超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道離子阱質譜測定植物提取物中的7 種合成色素

朱振寶，張亞莉，賈 瑋，孔祥虹，何 強

超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道離子阱質譜測定植物提取物中的7 種合成色素

朱振寶1，張亞莉2，賈 瑋1，孔祥虹2，何 強2

（1.陜西科技大學食品與生物工程學院，陜西 西安 710021；2.陜西省出入境檢驗檢疫分析中心食品實驗室，陜西 西安 710068）

基于高分辨質譜，建立植物提取物中7 種合成色素的快速檢測方法。樣品經超純水提取，采用聚酰胺固相萃取小柱凈化，以C18色譜柱為分析柱，乙腈和5 mmol/L乙酸銨溶液作為流動相，經超高效液相色譜進行梯度洗脫分離，利用四極桿靜電場軌道離子阱質譜測定。結果表明：在10～500 μg/mL范圍內，7 種限用及禁用合成色素線性關系良好，相關系數（r2）均大于0.99。通過加標驗證實驗，在0.05、0.1、0.5 mg/kg 3 個加標水平下，該方法的檢出限可達到0.001 2～0.052 mg/kg，加樣回收率為60.8%～91.8%，相對標準偏差為2.1%～6.5%。通過實際樣品檢測，結果表明本方法樣品處理過程簡單，分析時間短，準確可靠，靈敏度高，適用于植物提取物中合成色素的快速篩查及確證。

植物提取物；合成色素；超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道離子阱質譜；高分辨質譜

植物提取物是以天然植物為原料，通過物理或化學提取、純化等工藝，選擇性的獲取、富集植物中有效成分而形成的生物制品[1-3]。在經濟利益驅使下，一些不法企業(yè)在食品等產品中添加合成色素染色以使產品外觀鮮艷、以次充好、吸引消費者從而提高價格。由于合成色素中砷、鉛、銅、苯酚、苯胺、乙醚、氯化物和硫酸鹽等會對人體造成不同程度的傷害[4]，長期攝入添加合成色素的食品，可能引發(fā)癌癥[5-7]，因此合成色素的濫用也成為影響植物提取物出口的安全問題之一[8]。由于植物提取物基質復雜，GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》[9]中的檢測方法不適合植物提取物，并且關于植物提取物中合成著色劑的限量并沒有明確規(guī)定，相關法律法規(guī)還不完善，因此亟需建立快速、簡便、靈敏度高的植物提取物中合成色素的篩查和檢測方法。

目前合成色素檢測主要有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[10-12]和液相色譜-質譜（liquid chromatography-mass spectrography，LC-MS）聯(lián)用法[13-16]，這2 種傳統(tǒng)方法對目標化合物的定性必須要有相應的標準品。超高效液相色譜/四極桿-靜電場軌道離子阱質譜（ultra high performance liquid chromatography/quadrupole-electrostatic field orbital ion trap mass spectra，UPLC-Q-Orbitrap）將高選擇性的四極桿與軌道離子阱高分辨準確質量數測量技術有機結合，能進行目標物和非目標物的高通量篩選[17-18]，而且能對目標物進行多級質譜分析，能夠在沒有標準品的情況下通過精確質量數對未知物進行快速篩查與結果確認[19]。由于具有樣品前處理凈化能力要求低、高效、方便等優(yōu)點，UPLC-Q-Orbitrap技術在快速篩查方面得到了廣泛應用[20]。如黎永樂等[21]利用液相色譜/線性離子阱-靜電場軌道阱高分辨質譜技術建立了葡萄酒中合成色素的快速篩查方法，該方法可在無標準物質的情況下對葡萄酒中的15 種合成色素進行篩查檢測。目前，相關報道該技術可應用于食品中農藥殘留的篩查及定量分析[22-25]、保健食品中非法添加藥物的篩查和測定[26-27]等領域。

本研究采用聚酰胺固相萃取小柱凈化，UPLC-QOrbitrap測定，構建了植物提取物中7 種合成色素的快速篩查方法，使用精確質量數及二級質譜對目標化合物進行篩選與確證，能夠快速分析植物提取物中7 種限用及禁用合成色素。針對現有國標方法不適合基質復雜的植物提取物的檢測等實際問題，建立了不需要標準品，能夠快速篩查樣品中是否含有限用及禁用色素，通過實際植物提取物樣品檢測，驗證了方法的可靠性，本方法可為植物提取物的質量控制提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈（均為色譜級） 美國TEDIA公司；氨水、乙酸銨及其他試劑均為分析純。

標準品：紅色2G（CAS：3734-67-6）、檸檬黃（CAS：1934-21-0）、胭脂紅（CAS：1390-65-4）、誘惑紅（CAS：25956-17-6）、日落黃（CAS：2783-94-0）、亮藍（CAS：3844-45-9）、莧菜紅（CAS：915-67-3），以上試劑純度大于98%，均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司。

材料：納豆、櫻桃、甜菜、萬壽菊、黑加侖、大豆、肉桂、芒果等植物提取物均購于西安本地公司。

1.2 儀器與設備

Q-Exactive超高效液相-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜聯(lián)用儀 美國Thermo Fisher公司；AllegraTMX-22R高速離心機 德國Beckman公司；VORTEX GENIUS3渦旋混合器、振蕩器 德國IKA公司；Advantage-10/Elix Milli-Q超純水器 美國Millipore公司；Turbo Vap?LV氮吹濃縮儀 美國Caliper公司；Anpelclean PA聚酰胺固相萃取小柱（3 mL，500 mg；使用前依次用5 mL甲醇、5 mL水活化） 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

1.3.1.1 提取

精確稱取（3±0.01）g植物提取物于15 mL具塞離心管中，加入10.0 mL超純水溶解后，振蕩提取30 min，3 900 r/min離心5 min，取上清液轉移至另一個15 mL離心管中，殘渣再加入5 mL水溶解，重復上述操作，合并2 次上清液，待凈化。

1.3.1.2 凈化

準確移取上述提取液5.0 mL，轉移至已活化的聚酰胺固相萃取柱中，待樣品液全部流出后，先用3 mL甲醇-甲酸-水（1∶2∶5，V/V）淋洗，再用3 mL水淋洗小柱，棄去淋洗液，然后依次用5 mL甲醇和5 mL含體積分數10%氨水-甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，40 ℃氮氣吹至近干，殘渣用1.0 mL超純水溶解定容，過0.22 μm水系濾膜，上機分析測定。

1.3.2 測定條件優(yōu)化

1.3.2.1 超高效液相色譜條件

色譜柱的選擇：研究不同的色譜柱對7 種水溶性合成色素的分離效果。具體規(guī)格：柱1為Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱2為Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），柱3為Waters Acquity UPLC BEH Shield RP18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱4為Waters CORTECSTMUPLC C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.6 μm），柱5為Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）。使用50 ng/mL標準溶液在各規(guī)格色譜柱上進樣分離得到色譜圖。

流動相選擇：采用水-乙腈、水-甲醇、體積分數0.1%甲酸溶液-乙腈、體積分數0.1%甲酸溶液-甲醇、乙腈-5 mmol/L乙酸銨溶液、甲醇-5 mmol/L乙酸銨溶液作為流動相，研究不同流動相對7 種水溶性合成色素分離效果及靈敏度的影響。

提取溶劑的選擇：綜合考慮7 種合成色素的理化性質，胭脂紅、日落黃和誘惑紅是強極性著色劑，分別研究了超純水、體積分數20%氨水、無水乙醇-氨水-水（7∶2∶1，V/V）作為提取劑對7 種限用合成色素的提取效果。向陰性樣品中添加50 μg/g標準品，進行加標回收率實驗。

色譜條件：色譜柱：Waters AcquityTMUPLC BEH Shield RP18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相A為乙腈，流動相B為5 mmol/L乙酸銨溶液。梯度洗脫條件：0～1.0 min，5% A；1.0～3.0 min，5%～100% A；3.0～5.0 min，100% A；5.0～5.5 min，100%～5% A；5.5～6.0 min，5% A。柱溫35 ℃，流速0.3 mL/min，進樣量10 μL。

1.3.2.2 固相萃取方法優(yōu)化

固相萃取柱的選擇：本實驗比較了HLB（Bond Elut HLB，500 mg，3 mL）、C18（Bond Elut C18，500 mg，3 mL）和聚酰胺固相萃取小柱（Anpelclean PA，3 mL，500 mg）。

淋洗液及洗脫液的選擇：采用聚酰胺固相萃取小柱為凈化柱，用不同的淋洗液及洗脫液對凈化方式進行優(yōu)化。根據7 種水溶性合成色素的理化性質，本實驗采取了6 種方案，以空白櫻桃提取物為樣品，添加標準溶液濃度為50 μg/g，進行回收率測定。

1.3.3 質譜條件

表1 7 種合成色素的質譜信息Table 1 Mass parameters for the 7 artificial dyes

電噴霧離子源，質量分析器為Orbitrap，掃描模式采用負離子掃描模式，數據依賴性掃描Full MS-dd MS2，噴霧電壓2.8 kV；質量掃描范圍m/z 200～900；毛細管溫度350 ℃；鞘氣（氮氣）與輔助氣流速分別為4.09 L/min和5.08 L/min，輔助氣溫度320 ℃；全掃描和二級掃描分辨率分別為70 000和17 500。7 種水溶性限用合成色素的具體質譜參數見表1。

1.3.4 基質效應計算

本實驗采用相對響應值法消除基質效應。基質效應采用以下公式計算：

式中：A為在純溶劑中目標化合物的響應值；B為樣品中添加的相同含量合成色素的響應值。

2 結果與分析

2.1 質譜條件優(yōu)化

利用UPLC-Q-Orbitrap對7 種目標化合物的混合標準物進行負離子全掃描，得到一級全掃描質譜圖，以各化合物的分子離子峰[M-nNa＋mH]（n-m）-理論精確質量數提取色譜圖，圖1為陰性納豆提取物中添加7 種水溶性合成色素的總離子流色譜圖（添加水平50 μg/mL）。7 種合成色素的相對質量標準偏差小于4×10-6，符合高分辨要求[17]，二級掃描采用數據依賴性掃描，采集待測化合物的二級質譜圖進行進一步定性（圖2）。

圖1 陰性納豆提取物中添加7 種合成色素標準品的一級全掃描質譜圖Fig. 1 Full-scan mass spectra of 7 artificial dye standards

圖2 7 種合成色素標準品的二級質譜圖Fig. 2 MS2 spectra of 7 artificial dye standards

2.2 色譜條件優(yōu)化結果

2.2.1 色譜柱選擇

色譜分離實驗結果表明：對于柱2，檸檬黃洗脫峰的響應過低，柱5所有峰形較寬，且檸檬黃出峰過早（為0.68 min）。柱4與柱1的效果相差不大，且所有峰的峰形和分離效果均不及柱3理想。柱3所有目標峰的響應高，洗脫峰形對稱、尖銳，且分離效果好，可能BEH Shield RP18的C18鍵合相內嵌極性官能團，對高水相具有良好的分離效果，因此后續(xù)實驗選用Waters Acquity UPLC BEH Shield RP18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）。

2.2.2 流動相選擇

不同流動相實驗結果發(fā)現：當水相為體積分數0.1%甲酸溶液時，檸檬黃、胭脂紅及亮藍不出峰，其他峰的峰形不對稱且響應低；水相為超純水時，整體響應較低，檸檬黃和亮藍峰形較為理想，酸性紅峰不對稱，胭脂紅不出峰；水相為5 mmol/L乙酸銨溶液，除檸檬黃外其他目標化合物在有機相為甲醇和乙腈的流動相中分離度及峰形、響應相近，檸檬黃在以乙腈-乙酸銨（5 mmol/L）溶液為流動相時，峰形尖銳且不拖尾，以甲醇-乙酸銨（5 mmol/L）溶液為流動相時，峰出現明顯拖尾現象。向陰性樣品納豆提取物中添加50 μg/mL混合標準物質作為基質標準，分別以乙腈-0.1%甲酸溶液和乙腈-5 mmol/L乙酸銨溶液作流動相，結果發(fā)現，以甲醇作為有機相噪音較乙腈要高，且以乙腈作為有機相能夠明顯降低基線漂移。因此本實驗最終選擇乙腈-5 mmol/L乙酸銨水溶液作為流動相。

2.2.3 提取溶劑的選擇

不同提取溶劑實驗結果表明：采用體積分數20%氨水和無水乙醇-氨水-水（7∶2∶1，V/V）作為提取劑時，回收率整體偏低，其中檸檬黃回收率低于20%，原因可能是檸檬黃適合用偏酸性溶劑提取；采用水作為提取溶劑，7 種水溶性合成色素回收率均比較理想，分別達到：胭脂紅63%，莧菜紅65.3%，日落黃83.8%，亮藍70.0%，紅色2G 70.2%，檸檬黃62.7%，誘惑紅66.5%。故本實驗選取超純水作為樣品提取溶劑。

2.3 固相萃取方法優(yōu)化

2.3.1 固相萃取柱的選擇

由于固相萃取技術具有操作簡便、溶劑消耗低、樣品用量少、回收率高的優(yōu)點，被廣泛應用于食品色素檢測的凈化方法[28-29]。結果發(fā)現，檸檬黃、胭脂紅、莧菜紅在HLB固相萃取小柱上回收率均低于10%；C18固相萃取小柱只對亮藍的回收率較為理想（65.0%），其他6 種色素回收率均低于15%。選擇聚酰胺固相萃取小柱作凈化柱，除干擾效果好，樣品回收率均高于85%，因此選擇其作為凈化柱。

2.3.2 淋洗液及洗脫液的選擇

結果表明，當淋洗液為酸化水溶液時，能避免檸檬黃和亮藍的流失，在酸化水溶液中加一定比例的有機溶液甲醇可使得雜質去除更為干凈，且不影響各目標化合物在聚酰胺小柱上的保留，因此實驗選擇3 mL甲醇-甲酸-水（1∶2∶5，V/V）和3 mL水為淋洗溶液。

采用甲醇、體積分數10%甲酸-甲醇溶液、體積分數10%氨水-甲醇溶液作為洗脫溶液進行洗脫實驗，結果發(fā)現，甲醇不能將目標化合物全部洗脫下來，體積分數10%甲酸-甲醇溶液不具有洗脫能力，當甲醇和體積分數10%氨水-甲醇溶液結合使用，能將7 種水溶性合成色素都洗脫下來。因此本實驗選擇甲醇和體積分數10%氨水-甲醇溶液作為洗脫溶劑，進一步對洗脫溶劑的體積進行優(yōu)化，最終確定體積分數甲醇和10%氨水-甲醇溶液的優(yōu)化體積分別為6 mL。

2.3.3 基質效應的考察結果

由于植物提取物基質復雜[30]，選擇響應值法進行基質效應的考察。結果發(fā)現，檸檬黃（肉桂提取物中基質效應50%、黑加侖提取物50%）、亮藍（納豆提取物中基質效應70%、黑加侖提取物60%）和紅色2G（肉桂提取物中基質效應115%、甜菜根70%）中基質效應比較大，其他水溶性合成色素的基質效應均較小。因此本實驗中采用基質匹配標準溶液作為標準，進行外標法定量。

2.4 方法學驗證結果

2.4.1 線性范圍和檢出限

選取不同基質的空白樣品，按上述方法進行樣品前處理，提取空白基質液分別配制10、20、50、100、200、500 μg/mL不同質量濃度的混合標準溶液，進樣檢測，繪制基質標準曲線。從表2可看出，在10～500 μg/mL的線性范圍內7 種水溶性合成色素的相關系數（r2）大于0.99；方法的檢出限（RSN≥3）為0.001 2～0.052 mg/kg。

表2 7 種合成色素線性回歸方程、相關系數、檢出限及納豆提取物中的回收率和RSD結果（n= 6）Table 2 Linearity regression equations, correlation coefficient, LODs,recoveries and precision (RSD) of the 7 artificial dyes at three spiked levels from natto extract (n= 6)

2.4.2 回收率與精密度

將7種混合標準物質添加到陰性納豆提取物的樣品液中，添加水平為0.05、0.1、0.5 mg/kg的溶液，平行實驗6 次，加樣回收率及RSD結果見表2。從表2可看出，7種水溶性合成色素的回收率均在60.8%～91.8%范圍內，RSD為2.1%～6.5%。

2.5 方法適用性及實際樣品檢測結果

選取納豆、櫻桃、甜菜、萬壽菊、黑加侖、大豆、肉桂、芒果等植物提取物對構建的檢測方法進行驗證。按相同方法處理樣品，添加水平為0.1 mg/kg，回收率均在63.4%～139.0%范圍內，RSD為2.5%～16.7%。

應用所建立的方法分別對市場采購的10 批次植物提取物進行檢測，對隨機抽取的10 種植物提取物按本方法進行快速篩查，除萬壽菊、黑加侖、蔓越橘提取物外，其他植物提取物均檢出含有禁用及限用合成色素。

3 結 論

本實驗基于UPLC-Q-Orbitrap建立了植物提取物中7 種水溶性合成色素的快速篩查和定量分析方法。由于目前缺乏植物提取物中限用及禁用合成色素的國家檢測標準，通過高選擇性的四極桿與軌道離子阱高分辨準確質量數測量技術有機結合，能夠降低基質干擾，具有較高的定性定量能力，通過加標驗證，在0.05、0.1、0.5 mg/kg 3 個加標水平下，樣品中7 種限用及禁用合成色素加樣回收率在60.8%～91.8%范圍內，RSD為2.1%～6.5%。本方法應用于10 批次樣品的測定具有良好的重現性，能夠滿足植物提取物中限用及禁用合成色素的快速篩查與定量分析，可以為生產和監(jiān)管部門提供方法參考。

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Determination of 7 Artificial Dyes in Plant Extracts by Ultra-Performance Liquid Chromatography-Quadrupole/Electrostatic Field Orbit Trap High-Resolution Mass Spectrometry

ZHU Zhenbao1, ZHANG Yali2, JIA Wei1, KONG Xianghong2, HE Qiang2
(1. School of Food Science and Bioengineering, Shaanxi University of Science and Technology, Xi’an 710021, China;2. Food Inspection Center of Shaanxi Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Xi’an 710068, China)

A rapid method was presented for the determination of 7 artificial dyes in plant extracts by ultra-performance liquid chromatography-electrospray ionization quadrupole orbitrap high-resolution mass spectrometry (UPLC-Q-Orbitrap-MS). Samples were extracted with water, and the extract was cleaned up on a polyamide solid phase extraction (SPE) column and separated by UPLC on a C18column using a mobile phase consisting of 5 mmol/L ammonium acetate-acetonitrile with gradient elution. Data were collected by ESI Q-Orbitrap MS. The results showed that good linearity was observed in the concentration range from 10 to 500 μg/mL for all 7 artificial dyes, with correlation coefficients (r2) greater than 0.99. The limits of detection (LODs) ranged from 0.001 2 to 0.052 mg/kg. The average recoveries were in the range from 60.8% to 91.8% at 3 spiked levels with relative standards deviation (RSDs) between 2.1% and 6.5%. This method proved to be simple,time saving, accurate, reliable and sensitive and thus can be used for the fast screening and confirmation of artificial dyes in plant extracts.

plant extracts; artificial dyes; ultra-performance liquid chromatography-quadrupole/electrostatic field orbit trap mass spectrometry; high-resolution mass spectrometry

10.7506/spkx1002-6630-201724031

TS255.4

A

1002-6630（2017）24-0196-06

朱振寶, 張亞莉, 賈瑋, 等. 超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道離子阱質譜測定植物提取物中的7 種合成色素[J]. 食品科學, 2017, 38(24)∶ 196-201. DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724031. http∶//www.spkx.net.cn

ZHU Zhenbao, ZHANG Yali, JIA Wei, et al. Determination of 7 artificial dyes in plant extracts by ultra-performance liquid chromatography-quadrupole/electrostatic field orbit trap high-resolution mass spectrometry[J]. Food Science, 2017, 38(24)∶196-201. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724031. http∶//www.spkx.net.cn

2017-02-24

國家自然科學基金面上項目（31671888）；陜西省自然科學基金面上項目（2015JM3085）

朱振寶（1971—），男，副教授，博士，主要從事食品功能因子研究。E-mail：zhuzhenbao@sust.edu.cn