纖維素載體固定化β-葡萄糖苷酶及其在大豆異黃酮水解中的應用

姚軼俊，王立峰，鞠興榮

纖維素載體固定化β-葡萄糖苷酶及其在大豆異黃酮水解中的應用

姚軼俊1,2，王立峰1，鞠興榮1,2

（1.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，江蘇 南京 210023；2.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122）

建立纖維素載體固定化β-葡萄糖苷酶系統，用于黑豆漿中大豆異黃酮去糖基化反應，并對該催化系統進行了可行性評價。結果表明，在40 cm3纖維素顆粒上可結合超過40 mg β-葡萄糖苷酶，并且能有效將4-硝基苯-β-D-葡糖苷酸水解成對硝基苯酚，其反應最適溫度為50 ℃。經動力學測試后可得其米氏常數Km值為（1.38±0.20）mmol/L。將該固定化酶系統用于黑豆漿中大豆異黃酮去糖基化，通過高效液相色譜檢測其轉化效率，表明該系統可以在30 min內利用40 cm3含酶載體將50 mL黑豆漿中的異黃酮全部轉化為去糖基化形式。該固定化酶催化系統連續化催化穩定性實驗表明，在經過15 次反應以及15 d之后，該固定化酶系統仍然可維持其60%的催化活性。

β-葡萄糖苷酶；固定化；纖維素顆粒；黑豆漿；異黃酮去糖基化

大豆異黃酮是存在于大豆中的天然非固醇類物質，在干燥大豆中的含量約為1～5 mg/g[1]。由于其被攝入體內后能與雌激素受體結合，調節人體內的激素表現，因此又被稱為植物雌激素。經研究發現，攝入足量的大豆異黃酮可以有效降低罹患骨質疏松癥及婦女更年期綜合癥的風險[2]，在抗癌防癌[3]、預防心血管疾病[4]等方面也有重要的作用。另有文獻指出，在人體內帶有糖基形式的異黃酮不能直接被吸收，而是經腸道微生物產生的β-葡萄糖苷酶水解去糖基后進入血液，才能發揮各種生理作用[5-6]。但是人體腸道中的菌群由于個體因素會有較大差異，所以如果直接攝入不帶糖基的苷元型異黃酮，則可以有效提高其利用效率[7]。

目前糖基水解方式主要有酸水解和酶水解2 種。由于酸水解存在不安全因素，在一定程度上也會破壞異黃酮的結構，而酶作用條件溫和，所以后者越來越受到關注[8]。微生物生產的β-葡萄糖苷酶是目前主要應用于大豆異黃酮去糖基的酶。然而由于酶相對成本較高，反應過程中易失活，而且不能被回收利用，因此應用上存在局限性。所以，如果將酶固定到化學性質穩定的不溶性載體上，則可以有效解決上述問題[9]。

本實驗探究了一種用纖維素顆粒作為載體固定β-葡萄糖苷酶的方法，用于黑豆漿中大豆異黃酮去糖基作用，以期建立可用于穩定、高效生產具有高生理活性黑豆漿的反應系統。其固定方法包括纖維素載體的合成與修飾，纖維素載體與酶的共價結合；利用固定化酶技術在黑豆漿的加工過程中實現酶的重復利用以及方便產物的分離，在生產應用中具有較高的經濟效應；同時，由于纖維素是大多數農業廢棄物的主要成分，因此該研究也為今后開發直接以農業廢棄物為載體的固定化酶系統提供了理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究所使用市售黑豆購自南京雨花路農產品市場，并貯存在干燥環境下；纖維素載體為本實驗室合成，將醋酸纖維素粉末溶于丙酮和二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）以體積比3∶2所組成的有機溶劑中，并逐滴滴入冷水中形成纖維素小球[10]。

β-葡萄糖苷酶、4-硝基苯-β-D-葡糖苷酸（p-nitrophenyl-β-D-glucuronide，p-NPG）、乙腈（色譜級）、大豆苷元、大豆苷、染料木素、染料木苷標準品美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 日本Jasco公司；Free Dry System/Freezone?4.5冷凍干燥機 美國Labconco公司；Model JSM-6300掃描式電子顯微鏡 日本JEOL公司；酶聯免疫測試儀 美國Molecular Devices公司；CP213型電子天平 美國Ohaus公司；KW-1000DC型數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 纖維素載體的合成與修飾

取6.25 g市售纖維素粉末溶于50 mL丙酮與DMSO組成的有機溶劑中，將所得溶液用針筒逐滴滴入冷水中，形成纖維素顆粒并將其置于室溫下干燥待用。量取體積大約為40 cm3所述纖維素顆粒置于100 mL濃度為0.2 mol/L的NaOH溶液中，40 ℃保溫90 min，以增加其表面的羥基數目[11-12]。

1.3.2 纖維素載體與酶的共價結合

將經上述步驟加熱處理過的40 cm3纖維素載體置于50 mL 100 ℃體積分數為3%的戊二醛溶液中1 h后，在室溫下用蒸餾水沖洗。將β-葡萄糖苷酶溶于濃度為0.1 mol/L、pH 6的磷酸緩沖液中形成質量濃度為1 mg/mL的酶溶液50 mL，并與經上述步驟處理過的纖維素載體在4 ℃條件下混合靜置16 h。最后，用紗布將酶溶液濾去并保留濾液待測，用0.1 mol/L、pH 6的磷酸緩沖液沖洗纖維素載體，得到所述固定化酶，4 ℃貯存。

1.3.3 固定化酶含量測定

將1 mg/mL的β-葡萄糖苷酶溶液稀釋，分別加入10 μL與200 μL 10%的染色劑考馬斯亮藍，30 min后測定其在595 nm波長處的吸光度，繪制標準曲線。在制備固定化酶所得的濾液中加入10 μL 10%的染色劑考馬斯亮藍，30 min后測定其在595 nm波長處的吸光度，根據標準曲線方程得出濾液中殘留的蛋白含量，從而得到固定于載體上的酶含量[13]。

1.3.4 載體表面共價鍵及形態學描述

用于化學分析的電子能譜（electron spectroscopy for chemical analysis，ESCA）屬于表面分析法，可偵測固體樣品表面所含的元素種類、化學組成以及有關的電子結構等重要信息，在各種固體材料的基礎研究中具有重要應用價值[14]。在本實驗中，ESCA被用于檢測并驗證酶蛋白分子以共價鍵成功固定化于纖維素載體上。

利用掃描式電子顯微鏡能夠快速、有效地獲得固體樣品表面的微小區域形貌和成分信息。其應用于固定化酶的分析檢測中可以用以觀察晶體形態，酶表面結構，以及載體上活性成分的分散狀態以便鑒定酶的固定化情況[15]。在本實驗中，將固定化前后的載體樣品冷凍干燥并在真空條件下鍍金60 s兩次后用掃描式電子顯微鏡在10 kV的電子強度下觀察其表面結構的變化。

1.3.5 固定化酶最適作用溫度及酶促反應動力學性質測定

在pH值為6的磷酸緩沖液中加入5 mg p-NPG，依次以所述固定化酶在30、40、50、60 ℃和70 ℃，100 r/min反應1 h。取反應后的底物900 μL加入到1 mL濃度為1 mol/L Na2CO3溶液中，在425 nm波長處測定其OD值。

配制濃度為0.1～20 mmol/L的p-NPG溶液作為底物，分別用固定化酶在其最適反應溫度下作用5 min后，取900 μL加入到1 mL濃度為1 mol/L的Na2CO3溶液中，在425 nm波長下測定其OD值并根據標準曲線算出產物濃度，酶促反應動力學常數Km值計算見公式（1）：

式中：Km為米氏常數/（mmol/L）；v為反應初速率/（mmol/（L·min））；vmax為最大反應速率/（mmol/（L·min））；[S]為底物濃度/（mmol/L）。

1.3.6 HPLC分析

1.3.6.1 樣品制備

將100 g黑豆浸泡于1 L 4 ℃水中過夜。將浸泡過的黑豆及水一起磨成豆漿，并用雙層豆漿布過濾，濾去豆渣。將磨好的豆漿在殺菌釜中121 ℃滅菌20 min后于4 ℃貯存備用。

將50 mL黑豆漿與50 cm3纖維素固定化酶混合，50 ℃反應2 h。取反應后的黑豆漿0.5 mL，與0.5 mL溶有0.2%苯甲酸（內標）的甲醇溶液混合，離心3 min取上清液0.5 mL，與體積分數50%的甲醇溶液混合，用0.45 nm濾膜過濾后離心3 min，用于HPLC分析其中異黃酮組成及含量。

1.3.6.2 色譜條件

HPLC是在氣相層級色譜和傳統液相色譜的基礎上發展起來的分析分離技術，是利用物質在固定相和流動相之間具有不同的平衡分配系數來進行分離的方法。當兩相做相對運動時，被測樣品在兩相之間進行反復多次的物質交換，這樣使原來微小的性質差異產生了很大的效果，進而達到分析、分離及測定一些物理化學常數的目的[16]。

依據Wang Huiju等[17]的方法加以修飾。使用YMCPack ODS-AMC C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），在室溫下以梯度流洗的方式進行分析，梯度條件如下：A為體積分數0.1%冰醋酸溶液，pH 3.4，B為含體積分數0.1%冰醋酸-乙腈。進樣量20 μL，洗脫程序：0～20 min，15%～30% B；20～30 min，30%～45% B；30～35 min，45%～60% B；35～45 min，60%～70% B。平衡時間10 min，流速1.0 mL/min，檢測波長254 nm。

1.4 數據計算

大豆異黃酮含量、去糖基化效率、總異黃酮中苷元比例的計算見公式（2）～（4）：

式中：As為異黃酮組分所對應HPLC圖譜的積分面積；AIS為苯甲酸的HPLC圖譜積分面積；CIS為內標濃度/（mmol/L）；RRF為相對反應因子（大豆苷4.23，染料木苷7.50，大豆苷元9.91，染料木素9.09）；mw為大豆異黃酮相對分子質量。

2 結果與分析

2.1 固定化酶含量

據文獻[18-20]，在固體顆粒表面固定化β-葡萄糖苷酶時，載體體積為40 cm3其固定化效果最佳。因此在本實驗中纖維素載體量采用40 cm3。在pH 6、4 ℃條件下，每40 cm3的固體載體上可固定（40.27±1.42）mg酶，其蛋白結合率可達到（80.53±2.85）%。

2.2 β-葡萄糖苷酶與纖維素載體的電子能圖譜

ESCA技術又稱為X射線光電子能譜，當X射線與樣品相互作用后，激發出某個能量上的電子，測量這一電子的動能，可以得到樣品中有關的電子結構信息[21]。在本實驗中，利用該方法可以驗證固定化β-葡萄糖苷酶前后，纖維素載體表面的鍵結變化情況。由圖1可知，纖維素經NaOH修飾處理后表面羥基數目增加，并與戊二醛發生縮醛反應。

圖1 以碳、氮元素為基準的纖維素載體固定化酶前后表面鍵結ESCA結果Fig. 1 C1s and N1s ESCA spectra of free and immobilized β-glucosidase

圖1 A2與圖1A1相比，可以發現285.8 eV處新增加了表示—C＝N—鍵結的尖峰，在287.35 eV處的峰值降低；圖1B2與圖1B1相比可發現在399.8 eV處新增了表示—C＝N—官能基的尖峰。綜上可得，酶蛋白分子的游離氨基端通過戊二醛的作用連接到了纖維素載體表面的游離羥基上，并與纖維素分子形成交聯結構。

2.3 固定β-葡萄糖苷酶前后纖維素載體的表面微觀結構

圖2 纖維素載體固定化酶前后表面微觀結構Fig. 2 Microstructure of cellulose particles without and with β-glucosidase immobilization

由圖2A可知，該纖維素載體直徑約為1.5 mm，在高倍率檢測下其表面均勻光滑。由圖2B可知，在相同條件下測得固定化β-葡萄糖苷酶后的纖維素載體，可以發現其表面布滿了蛋白顆粒，將其放大至3 000 倍，可清晰觀察到其蛋白質分子的顆粒。

2.4 不同溫度下固定化酶與游離酶的相對活性對比

不同溫度會影響酶的活性，且與其固定化的材料、方法密切相關。固定化酶與其游離酶相比，在不同溫度下的相對酶活性會發生改變[22]。可能的原因是載體改變了反應過程中的傳質速率，以及在高溫下載體上會有用于修飾的化學物質釋出，影響酶活性。用p-NPG作為反應底物，通過測定相同反應時間后的產物對硝基苯酚的量以表示該條件下的相對酶活性。首先將不同濃度（1 mmol/L對硝基苯酚稀釋5 次）的對硝基苯酚置于適量1 mol/L NaCO3溶液中，測定425 nm波長處的吸光度，并據此繪制標準曲線，其R2為0.997 5，標準曲線方程為y=2.911 5x＋0.083 2。由于1 mol p-NPG被水解后產生1 mol對硝基苯酚，因此溶液中p-NPG被完全催化產生0.33 mol對硝基苯酚，根據標準曲線得到對應吸光度為1.04。將反應測得吸光度與該值相比可得到相對酶活性。

圖3 不同溫度條件下固定化酶與游離酶的相對活性Fig. 3 Relative activity of free and immobilized β-glucosidase at different temperatures

由圖3可知，纖維素固定化酶的最適作用溫度是50 ℃，與游離酶相比降低了10 ℃，并且在最適溫度處的酶活性顯著大于游離酶活性，從而有利于降低反應成本。

2.5 固定化酶系統動力學分析

利用不同濃度的底物在相同反應時間內生成產物的量，對纖維素固定化酶系統進行酶動力學測試。當系統的最大反應速率越大，酶動力學參數Km值越小，表明此系統催化反應時最大反應速率越大，同時達到最大反應速率所需底物濃度越小，該系統越有優勢[23]。根據酶動力學方程（R2=0.98）可得纖維素固定化酶的最大反應速率為（0.073 3±0.003 4）mmol/（L·min），表示當其反應速率達到（0.073 3±0.003 4）mmol/（L·min）時，增加底物濃度其反應速率不會增加。酶動力學參數Km值為（1.382 6±0.204 3）mmol/L，表示該系統達到最大反應速率一半時所需要的底物濃度為（1.382 6±0.204 3）mmol/L。

2.6 纖維素固定化酶系統對黑豆漿中大豆異黃酮的水解效率

纖維素固定化酶系統在與黑豆漿反應0～45 min時豆漿中4 種異黃酮的含量以及去糖基化效率見表1。該系統完全水解轉化50 mL黑豆漿中的大豆苷和染料木苷分別需要20 min和30 min。此結果與文獻中利用咖啡渣[18]以及納米玻璃粉末[19]作為載體的固定化酶系統相比大致相同。反應結束后豆漿中苷元形式的異黃酮占原來豆漿中總異黃酮含量的70.6%，相同時間內染料木苷的轉化率高于大豆苷。

表1 纖維素固定化酶系統催化反應不同時間后黑豆漿中異黃酮含量以及轉化率Table 1 Isoflavone contents of black soymilk treated for different time by immobilized β-glucosidase

圖4 固定化酶系統催化條件下黑豆漿中大豆苷與大豆苷元的轉化Fig. 4 Conversion of daidzin to daidzein in black soymilk by the immobilized enzyme

圖5 固定化酶系統催化條件下黑豆漿中染料木苷與染料木素的轉化Fig. 5 Conversion of genistin to genistein in black soymilk by the immobilized enzyme

由圖4和圖5可得，大豆苷及染料木苷水解中所有糖苷型異黃酮完全轉化為所對應苷元所需時間分別為20 min和30 mim。50%糖苷型異黃酮轉化為所對應苷元所需時間分別為8 min和9 min。與使用霉菌發酵最少需要4～8 h相比[24-25]，該固定化酶系統具有明顯的優勢，能夠在短時間內將黑豆漿中的異黃酮轉化為具有高價值的苷元形式。

2.7 纖維素固定化酶系統的穩定性

使用該固定化酶系統進行連續轉化生產富含去糖基化形式大豆異黃酮的黑豆漿，系統的穩定性顯得尤為重要。因此，本實驗通過連續催化20 個重復周期以及催化30 d以測試其反應穩定性。

圖6 纖維素固定化酶系統水解黑豆漿中異黃酮重復使用穩定性Fig. 6 Reusable stability of immobilized β-glucosidase for isoflavone deglycosylation in black soymilk

圖7 纖維素固定化酶系統水解黑豆漿中異黃酮貯存穩定性Fig. 7 Storage stability of immobilized β-glucosidase for isoflavone deglycosylation in black soymilk

圖6 為連續20 次反應中異黃酮糖苷的轉化率。在實驗過程中，在40 cm3固定化酶系統中加入50 mL新鮮黑豆漿，在50 ℃條件下催化30 min后以其中苷元態的異黃酮占總異黃酮比例作為指標。之后移除黑豆漿用蒸餾水沖洗系統后重新加入新鮮黑豆漿再次反應，如此重復10 次。由圖6可知，10 次催化反應后其轉化率可保持初始效率的70%以上。連續15 次反應后系統催化活性為初始值的50%～60%。因此該系統可被認為具有較高的重復利用穩定性。由圖7可知，實驗中測試了30 d中該系統對異黃酮糖苷轉化率的變化，將新制得的固定化酶系統從第1天起每隔2～5 d進行催化，其余時間貯存于4 ℃條件下。15 d之后該系統仍可維持初始轉化率的60%，因此在工業生產中可以維持約兩周的生產，符合生產的經濟效益。

比較以上兩部分實驗結果可得，在進行連續催化過程中重復使用對固定化酶系統活性的影響比較大，在貯存5 d之內再次測試該系統酶活性無顯著差異。因此，如果將其應用在工業化生產過程中5 d之內只需考慮其因重復使用而降低的活性，因此該系統適合進行密集式的生產。之前微生物系統經常用于對豆漿中異黃酮進行水解去糖基化，利用霉菌所產生的酶對其進行不同條件的發酵，以達到目的。但是該方法設備昂貴（如發酵槽）、操作復雜以及需要花費大量成本用來防治雜菌污染[26]。此外，與固定化酶系統相比，微生物系統最大的劣勢是所需時間較長，由于霉菌自身生長以及將酶分泌到胞外均需要一定時間，所以在微生物系統時首先需要對菌種進行活化，在催化異黃酮糖苷轉化過程中也需要比較長的時間[27-28]。經實驗證明，如利用根霉菌進行轉化，首先需要8 d進行菌的活化及菌絲生長；該系統至少需要8 h可將黑豆漿中的異黃酮完全轉化為苷元形式[29-30]。

3 結 論

將β-葡萄糖苷酶固定化到纖維素載體上可建立高效、經濟與穩定的催化反應系統應用于黑豆漿中大豆異黃酮去糖基作用，以得到具有高生理活性的黑豆漿。該系統最適作用溫度為50 ℃，并可在30 min內用40 cm3固定化之后的載體將50 mL黑豆漿中的異黃酮全部水解成苷元形式。該系統具有較高反應穩定性。在重復使用15 次以及催化15 d之后仍可維持60%的初始酶活性。

在未來的工作中，需要進一步研究突破的有兩點。其一是尋找更為廉價易得酶固定化載體以降低成本。在這方面，農業廢棄物擁有重要地位。由于農業廢棄物絕大多數含有大量纖維素成分，因此被開發作為酶固定化載體被認為是可行的。目前已經利用咖啡渣作為載體的研究，將來可進一步延伸擴展至茶葉渣、秸稈等多種材料。其二，目前在成本方面最大的限制是酶本身，商業化的酶由于其來源及制備提純工藝往往成本較高，所以在未來如能利用基因工程等分子生物學技術進行菌種改良，將表達該酶的基因轉入如大腸桿菌等細菌中，實現酶的大量表達，可以從根本上降低生產的成本。

[1] MURPHY P A, SONG T, BUSEMAN G, et al. Isoflavones in retail and institutional soy foods[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 1999, 47(7)∶ 2697-2704. DOI∶10.1021/jf981144o.

[2] ATKINSON C, COMPSTON J E, DAY N E, et al. The effects of phytoestrogen isoflavones on bone density in women∶ a double-blind,randomized, placebo-controlled trial[J]. American Journal of Clinical Nutrition, 2004, 79(2)∶ 326-333. DOI∶10.1051/rnd∶2004021.

[3] MAGEE P J, ROWLAND I R. Phyto-oestrogens, their mechanism of action∶ current evidence for a role in breast and prostate cancer[J].British Journal of Nutrition, 2004, 91(4)∶ 513-531. DOI∶10.1079/BJN20031075.

[4] LICHTENSTEIN A H. Soy protein, isoflavones and cardiovascular disease risk[J]. Journal of Nutrition, 1998, 128(10)∶ 1589-1592.DOI∶10.1046/j.1365-277X.1998.00124.x.

[5] IZUMI T, PISKULA M K, OSAWA S, et al. Soy isoflavone aglycones are absorbed faster and in higher amounts than their glucosides in humans[J]. Journal of Nutrition, 2000, 130(7)∶ 1695-1699.DOI∶10.1038/sj.ijo.0801256.

[6] RIE T, REILO O, CHIKAKO K, et al. Antioxidant activities of black and yellow soybeans against low density lipoprotein oxidation[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2005, 53(11)∶ 4578-4582.DOI∶10.1021/jf048062m.

[7] TSANGALIS D, STOJANOVSKA A L, WILCOX G, et al.Development of an isoflavone aglycone-enriched soymilk using soy germ, soy protein isolate and bifidobacteria[J]. Food Research International, 2004, 37(4)∶ 301-312. DOI∶10.1016/j.foodres.2004.01.003.

[8] LEI Z, JIANG Q. Synthesis and properties of immobilized pectinase onto the macroporous polyacrylamide microspheres[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2011, 59(6)∶ 2592. DOI∶10.1021/jf103719t.

[9] DERVAKOS G A, WEBB C. On the merits of viable-cell immobilisation[J]. Biotechnology Advances, 1991, 9(4)∶ 559-612.DOI∶10.1016/0734-9750(91)90733-C.

[10] CHEN L F, TSAO G T. Physical characteristics of porous cellulose beads as supporting material for immobilized enzymes[J].Biotechnology & Bioengineering, 1976, 18(11)∶ 1507-1516.DOI∶10.1002/bit.260181103.

[11] ALBAYRAK N, YANG S T. Immobilization of Aspergillus oryzae, β-galactosidase on tosylated cotton cloth[J]. Enzyme &Microbial Technology, 2002, 31(4)∶ 371-383. DOI∶10.1016/S0141-0229(02)00115-1.

[12] CHEN L F, TSAO G T. Chemical procedures for enzyme immobilization on porous cellulose beads[J]. Biotechnology &Bioengineering, 1977, 19(10)∶ 1463-1473. DOI∶10.1002/bit.260191005.

[13] RASOOLY A, HEROLD K E, RASOOLY, et al. Biosensors and biodetection∶ methods and protocols[M]. Clifton∶ Humana Press, 2009∶31-35.

[14] FELGUAIRAS M L, CHICAU G, MOUTINHO-PEREIRA J M, et al. Effects of Esca disease on leaf gas exchanges of cv. Alvarinho in a vineyard of the Portuguese Vinho Verde Region[C]//International Workshop on Grapevine Trunk Diseases∶ Esca and Grapevine Declines, 2006∶ 17-21.

[15] LIU F Y, LI J F, GUAN X, et al. SEM study on filum terminale with tethered cord syndrome[J]. Child’s Nervous System, 2011, 27(12)∶2141-2144. DOI∶10.1007/s00381-011-1414-0.

[16] GARNDER C D, OELRICH B, LIU J P, et al. Prostatic soy isoflavone concentrations exceed serum levels after dietary supplementation[J].Prostate, 2009, 69(7)∶ 719-726. DOI∶10.1002/pros.20922.

[17] WANG H J, MURPHY P A. Isoflavone composition of American and Japanese soybeans in Iowa∶ effects of variety, crop year, and location[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1994, 42(8)∶1674-1677. DOI∶10.1021/jf00044a017.

[18] CHEN K I, LO Y C, LIU C W, et al. Enrichment of two isoflavone aglycones in black soymilk by using spent coffee grounds as an immobiliser for β-glucosidase[J]. Food Chemistry, 2013, 139(1/2/3/4)∶79-85. DOI∶10.1016/j.foodchem.2013.01.093.

[19] CHEN K I, LO Y C, SU N W, et al. Enrichment of two isoflavone aglycones in black soymilk by immobilized β-glucosidase on solid carriers[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2012, 60(51)∶12540-12546. DOI∶10.1021/jf304405t.

[20] YANG P H, WEI W, CAI H H, et al. Immobilization of antitransferrin on nano-gold and its immune recognition of transferrin[J].Spectroscopy & Spectral Analysis, 2009, 29(5)∶ 1398-1401.DOI∶10.3964/j.issn.1000-0593(2009)05-1398-04.

[21] 劉芬, 趙志娟, 邱麗美, 等. XPS光電子峰和俄歇電子峰峰位表[J]. 分析測試技術與儀器, 2009(1)∶ 1-17. DOI∶10.3969/j.issn.1006-3757.2009.01.001.

[22] 曹詩林, 徐培, 馬永正, 等. 納米載體固定化酶的最新研究進展[J]. 催化學報, 2016(11)∶ 1814-1823. DOI∶10.1016/S1872-2067(16)62528-7.

[23] GOIDSTEIN L. Kinetic behavior of immobilized enzyme systems[J].Methods in Enzymology, 1976, 44(1)∶ 397. DOI∶10.1016/S0076-6879(76)44031-4.

[24] CHENG K C, LIN J T, WU J Y, et al. Isoflavone conversion of black soybean by immobilized Rhizopus spp.[J]. Food Biotechnology, 2010,24(4)∶ 312-331. DOI∶10.1080/08905436.2010.524459.

[25] CHENG K C, WU J Y, LIN J T, et al. Enhancements of isoflavone aglycones, total phenolic content, and antioxidant activity of black soybean by solid-state fermentation with Rhizopus spp.[J].European Food Research and Technology, 2013, 236(6)∶ 1107-1113.DOI∶10.1007/s00217-013-1936-7.

[26] 發酵技術. 食品工業中發酵技術的前景[J]. 食品與發酵工業,1977(2)∶ 92-99.

[27] 張雯煜, 王雪奇. 異黃酮的微生物發酵和酶轉化生產[J]. 輕工科技,2007, 23(8)∶ 13-14. DOI∶10.3969/j.issn.1003-2673.

[28] CHIEN H L, HUANG H Y, CHOU C C. Transformation of isoflavone phytoestrogens during the fermentation of soymilk with lactic acid bacteria and bifidobacteria[J]. Food Microbiology, 2006, 23(8)∶ 772-778. DOI∶10.1016/j.fm.2006.01.002.

[29] 李爽, 鄭毅男, 韓佳彤, 等. 發酵處理對毛豆異黃酮苷元含量及其乙醇提取物抗氧化活性的影響[J]. 西北農林科技大學學報(自然科學版), 2016(7)∶ 202-208; 214. DOI∶10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.07.028.

[30] LEE M, HONG G E, ZHANG H, et al. Production of the isoflavone aglycone and antioxidant activities in black soymilk using fermentation with Streptococcus thermophilus, S10[J]. Food Science and Biotechnology, 2015, 24(2)∶ 537-544. DOI∶10.1007/s10068-015-0070-7.

Immobilization of β-Glucosidase onto Cellulose Particles for Application in Hydrolysis of Soybean Isoflavones

YAO Yijun1,2, WANG Lifeng1, JU Xingrong1,2
(1. Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety, College of Food Science and Engineering,Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210023, China;2. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

This study was conducted to evaluate the feasibility of conversion of isoflavones in soymilk using celluloseimmobilized β-glucosidase. β-glucosidase was immobilized onto cellulose particles with a loading capacity of over 40 mg of enzyme/40 cm3carrier. The immobilized enzyme exhibited a significant efficiency for the conversion of 4-nitrophenylβ-D-glucuronide (p-NPG) to p-nitrophenol. The optimal temperature for the enzyme was 50 ℃ and the Michaelis constant(Km) value was determined to be (1.38 ± 0.20) mmol/L. All isoflavones in black soymilk were completely converted to deglycosylated derivatives within 30 min using 40 cm3of the immobilized enzyme as analyzed by high-performance liquid chromatography (HPLC). Experimental evaluation of the stability showed that immobilized β-glucosidase retained 60% of its original activity after 15 times repeated use and after 15 days of storage.

β-glucosidase; immobilization; cellulose particles; black soymilk; isoflavone deglycosylation

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724028

Q814.2

A

1002-6630（2017）24-0177-06

姚軼俊, 王立峰, 鞠興榮. 纖維素載體固定化β-葡萄糖苷酶及其在大豆異黃酮水解中的應用[J]. 食品科學, 2017, 38(24)∶177-182. DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724028. http∶//www.spkx.net.cn

YAO Yijun, WANG Lifeng, JU Xingrong. Immobilization of β-glucosidase onto cellulose particles for application in hydrolysis of soybean isoflavones[J]. Food Science, 2017, 38(24)∶ 177-182. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724028. http∶//www.spkx.net.cn

2017-01-22

江蘇省高校自然科學研究面上項目（15KJB550006）；“十三五”國家重點研發計劃重點專項（2016YFD0400201-1）；

江蘇省產學研前瞻性聯合研究項目（BY2016009-01）；江蘇高校優勢學科建設工程資助項目（PAPD）

姚軼俊（1989—），女，助理研究員，博士研究生，研究方向為糧食、油脂及植物蛋白工程。E-mail：yyj@njue.edu.cn