上轉換熒光猝滅試紙條檢測牛奶中磺胺喹惡啉

胡高爽，張 燕，生 威，李 志，王俊平，王 碩*

上轉換熒光猝滅試紙條檢測牛奶中磺胺喹惡啉

胡高爽，張 燕，生 威，李 志，王俊平，王 碩*

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，教育部食品營養與安全重點實驗室，天津 300457）

目的：根據熒光共振能量轉移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）的原理，構建一種基于上轉換熒光納米材料的新型免疫標記熒光猝滅試紙條檢測牛奶中的獸藥磺胺喹惡啉（sulfaquinoxaline，SQX）殘留。方法：通過熱分解方法合成上轉換納米熒光材料，通過檸檬酸三鈉還原法制備膠體金納米顆粒。將合成的上轉換熒光顆粒固定在試紙條C線上，并將上轉換熒光顆粒與SQX包被抗原的混合物固定在T線上，將膠體金標記的SQX單克隆抗體噴涂在金標墊上。滴加樣品后，隨著樣品液的流動，金標抗體會移動到T線處并與SQX包被抗原結合，這種結合會導致抗體上的納米金顆粒（受體）與T線上的上轉換顆粒靠近（供體），從而發生FRET，產生熒光猝滅。在980 nm激發器激發波長下通過目測檢測熒光強弱變化，從而實現對SQX的檢測。結果：該免疫熒光猝滅試紙條檢測SQX的方法檢測限為1 μg/L，牛奶樣品的檢測限為8 μg/L。整個檢測過程不超過15 min。結論：該方法操作簡便、靈敏度高、檢測時間短、結果易于判斷，可以滿足牛奶中SQX殘留的現場快速檢測的要求。

磺胺喹惡啉；上轉換材料；免疫熒光猝滅試紙條；牛奶

磺胺類藥物具有廣譜抗革蘭氏陰性菌和陽性菌的活性、價格便宜、使用方便等特點，廣泛應用在獸醫臨床及動物飼料添加劑等研究領域中[1-2]。由于其在獸醫臨床應用時可能產生耐藥性，而且會造成動物源性食品中出現獸藥殘留，進而對人體產生慢性的毒副作用，引起各種器官的病變，因此我國對肉類以及動物其他可食部分中磺胺類藥物殘留制定了最高限量[3-4]。目前用于檢測磺胺喹惡啉（sulfaquinoxaline，SQX）的方法主要包括毛細管電泳法[5-6]、氣相色譜-串聯質譜法[7-8]、高效液相色譜法[9-10]、液相色譜-串聯質譜法[11-13]等。上述方法雖靈敏度高，但因儀器昂貴，前處理步驟繁瑣，耗費時間長等問題，并不適合進行大量樣品篩查以及現場快速檢測。基于抗原抗體特異性反應的免疫分析檢測技術因其具有靈敏、精確、快速、成本低廉等特點，在獸藥殘留的快速檢測中得到了廣泛的應用[14-17]。

熒光納米材料是一種新型材料，近年來得到了國內外科研人員的廣泛關注，并作為一種免疫標記材料在免疫檢測中得以應用[18-19]。熒光共振能量轉移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）是一種對于相互靠近的供體與受體通過偶極子-偶極子相互作用而產生的非輻射性的過程，熒光猝滅是熒光能量共振轉移的現象之一[20-22]。本實驗根據熒光共振能量轉移的原理，構建了一種新型的基于上轉換納米材料（upconversion nanoparticles，UCNPs）和膠體金的免疫熒光猝滅試紙條檢測牛奶中SQX。UCNPs固定在試紙條C線上。同時，上轉換顆粒與SQX包被抗原（SQX半抗原與卵白蛋白（ovalbumin，OVA）復合物，SQX-OVA）固定在試紙條T線上，膠體金標記的SQX抗體噴涂在金標結合墊上。當滴加陰性樣品后，樣品液帶動金標抗體到T線處與SQX-OVA結合，這種結合導致抗體上的金顆粒（受體）與T線上的上轉換熒光顆粒靠近（供體），從而發生FRET，產生熒光猝滅，實驗原理如圖1所示。當滴加陽性樣品后，游離SQX與金標抗體結合，從而使得T線處的金標抗體與SQX-OVA的結合量減少，從而導致T線上的熒光猝滅現象減少，會部分熒光保持，加入足量的陽性樣品后，T線完全不產生熒光猝滅，會全部熒光保持。這樣目標物SQX與T線的熒光強度會產生一個正比的關系。

圖1 免疫熒光猝滅試紙條檢測SQX的原理Fig. 1 Schematic principle of FQICS based on fluorescence quenching for the detection of SQX

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玻璃纖維、聚酯纖維 上海金標公司；硝酸纖維素膜 美國Millipore公司；SQX標準品 中國獸醫藥品檢查所；SQX單克隆抗體和SQX半抗原H3由實驗室自制；檸檬酸三鈉、氯金酸、醋酸鐿、醋酸鉺、聚丙烯酸（poly(acrylic acid)，PAA）、羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）、碳化二亞胺（1-ethyl-3-[3-(dimethylamino) propyl] carbodiimide，EDC）、OVA 美國Sigma公司；醋酸釔 美國Aladdin公司；二甘醇（diethylene glycol，DEG）、氫氧化鈉（均為分析純） 天津市化學試劑一廠；乙腈（分析純） 德國Merck公司；油酸（oleic acid，OA）（分析純） 美國Alfa公司。

1.2 儀器與設備

JEM-2010 FEF透射電鏡 日本JEOL公司；UV-2300紫外分光光度計 日本Shimadzu公司；F-4500熒光光譜儀 日本Hitachi公司；可連續調節波長980nm激發器中國北京海特光電公司。

1.3 方法

1.3.1 SQX單克隆抗體及包被抗原的制備

SQX包被原（SQX-OVA）的制備采用活化酯的方法[23]。0.025 mmol的半抗原H3加入到無水N,N-二甲基甲酰胺中，充分攪拌使其全部溶解。向上述溶液中加入9.3 mg的EDC，充分混合。將此混合溶液緩慢滴加到含有10 mg載體蛋白OVA的碳酸氫鈉溶液（130 mmol/L，pH 8.1）中，室溫下攪拌反應4～6 h。最后再加入4.7 mg EDC到混合液中，4 ℃攪拌過夜。第2天取出，室溫下放置2～3 h。在4 ℃條件下，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）（10 mmol/L，pH 7.4）中透析3 d后，分裝，-20 ℃保存。

SQX單克隆抗體由本實驗室制備并采用辛酸-硫酸銨法[24]純化得到。

1.3.2 上轉換納米材料的制備

采用熱分解方法制備油溶性上轉換納米材料[25-26]。醋酸釔、醋酸鐿、醋酸鉺按照78∶20∶2的物質的量比例，與6 mL油酸和17 mL十八烯混合，攪拌均勻后，先將混合液加熱至100 ℃，抽真空反應10 min，之后將反應體系加熱至160 ℃。隨后，將體系自然冷卻至室溫。向反應體系中加入含有氫氧化鈉（2.5 mmol）與氟化銨（4 mmol）的10 mL甲醇溶液，在室溫下充分攪拌30 min。再將混合液在惰性氣體保護下加熱到300 ℃，反應1 h，冷卻至室溫。最后用乙醇清洗3 次，即可得到綠色發光油溶性上轉換納米材料（OA-UCNPs）。

采用配體交換方法是制備水分散性上轉換納米材料。準確稱取0.5 g PAA溶解在DEG中，在氬氣保護下加熱至110 ℃，保持反應1 h。之后注入含有30 mg油溶性上轉換納米材料的甲苯溶液，繼續保持反應1 h。將體系溫度升高至240 ℃，反應1 h。反應結束后加入過量的pH 4～5稀鹽酸，再用超純水清洗，即可獲得水分散性的上轉換納米材料PAA-UCNPs。

1.3.3 UCNPs-OVA復合物的制備

稱取5 mg上述制備的PAA-UCNPs，超聲處理使其均勻分散在2-N-嗎啡代烷磺酸緩沖液（pH 5.5）中，加入1.5 mg EDC和2.4 mg NHS，在室溫條件下振蕩孵育4 h。用2-[4-（2-羥乙基）-1-哌嗪基]乙磺酸緩沖溶液（pH 7.2）洗滌3 次，向離心沉淀物中加入OVA蛋白，4 ℃條件下，攪拌反應過夜。離心洗滌3 次，即得到UCNPs-OVA熒光復合物。

1.3.4 膠體金納米顆粒的制備

膠體金溶液采用檸檬酸三鈉還原法制備[27-28]。步驟如下：加入足量的雙蒸水到制備膠體金的三角瓶中，于恒溫加熱磁力攪拌器上加熱至沸騰，約2 min后，倒掉沸水。量取99 mL雙蒸水加入1 mL 1 g/100 mL氯金酸溶液，混合均勻后加熱至沸騰。向溶液中迅速加入2.25 mL 1 g/100 mL檸檬酸三鈉溶液。約2 min后，溶液顏色發生變化，最終呈現穩定的酒紅色。繼續煮沸攪拌溶液15 min，冷卻至室溫，使用去離子水定容至100 mL，4 ℃避光保存。

1.3.5 金標抗體的制備

取1 mL膠體金，用0.2 mol/L的K2CO3將膠體金溶液調至最佳pH值，加入18 μL的SQX單克隆抗體，充分混勻，室溫靜置1 h。加入20 μL 20 g/100 mL BSA溶液和10 μL 20% PEG-20000溶液，室溫靜置20 min，以穩定膠體金與抗體的結合物。之后將溶液于4 ℃、2 000 r/min離心15 min，保留上清液，除去標記過程中的各種聚合物。接下來再將上清液于4 ℃、10 000 r/min離心30 min，棄去950 μL上清液，將沉淀用金標工作液稀釋8 倍，4 ℃保存備用。

1.3.6 熒光猝滅試紙條的組裝

UCNPs-OVA熒光復合物與SQX包被抗原混合后固定于硝酸纖維素膜的T線區域0.8 μL/cm。并將UCNPs-OVA熒光復合物直接固定于硝酸纖維素膜的C線區域0.8 μL/cm。固定后的硝酸纖維素膜置于37 ℃烘箱過夜干燥，金標抗體按30 μL/cm劑量噴在金標墊上，37 ℃真空干燥過夜。將NC膜、金標墊、樣品墊、吸水紙以及 PVC背板按一定順序組裝好后，使用全自動斬切機將其切成3.7 mm寬條裝在聚氯乙烯卡殼中，置于室溫干燥環境下保存備用。

1.3.7 實際樣品檢測

稱取1 g牛奶樣品用PBS溶液加Tween-20（PBST）稀釋8 倍，直接用免疫熒光猝滅試紙條檢測。

2 結果與分析

2.1 膠體金納米材料表征

圖2 上轉換材料熒光光譜圖和膠體金紫外圖譜Fig. 2 Fluorescence spectra of UCNPs and UV-vis absorption spectra of colloidal gold

實驗制備出的膠體金溶液用肉眼觀察為酒紅色，澄清透明，狀態穩定，表面無懸浮雜質，溶液底部無聚沉顆粒，初步說明制備的膠體金質量較好。用紫外-可見分光光度計對其在200～800 nm波長下進行全波長掃描，得到的膠體金紫外-可見吸收光譜圖如圖2所示。所制備的膠體金溶液最大吸收峰波長為520 nm，峰形流暢。同時本實驗利用透射電子顯微鏡對膠體金顆粒的超微結構進行掃描，得到透射電鏡圖如圖3所示，膠體金粒徑平均粒徑在18 nm左右，形狀為規則的圓形，大小基本相同。

圖3 膠體金透射電鏡圖Fig. 3 Transmission electron microscopic image of colloidal gold particles

2.2 上轉換熒光納米材料表征

以稀土元素Er作為激活劑合成的上轉換材料會在激發波長為980 nm的照射下，發射出綠色可見光，這源自于稀土元素Er能級的2H11/2，4S3/2→4I15/2轉移[29]。如圖2所示，合成的上轉換材料的熒光光譜表明其發射波長為542 nm。從圖2可以看出，膠體金的吸收波長為520 nm，與上轉換的發射波長542 nm能夠很好重合，從而為上轉換與膠體金發生能量共振轉移提供必要條件。圖4表明，合成的油溶性上轉換（OA-UCNPs）材料直徑約30 nm，PAA修飾后上轉換材料（PAA-UCNPs）的直徑有所增加，這是因為通過配體交換，OA-UCNPs的表面修飾上一層薄薄的PAA層。

圖4 材料的表征Fig. 4 Characterization of the materials

2.3 工作條件的確定

表1 最佳抗原包被量和熒光復合物用量的優化Table 1 Optimized amount of coating antigen and UCNPs-OVA complex

分別對固定于硝酸纖維素膜UCNPs-OVA熒光復合物與SQX包被抗原進行優化，結果見表1。當UCNPs-OVA熒光復合物稀釋倍數為1∶1 000，包被抗原稀釋倍數為1∶8時，質控線熒光強度清晰適中，檢測線熒光能夠被完全猝滅且添加待測物后梯度較好。

2.4 熒光猝滅免疫層析試紙條靈敏度的確定

按照上述優化好的條件制備試紙條，用PBST釋SQX至質量濃度梯度為0、0.5、1、5、15、20 μg/L。滴加SQX質量濃度梯度樣品后，在激發波長為980 nm的激發器照射下觀測結果。定義該建立的熒光猝滅免疫層析試紙條的檢測限為：使T線上的熒光猝滅現象減少，即出現熒光條帶，所使用的SQX的最低質量濃度。如圖5所示，當加入的SQX樣品為0.5 μg/L時，T線沒有出現熒光條帶，但當加入的SQX樣品為1 μg/L時，T線出現熒光條帶。因此，得到的結果顯示該試紙條對溶于PBST中的SQX的檢測限為1 μg/L。

圖5 上轉換熒光猝滅試紙條檢測PBST溶液中的SQXFig. 5 The detection limit of SQX in PBST solution using upconversion nanoparticle-based FQICS

2.5 特異性分析

圖6 上轉換熒光猝滅試紙條特異性分析Fig. 6 Specificity analysis of upconversion nanoparticle-based FQICS

本實驗測定12 種SQX的結構類似物來研究改建立方法的特異性，測定質量濃度分別為5、20、1 000 μg/L。如圖6所示，當磺胺氯噠嗪、磺胺甲氧嗪、磺胺甲惡唑的質量濃度為5 μg/L，T線出現明亮的條帶，熒光猝滅現象減少。對于磺胺甲氧嘧啶、磺胺地索辛，當其質量濃度達到20 μg/L，熒光猝滅現象降低，T線出現明亮的條帶。然而對于其他的7 種類似物，如磺胺塞唑、磺胺吡啶、磺胺二甲唑、磺胺嘧啶、磺胺異惡唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺多辛，即使質量濃度達到1 000 μg/L時，T線也沒有出現明亮的條帶，熒光猝滅現象沒有完全消除。結果表明，所建立的試紙條法不僅能夠被應用于檢測SQX，還可以用于檢測磺胺氯噠嗪、磺胺甲氧嗪、磺胺甲惡唑、磺胺甲氧嘧啶、磺胺地索辛等。

2.6 牛奶中SQX的檢測結果

牛奶樣品（經驗證不含有SQX）分別添加一系列質量濃度的SQX（0、8、40、120、160 μg/L），PBST最低稀釋8 倍后，能夠消除機制的干擾，并用免疫熒光猝滅試紙條進行檢測。得到在980 nm熒光激發波長下用肉眼看到的結果，如圖7所示，該熒光猝滅試紙條對牛奶樣品的檢測限為8 μg/L。

圖7 上轉換熒光猝滅試紙條檢測牛奶樣品中的SQXFig. 7 The detection limit of SQX in milk samples using upconversion nanoparticle-based FQICS

3 結 論

本實驗利用FRET原理在免疫層析試紙條平臺上建立了新型熒光免疫猝滅試紙條。檢測結果可以通過目測試紙條的熒光強弱定性半定量檢測SQX的含量。整個檢測過程不超過15 min。與何方洋[30]和李海龍[31]等的研究使用膠體金免疫層析試紙條檢測SQX（標準溶液中SQX檢測限為10 μg/L，牛奶樣品檢測限為80 μg/L）相比，該新型熒光猝滅試紙條具有低的檢測限（標準溶液中SQX的檢測限為1 μg/L，牛奶樣品檢測限為8 μg/L）。相對于儀器分析方法，該方法操作簡便，檢測時間短，結果易于判斷，不需要大型儀器設備。因此，建立的該方法可以作為牛奶樣品中SQX殘留的現場快速檢測的有用工具。

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Upconversion Nanoparticles (UCNPs)-Based Fluorescence Quenching Immunochromatographic Strips for Rapid Detection of Sulfaquinoxaline in Milk

HU Gaoshuang, ZHANG Yan, SHENG Wei, LI Zhi, WANG Junping, WANG Shuo*
(Key Laboratory of Food Nutrition and Safety, Ministry of Education, College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

Purpose∶ A novel fluorescent quenching immune chromatographic strip (FQICS) using upconversion nanoparticles(UCNPs) was developed to detect sulfaquinoxaline (SQX) in milk samples based on the principle of fluorescence resonance energy transfer (FRET). Methods∶ UCNPs was prepared using a pyrolytic process, and colloidal gold was prepared using sodium citrate reduction method. Then OVA-UCNPs were distributed to the upper side to form C line. OVA-UCNPs and SQX-OVA coating antigen were added to the lower side of the NC membrane to form the T line. When a negative sample was added to the sample pad, the liquid sample containing colloidal gold-labeled antibody migrated via capillary action toward the end of the strip. When the mixture reached the T line, which was coated with SQX-OVA coating antigen and OVA-UCNPs, the gold-labeled antibody bound to SQX-OVA coating antigen. Since the UCNPs were simultaneously coated at the same location as the SQX-OVA coating antigen, the binding of gold-labeled antibody to SQX-OVA coating antigen could provide a suitable distance between the UCNPs and colloidal gold to cause FRET. Using a 980 nm laser, the test results could be evaluated visually according to fluorescence intensity. Results∶ The limit of detection (LOD) of this assay for SQX in PBS buffer was 1 μg/L, and the LOD for SQX in milk samples was 8 μg/L. The whole detection process could be completed within 15 min. Conclusion∶ The FQICS based on UCNPs allowed for simple, sensitive, time-saving, and rapid onsite detection of SQX residues in milk.

sulfaquinoxaline; upconversion nanoparticles; fluorescence quenching immune chromatographic strips; milk

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724035

TS201.2

A

1002-6630（2017）24-0218-06

胡高爽, 張燕, 生威, 等. 上轉換熒光猝滅試紙條檢測牛奶中磺胺喹惡啉[J]. 食品科學, 2017, 38(24): 218-223.

10.7506/spkx1002-6630-201724035. http://www.spkx.net.cn

2016-12-22

國家國際科技合作專項（2014DFR30350）；天津市科技計劃項目（14ZCDGNC00098）

胡高爽（1989—），女，博士研究生，研究方向為食品安全。E-mail：hugaoshuang1989@163.com

*通信作者：王碩（1969—），男，教授，博士，研究方向為食品安全。E-mail：s.wang@tust.edu.cn

HU Gaoshuang, ZHANG Yan, SHENG Wei, et al. Upconversion nanoparticles (UCNPs)-based fluorescence quenching immunochromatographic strips for rapid detection of sulfaquinoxaline in milk[J]. Food Science, 2017, 38(24)∶ 218-223. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724035. http∶//www.spkx.net.cn