葡萄汁和SC發酵酒中未被檢測到，說明這些物質是經KDLYS9-16在發酵過程中釋放的酶水解相應的結合態物質而釋放的；2-茨酮和橙花醇同時存在于葡萄汁和葡萄酒中，經過發酵后質量濃度全部升高，尤其在KDLYS9-16的發酵酒中質量濃度增加明顯。

3 結 論

本研究建立了一種同時檢測葡萄汁和葡萄酒中13 種單萜烯類物質的方法，先以有機溶劑二氯甲烷進行液液萃取，然后旋轉蒸發、氮吹濃縮，再結合GC檢測技術，對2 個產區的2 種葡萄的葡萄汁和經2 種菌發酵后的酒，共12 個樣品進行了檢測。結果顯示：自選釀酒酵母KDLYS9-16在葡萄酒增香上相對于商品菌SC酵母具有明顯的優勢，使酒中單萜烯類物質質量濃度增加幅度較大，極大地促進了葡萄中結合態單萜烯前體物質水解成游離態單萜烯物質，且數據顯示赤霞珠干紅酒中的單萜烯質量濃度高于美樂葡萄酒。經自選菌發酵的昌黎赤霞珠干紅葡萄酒中單萜烯類物質質量濃度增加最多，相對增加量為308.88%，而經SC發酵后的沙城美樂葡萄酒中相對增加量最高僅為90.80%，經過自選酵母發酵后的4 種葡萄酒中分別檢測到9、11、10 種和11 種單萜烯物質，都高于相同發酵基質的SC發酵葡萄酒。這些都證明了自選酵母對單萜烯類物質在發酵過程種具有增加的作用，為今后對該菌的商業應用提供了數據支持。

實驗結果表明，本研究所建對葡萄酒中13 種單萜烯的檢測方法具有簡單、靈敏性高、重復性好等優點，可以對葡萄及葡萄酒中的單萜烯物質進行定性定量測定。

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Establishment of a Method for the Detection of Monoterpene Compounds and Effect of Saccharomyces cerevisiae KDLYS9-16 on Monoterpenes Production during Wine Fermentation

LI Yan1,2, ZHOU Lihua1
(1. College of Bioscience and Bioengineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China;2. Hebei R&D Center for Fermentation Engineering, Shijiazhuang 050018, China)

A method for simultaneously detecting 13 free monoterpene compounds in wine was established by liquid-liquid extraction coupled with gas chromatography with flame ionization detection (GC-FID). The monoterpene compounds in Cabernet Sauvignon and Merlot wines fermented by a commercial yeast strain SC or laboratory isolated Saccharomyces cerevisiae KDLYS9-16 from two wine producing areas in Shacheng and Changli, Hebei province, respectively were detected by this method. The results showed that the calibration curves exhibited a correlation coefficient (R2) of 0.996 7–0.999 3, and the limits of detection (LOD) varied between 0.580 and 1.073 mg/L. The recoveries were in the range of 89.98%–107.34% with relative standard deviations of 0.58%–3.18%. All four wines were higher in monoterpenes than grape must. The Cabernet Sauvignon dry red wine fermented by Saccharomyces cerevisiae KDLYS9-16 from Changli had the highest monoterpene concentration of 2.855 mg/L among the four wines, which was about 3.1 folds higher than that of grape must. Cabernet Sauvignon wine and must had a higher monoterpene concentration than Merlot wine and must. For both cultivars, the monoterpene concentration was higher in Shacheng must than in Changli must. The types and concentrations of monoterpenes in wine varied with cultivar. In conclusion, the established method in this study is simple,sensitive, and reproducibile and can be used for the detection of monoterpene compounds in grape and wine.

liquid-liquid extraction; GC-FID; monoterpene compounds; wine aroma

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724020

TS261.1

A

1002-6630（2017）24-0124-06

李艷, 周立華. 單萜烯物質檢測方法建立及自選酵母KDLYS9-16對單萜烯產生的影響[J]. 食品科學, 2017, 38(24):124-129.

10.7506/spkx1002-6630-201724020. http://www.spkx.net.cn

2017-03-30

河北省自然科學基金項目（C2011208028）

李艷（1958—），女，教授，學士，研究方向為傳統發酵工程創新技術、葡萄酒和果酒釀造。

E-mail：Lymdh5885@163.com

LI Yan, ZHOU Lihua. Establishment of a method for the detection of monoterpene compounds and effect of Saccharomyces cerevisiae KDLYS9-16 on monoterpenes production during wine fermentation[J]. Food Science, 2017, 38(24)∶ 124-129. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724020. http∶//www.spkx.net.cn