基于通過型固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜法同時測定水產品中的氯霉素和紅霉素

柯慶青，李詩言，周 凡，鄭重鶯，貝亦江，王鼎南，王 揚*

基于通過型固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜法同時測定水產品中的氯霉素和紅霉素

柯慶青，李詩言，周 凡，鄭重鶯，貝亦江，王鼎南，王 揚*

（浙江省水產質量檢測中心，浙江 杭州 310023）

建立通過型固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜同時快速測定水產品中氯霉素和紅霉素的分析方法。樣品通過乙腈提取，Oasis PRiME HLB小柱一步法凈化，采用高效液相色譜-串聯質譜儀多反應監測掃描模式檢測和同位素內標定量。檢測水產品中的氯霉素和紅霉素定量限分別為0.1 μg/kg和0.5 μg/kg。不同水產品（魚、蝦和蟹）在3 個添加水平的平均回收率在86.7%～102.6%之間，相對標準偏差小于5%（n=6）。本方法簡單易行、靈敏度較高，在日常檢測方面存在一定優勢。

固相萃??；高效液相色譜-串聯質譜；水產品；氯霉素；紅霉素

水產品種類繁多，營養豐富，廣受消費者喜愛。近些年來，隨著養殖規模的不斷擴大，水產養殖病害日益嚴重。盲目用藥、使用人藥、過量用藥等濫用藥物現象比較普遍，這易造成養殖環境的惡化污染，也可能引起藥物在水產品體內的殘留，進而影響到食用者的身體健康。氯霉素是一種廣譜抑菌抗生素，曾長期在國內外廣泛應用于水產養殖業的細菌性疾病治療。氯霉素對人體的造血功能有一定的毒副作用，可以引發再生障礙性貧血，血小板減少等[1]。紅霉素是一種大環內酯類抗生素，對支原體、葡萄球菌、鏈球菌和各種革蘭氏陽性菌均有較強的抑制作用，因而被廣泛用于畜牧業中疾病的防治[2]。食用水產品中的氯霉素和紅霉素可以通過食物鏈在人體內累積，從而威脅人類健康[3-4]。歐盟等許多國家和地區已經禁止氯霉素的使用并規定了紅霉素在可食性動物組織中的最大殘留量。我國NY 5070—2002《無公害食品 水產品中漁藥殘留限量》中規定水產品中不得檢出氯霉素；農業部235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》規定動物性食品中不得檢出氯霉素，紅霉素最高殘留限量為200 μg/kg。因此建立一種靈敏、高效、選擇性好的分析方法用于檢測水產品中氯霉素和紅霉素具有重要的現實意義。

目前氯霉素殘留常見的檢測方法有液相色譜法[5-6]、液相色譜-串聯質譜法[7-14]、氣相色譜法[15-17]、氣相色譜-串聯質譜法[18]、酶聯免疫法[19-20]；紅霉素的檢測方法有分子印跡液相色譜法[2]、液相色譜熒光法[21]、高效液相色譜-串聯質譜法[22-24]。其中，氣相色譜法和氣相色譜-串聯質譜法需要衍生化，前處理復雜；酶聯免疫法結果易出現假陽性，因此只能作為篩選方法；液相色譜法由于只靠保留時間定性，抗干擾能力較弱，易出現假陽性。液相色譜-串聯質譜法具有定性能力強、選擇性好、靈敏度高等優點。目前水產品中紅霉素和氯霉素的測定主要采用的國家標準方法就是基于固相萃取法凈化的液相色譜-質譜聯用法，其中氯霉素的測定方法為農業部781號公告—2—2006《動物源食品中氯霉素殘留量的測定 高效液相色譜-串聯質譜法》[25]，紅霉素的測定方法為GB 29684—2013《水產品中紅霉素殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》[26]。近年來，高效液相色譜-串聯質譜法在獸藥殘留分析中得到了廣泛應用，但同時測定水產品中氯霉素和紅霉素殘留量少見報道。在我國水產品質量安全檢測項目中，常常會同時對氯霉素和紅霉素的藥物殘留進行監測，因此，使用一種方法快速、簡易地測定水產品中氯霉素和紅霉素殘留量就顯得十分重要。

已有的氯霉素和紅霉素的凈化手段有正己烷脫脂法[24]以及固相萃取法[1,23,25-27]等。正己烷脫脂法雖然方法簡單但基質效應較大；國標方法和很多檢測方法采用的傳統的固相萃取法則需要有機試劑提取，溶劑轉化后才能上樣還需活化，淋洗、洗脫等，步驟較為繁瑣，同時吸附再脫附的步驟可能會致使回收率降低。本研究前處理采用Oasis PRiME HLB小柱一步法凈化，前處理簡單，并且基質效應較小、靈敏度較高，能得到較為滿意的效果。Oasis PRiME HLB是在Oasis HLB技術基礎上開發出的新一代反相固相萃取吸附劑，可以有效地吸附樣品中的脂肪和磷脂，較以往固相萃取劑具有更簡單、更快速、更潔凈的優勢[28-29]。本實驗樣品可以在用有機相提取后，無需溶劑轉換，一步法直接通過Oasis PRiME HLB柱收集，無需淋洗、洗脫，用同一種前處理方法可以同時檢測氯霉素和紅霉素，縮短了檢測的時間、節約了成本。將本方法與現有國標方法比較，本方法具有前處理簡單、快速、使用試劑耗材少、回收率高等優點，同時靈敏度也能滿足日常檢測需求，適合于實驗室大批量檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

所有鯽魚、對蝦、梭子蟹樣品均來自2015年浙江省水產質量檢測中心監督抽查任務，所有樣品均取肌肉部分，絞碎均質后，-20 ℃冷凍保存，待檢測。

氯霉素標準品（純度98.5%）、紅霉素標準品（純度97.0%）、氘代氯霉素標準品、紅霉素-13C標準品（純度91.5%） 德國Dr. Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇、乙酸乙酯和正己烷（均為色譜純） 美國Tedia公司；乙酸（色譜純） 美國ROE Scientific Inc公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

API4000型四極桿串聯質譜儀 美國AB公司；高效液相色譜儀 美國Agilent公司；2202S型電子天平 德國賽多利斯有限公司；Centrifuge 5427R高速冷凍離心機德國Eppendorf公司；RE-2000B型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；N-EVAP112水浴式氮吹濃縮儀 美國Oranomation Aassociates Inc公司；Oasis PRiME HLB固相萃取小柱（6 mL/200 mg） 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品提取

準確稱取均質后的樣品2.50 g于15 mL帶蓋聚乙烯離心管中，加入400 ng/mL氯霉素內標和200 ng/mL紅霉素內標50 μL，加入8 mL乙腈，旋渦均勻1 min后，振蕩10 min，5 000 r/min離心5 min后取上清液于另一干凈10 mL帶蓋離心管中，向提取液中加入2 mL超純水混合均勻。

1.3.2 樣品凈化

向Oasis PRiME HLB固相萃取小柱中加入提取液，保持每秒1 滴的流速，收集所有的流出液在40 ℃條件下氮氣吹干，用流動相乙腈-水（45∶55，V/V）定容至1 mL，旋渦充分溶解后加入1 mL正己烷，快速旋渦1 min后，4 ℃、14 000 r/min離心10 min，棄去正己烷層后過0.22 μm微孔濾膜，上機測試。

1.3.3 樣品測試

將內標和不同體積的混合標準工作液混勻，吹干后用流動相定容至1 mL，配制成一系列質量濃度的標準曲線和樣品在同一條件下進行測定，記錄保留時間和峰面積，內標法定量，用Mass Hunter工作站對數據進行分析處理。

1.3.4 儀器分析條件

1.3.4.1 高效液相色譜條件

Waters Eclipse plus C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流動相：乙腈-0.02%乙酸溶液（45∶55，V/V）；流速：250 μL/min；進樣量：20 μL。

1.3.4.2 質譜條件

電噴霧離子源，多反應監測。

紅霉素：正離子掃描，電噴霧電壓：5 000 V；氣簾氣壓力：10 psi；霧化器壓力：40 psi；輔助氣壓力：45 psi；去簇電壓：60 V；碰撞入口電壓：10 V；碰撞室出口電壓：13 V；離子源汽化溫度：500 ℃。紅霉素及紅霉素內標物的母離子、子離子及其碰撞能量見表1。

氯霉素：負離子掃描，電噴霧電壓：-4 500 V；氣簾氣壓力：20 psi；霧化器壓力：50 psi；輔助氣壓力：35 psi；去簇電壓：-50 V；碰撞入口電壓：-10 V；碰撞室出口電壓：-10 V；離子源汽化溫度：500 ℃。氯霉素及氯霉素內標物的母離子、子離子及其碰撞能量見表1。

表1 氯霉素和紅霉素及相應內標物質譜參數Table 1 Mass spectral parameters for the analysis of chloramphenicol,erythromycin and their corresponding internal standards

2 結果與分析

2.1 質譜參數與色譜條件優化

2.1.1 質譜參數的優化

在電噴霧離子源下，分別對質量濃度為1 μg/mL的氯霉素和紅霉素標準溶液做負離子和正離子進行一級質譜掃描得到響應最佳準分子離子峰，再對準分子離子峰進行二級質譜分析，得到子離子的質量數，采用多反應監測優化碰撞能等參數使得子離子響應最佳。根據歐盟2002/657/EC決議中有關質譜分析方法必須不少于4 個識別點的規定[30]，為氯霉素和紅霉素分別選取質譜響應最佳的兩對多反應監測離子對及相應的參數作為最終的質譜采集參數。

2.1.2 色譜流動相的選擇

本實驗采用同一色譜條件對紅霉素和氯霉素進行檢測，這樣可以在不用換流動相和色譜柱的情況下，同時提交兩種質譜方法實現紅霉素和氯霉素的同時檢測。紅霉素用正源檢測，一定酸度的流動相可以提高紅霉素峰的響應和改善峰形，但紅霉素在酸性條件下不穩定、易分解；氯霉素用負源檢測，用酸性流動相則會影響峰的強度和峰形。因此需要選擇合適酸度的流動相同時滿足紅霉素和氯霉素的檢測。分別選用乙腈和不同體積分數的乙酸溶液（0%、0.01%、0.02%、0.05%、0.1%）作為流動相對氯霉素和紅霉素進行分析。結果表明，純水時紅霉素峰形較差且響應較低，隨著乙酸體積分數的增加，紅霉素的響應逐漸增強，峰形變好；氯霉素則隨著酸度的增加，峰形和響應逐漸變差，0.05%乙酸溶液作為流動相時則氯霉素在低體積分數時峰較差，用0.1%乙酸溶液作流動相時氯霉素則響應不穩定且出現峰拖尾的現象，綜合以上情況考慮使用0.02%的乙酸溶液作為流動相進行上機檢測，能夠同時保證氯霉素和紅霉素具有較好的峰形和響應。乙腈和0.02%的乙酸溶液作為流動相時氯霉素和紅霉素的標準品色譜圖、空白魚肉樣品色譜圖和魚肉樣品加標色譜圖見圖1。

圖1 樣品多反應監測色譜圖Fig. 1 MRM chromatograms of samples

2.2 預處理方法優化

2.2.1 提取試劑的選擇

本實驗首先考察乙腈、乙酸乙酯、甲醇3 種常用提取試劑對目標化合物的提取情況。結果表明，乙腈對紅霉素、氯霉素均有較好的提取效果，乙酸乙酯和甲醇則分別對紅霉素和氯霉素的提取效果不佳，加標絕對回收率偏低。乙腈作為提取溶劑既能保證目標化合物的提取效率，又可以減少引入強極性雜質和類弱極性雜質，還能起到沉淀蛋白的作用，減少基質效應，因此本研究選擇乙腈作為提取劑。本實驗還考察了乙腈和水的混合溶液對目標化合物的提取效果，結果表明，純乙腈的提取效率最高，隨著提取劑中水比例的增大，提取效率不斷降低，因此本實驗采用純乙腈作為提取試劑。

2.2.2 凈化方法的優化

水產品成分比較復雜，基質中含有大量的脂肪、蛋白質、色素等成分干擾檢測。本研究采用Oasis PRiME HLB小柱一步凈化，高體積分數有機相提取液上樣，直接收集，通過保留樣品基質中的雜質流出目標物的方式實現樣品溶液的凈化，無需活化、平衡和洗脫。Oasis PRiME HLB固相萃取小柱可以有效去除脂肪、磷脂、部分色素等雜質干擾而且步驟簡單，大大提高了預處理的效率。同時，在實驗過程中發現在純乙腈提取液中加入一定比例的水時通過Oasis PRiME HLB固相萃取小柱時去除脂質雜質的效果更佳。相對于水溶液，脂肪和磷脂在乙腈中的溶解性更強，純乙腈提取液上樣會有部分磷脂或者脂肪溶出，不能完全吸附在柱子上，導致基質效應變大；而提取液乙腈體積分數太低則會有部分藥物保留在柱上，導致藥物損失。本實驗通過加標比較絕對回收率的形式，比較了上樣提取液中乙腈體積分數分別為100%、90%、80%、70%和60%時通過固相萃取小柱時的凈化效果（圖2）。綜合比較，本實驗選擇了80%乙腈溶液上樣，此時去雜質凈化效果更好，氯霉素和紅霉素的絕對回收率最高。固相萃取小柱凈化后的樣品經氮氣吹干用流動相復溶，加入正己烷進一步去除脂肪和色素。通過冷凍離心，在低溫下蛋白質變性沉淀，色素和脂肪在水相中的溶解度降低，轉移到正己烷層，離心去除正己烷層達到更佳的凈化效果。

圖2 提取液中乙腈體積分數對凈化效果的影響Fig. 2 Effect of acetonitrile concentration on purification efficiency

2.3 線性范圍、檢出限與定量限

移取一定體積的氯霉素和紅霉素內標和標準溶液，混勻后氮氣吹干，流動相定容至1 mL，配成氯霉素質量濃度分別為0.25、0.5、1、5、10、30 ng/mL，紅霉素質量濃度為1.25、2.5、5、25、50、250 ng/mL的標準溶液。以目標物色譜峰的峰面積為縱坐標，化合物的質量濃度為橫坐標繪制標準曲線。結果表明：氯霉素在質量濃度為0.25～30 ng/mL，紅霉素在質量濃度為1.25～250 ng/mL范圍內呈線性，線性回歸方程和相關系數如表2所示。根據檢出限大于等于3 倍信噪比，定量限大于等于10 倍信噪比的計算方法，得出氯霉素的方法檢出限為0.05 μg/kg，定量限為0.1 μg/kg；紅霉素的方法檢出限為0.2 μg/kg，定量限為0.5 μg/kg。

表2 魚肉中氯霉素和紅霉素的回歸方程、線性范圍和相關系數Table 2 Regression equations, correlation coefficients and linear ranges of chloramphenicol and erythromycin in fish meat

2.4 回收率和精密度實驗結果

為了考察本實驗的可行性，向鯽魚、對蝦、梭子蟹和脂肪含量較高的養殖大黃魚空白樣品中添加3 個水平的紅霉素和氯霉素混合標準溶液，每組做6 個平行，按照上述前處理方法和儀器條件進行測定，回收率和精密度結果見表3。不同水產品（魚、蝦和蟹）在3 個添加水平的平均回收率在86.7%～102.6%之間，相對標準偏差小于5%。

表3 氯霉素和紅霉素在水產品中的平均加標回收率和精密度結果（n=6）Table 3 Average recoveries and relative standard deviations for chloramphenicol and erythromycin in spiked aquatic products (n= 6)

2.5 和國標方法比較

表4 本實驗方法與國標方法比較Table 4 Comparison of the method developed in this study with the Chinese national standard method

為考察本方法的可行性，通過在空白魚肉樣品加標的方式將本方法與國標方法進行比較，結果見表4。在實際工作中檢測方法除了滿足靈敏度要求外，還要考慮檢測成本和效率問題。國標以及現有的大多數紅霉素和氯霉素的檢測方法通常是大體積有機試劑提取，經過旋轉蒸干后溶劑轉換，經固相萃取小柱三步法凈化，需要花費較多的時間和試劑。相比國標方法，本方法前處理只需小體積有機溶劑提取，直接通過固相萃取一步法凈化，簡單易于操作，且能同時實現紅霉素和氯霉素的定量檢測，提高檢測效率，降低檢測成本，靈敏度滿足水產品中藥物殘留檢測要求，適合實驗室大批量檢測。

2.6 實際樣品測定和實驗室間比對

圖3 氯霉素陽性樣品色譜圖Fig. 3 Chromatogram of chloramphenicol positive sample

用本實驗方法對50 批次不同種類的水產品進行檢測，其中1批次黃鱔樣品檢出氯霉素，含量為0.899 μg/kg（圖3），其余樣品均未檢出，質控樣品的回收率等指標均達到分析要求，表明結果準確可靠。同時，本方法檢測了陽性魚肉凍干粉中氯霉素的含量，實驗結果與6 家實驗室（均采用國標方法進行氯霉素檢測）進行比對，結果相對標準偏差小于15%。

3 結 論

本研究基于高效液相色譜-串聯質譜技術建立了快速測定水產品中的氯霉素和紅霉素的檢測方法。本方法簡單易行，靈敏度滿足日常檢測要求。相比國標方法，該方法縮短分析時間，減少有機試劑用量，是一種高效率低成本的檢測方法。本方法還驗證了在魚、蝦、蟹等不同種類的水產品基質中檢測的可行性，適用于實驗室大批量樣品快速檢測。

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Simultaneous Determination of Chloramphenicol and Erythromycin Residues in Aquatic Products by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry with Oasis PRiME HLB Solid Phase Extraction Cleanup

KE Qingqing, LI Shiyan, ZHOU Fan, ZHENG Chongying, BEI Yijiang, WANG Dingnan, WANG Yang*
(Aquatic Products Quality Inspection Center of Zhejiang Province, Hangzhou 310023, China)

A rapid method was developed for the simultaneous determination of chloramphenicol and erythromycin residues in aquatic products by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry with solid phase extraction(SPE). Samples were extracted with acetonitrile and the extract was then purified by an Oasis PRiME HLB SPE cartridge.The analytes were detected in the multi-reaction monitoring (MRM) mode and quantified by the isotope internal standard method. The limits of quantification (LOQ) for chloramphenicol and erythromycin were 0.1 and 0.5 μg/kg, respectively.The average recoveries of the 2 analytes ranged from 86.7% to 102.6% with relative standard deviations of less than 5% in aquatic products (fish, shrimp and crab) at three spiked levels (n = 6). This proposed method was advantageous in routine detection of antibiotic residues in aquatic products for its simplicity and high sensibility.

solid phase extraction; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; aquatic products;chloramphenicol; erythromycin

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724039

O657.63

A

1002-6630（2017）24-0241-06

柯慶青, 李詩言, 周凡, 等. 基于通過型固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜法同時測定水產品中的氯霉素和紅霉素[J]. 食品科學, 2017, 38(24)∶ 241-246. DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724039. http∶//www.spkx.net.cn

KE Qingqing, LI Shiyan, ZHOU Fan, et al. Simultaneous determination of chloramphenicol and erythromycin residues in aquatic products by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry with Oasis PRiME HLB solid phase extraction cleanup[J]. Food Science, 2017, 38(24)∶ 241-246. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724039. http∶//www.spkx.net.cn

2016-12-05

浙江省2013年農業標準化研究項目

柯慶青（1988—），女，助理工程師，碩士，研究方向為水產品質量與安全。E-mail：kqqgogo@163.com

*通信作者：王揚（1973—），女，高級工程師，碩士，研究方向為水產品質量與安全。E-mail：wangyangruanfeng@163.com