采樣方法對冷鮮雞表面細菌DNA提取及高通量測序結果的影響

肖英平，何祥祥，戴寶玲，桂國弘，唐 標，楊 華,*

采樣方法對冷鮮雞表面細菌DNA提取及高通量測序結果的影響

肖英平1，何祥祥2，戴寶玲1，桂國弘1，唐 標1，楊 華1,*

（1.浙江省農業科學院農產品質量標準研究所，浙江省植物有害生物防控省部共建國家重點實驗室培育基地，浙江 杭州 310021；2.西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

目的：比較涂抹法和沖洗法對冷鮮雞表面細菌DNA提取及高通量測序結果的影響。方法：將4 只冷鮮雞對半分開，分別采用涂抹法和沖洗法采集其表面微生物，提取基因組DNA，對細菌16S rRNA基因V3～V4區進行聚合酶鏈式反應擴增，通過Illumina Hiseq測序平臺對擴增產物進行高通量測序，使用QIIME等軟件對測序序列進行分析統計。結果：兩種方法采集的樣品在細菌基因組DNA提取、菌群豐富度、多樣性及菌群結構等方面均無顯著差異（P＞0.05）。高通量測序結果表明，冷鮮雞表面細菌菌群主要分布于7 個門，10 個屬。變形菌門為優勢菌門，占70%以上；希瓦氏菌屬、假單胞菌屬、不動桿菌屬、嗜冷桿菌屬和環絲菌屬為優勢菌屬，分別占10%～20%。結論：兩種采樣方法對冷鮮雞表面細菌DNA提取及高通量測序沒有明顯影響，但沖洗法比涂抹法簡單易行，且不易發生二次污染，因此更具有實用性。本實驗同時也為冷鮮雞表面細菌的研究提供了數據資料。

冷鮮雞；菌群結構；涂抹法；沖洗法；高通量測序

近年來，我國許多城市已禁止活禽交易，實施肉雞統一屠宰，以冷鮮雞或“殺白雞”形式上市。所謂冷鮮雞，是指在嚴格執行獸醫檢驗檢疫制度和無公害管理的前提下，使屠宰后的雞肉胴體中心溫度在1～2 h內降至0～4 ℃，并在后續加工、流通及銷售過程中一直保持此溫度的生鮮雞肉[1-2]。與現宰活雞相比，冷鮮雞不僅更加安全衛生，而且由于溫度迅速降低而使肌肉僵直程度減弱，又經過充分的解僵熟化和排酸過程，蛋白質分解成較多的肽類、氨基酸及具有鮮味的核苷酸，使肉質變得柔軟有彈性、口感細膩、味道鮮美，并且營養物質容易被人體消化吸收。因此冷鮮雞的口感和營養價值都高于現宰活雞。自20世紀90年代起，冷鮮雞就已在歐美等市場普及，逐漸取代了現宰活雞和冷凍雞[2]。

冷鮮雞在屠宰、分割及其他加工過程中污染的微生物在肉表面繁殖造成其腐敗，同時污染的一些致病菌也易導致食源性疾病[3-5]。冷鮮雞污染的微生物主要生長在肉的表面，通常情況下肉深層無菌，因此研究肉品表面微生物群落特征對于保證冷鮮雞的質量安全具有十分重要的意義。

近年來高通量測序技術應用于農產品、畜產品微生物污染研究得到了迅速發展。高通量測序技術在分析微生物群落結構時，有著獨特的優勢，已成為微生物群落研究中非常重要的工具[6-7]。國內已有研究者利用16S rRNA基因的高通量測序技術對肉制品和水產品中細菌群落多樣性進行分析[8-10]。

應用高通量測序方法研究冷鮮雞微生物污染的第一步就是采集樣品表面的微生物并提取DNA。采樣方法不同可能會影響DNA提取效果并進而影響后續的實驗結果。因此，本實驗采用涂抹和沖洗兩種方法對冷鮮雞表面微生物進行采集，提取細菌基因組DNA，進行基于16S rRNA基因的高通量測序分析，從而對兩種采樣方法進行比較，以找到較適合的整只冷鮮雞的前處理方法，為冷鮮雞微生物檢測提供理論和實踐依據。同時也為冷鮮雞表面微生物的菌群結構研究提供了數據資料。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

在杭州4 家不同的超市購買4 只不同廠家生產的冷鮮雞，將它們對半分開，裝于無菌采樣袋中，分別編號為A、B、C、D和a、b、c、d（A和a為來自同一只雞對半分開的樣品，其他3 只同），置于4 ℃的車載冰箱中帶回實驗室用于實驗。

無菌采樣袋 青島海博生物技術有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒Fungal/Bacterial DNA MiniPrep?美國Zymo Research公司；瓊脂糖 美國Sunshine公司；DL5000 DNA Marker 北京擎科新業生物技術有限公司。

5427 R臺式高速離心機 德國Eppendorf公司；Nanodrop 2000超微量分光光度計 美國Thermo Fisher Scientific公司；水平電泳儀 北京百晶生物技術有限公司；SW-CF-IF超凈工作臺 蘇州安泰充氣技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品微生物采樣方法

冷鮮雞中微生物的采樣通常運用組織切割法、皮膚切割法、涂抹法和沖洗法，前兩者為破壞性采樣方法，操作較為復雜且取樣位置局限[11-13]。冷藏條件下，細菌主要分布于表面，因此比較分析涂抹法和沖洗法兩種非破壞性采樣方式對冷鮮雞表面微生物采集效果的影響。

1.2.1.1 涂抹法

在潔凈室中，編號為A、B、C、D的樣品，采用2 塊20 cm×20 cm的無菌紗布，涂抹1/2 只雞的整個表面，然后置于與1/2 只雞質量相等的滅菌生理鹽水中，搖勻，靜置10 min，取20 mL上清液，10 000×g離心10 min。

1.2.1.2 沖洗法

在盛放編號為a、b、c、d樣品的無菌采樣袋中加入與1/2只雞質量相等的滅菌生理鹽水，用手握住無菌袋激烈振蕩1 min，取出雞肉樣品，靜置10 min，取20 mL上清液，10 000×g離心10 min。

1.2.2 細菌DNA提取

使用ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep?提取細菌DNA。將上述不同采集方法離心得到的沉淀，用200 μL無菌生理鹽水重懸后轉移至ZR BashingBeadTMLysis Tube，然后按照試劑盒使用說明進行操作。使用Nanodrop 2000測定提取的DNA純度和含量，并采用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.2.3 16S rRNA基因PCR擴增

以提取的冷鮮雞表面細菌DNA為模板，使用引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）對細菌16S rRNA基因V3～V4區進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。

1.2.4 高通量測序及數據分析

測序由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。采用Illumina Hiseq 2500高通量測序平臺對冷鮮雞表面細菌16S rRNA基因的V3～V4區進行測序。通過QIIME軟件（Quantitative Insights Into Microbial Ecology，V1.7.0，http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html）對獲得的序列進行質控和過濾，剔除低質量的DNA序列[14-16]。使用QIIME的Ucluster方法根據相似性不低于97%原則將通過質控的有效序列聚類成為操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）[17]。通過繪制稀釋曲線評價所測序量是否覆蓋全部類群。采用QIIME默認參數計算各樣品的Alpha多樣性指數（ChaoⅠ、ACE、Simpson、Shannon和覆蓋度指數）。使用Sliva和RPD數據庫對所有OTU的代表性序列進行物種匹配，在門和屬的水平上對樣品的細菌組成進行統計，得到菌群分布結果，并繪制柱狀圖。使用GraphPad Prism 5對兩種采樣方法的數據進行成對t檢驗，P＜0.05為顯著性差異判定標準。根據各個樣品OTU的種類及其豐度，計算樣品間的遺傳距離，用加權UniFrac距離表示，根據計算結果使用R軟件（Version 2.15.3）中的FactoMineR軟件包對不同采樣方法所獲得的樣品表面細菌結構相似度進行主坐標分析（principal coordinate analysis，PCoA）。使用ggplot2軟件包繪制散點圖。

2 結果與分析

2.1 冷鮮雞細菌基因組DNA提取

表1 樣品含量及純度Table 1 Purity and concentration of extracted DNA in each sample

涂抹法（A、B、C、D樣品）和沖洗法（a、b、c、d樣品）提取細菌基因組DNA的純度和含量見表1。1%的瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，8 個樣本基因組條帶清晰，無降解，可滿足后續實驗要求（圖1）。兩種采樣方法對細菌基因組DNA提取效果無明顯影響。

圖1 冷鮮雞樣品細菌基因組DNA提取Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of bacterial genomic DNA extracted from chilled chicken

2.2 樣品微生物物種豐富度及多樣性

經過質控、過濾等處理，本實驗最終獲得429 492 條有效序列，各樣品間有效序列數差別不大，涂抹法樣品平均（53 700±3 663）條，沖洗法樣品平均（53 670±3 399）條，兩組無顯著性差異（P=0.994）。所獲得的有效序列根據97%相似性水平進行OTU聚類分析，各樣品最終獲得89～157 個OTU，兩組亦無顯著差異（OUT分別為136±16和125±13，P=0.531）。各樣品的覆蓋度指數均為0.999～1，表明樣本中序列沒有被測出的概率極低，因此本次測序結果能夠代表樣本的真實多樣性組成（表2）。各樣品的稀釋曲線均趨于平緩（圖2），表明測序已趨于飽和，測序深度已基本覆蓋樣品中所有物種。

圖2 各樣品稀釋曲線Fig. 2 Rarefaction curves of 8 different samples

進一步根據97%相似性水平下OTU的信息，使用ChaoⅠ指數、ACE指數、Shannon指數及Simpson指數對樣品微生物物種的豐富度和多樣性進行評估。觀察物種數量ChaoⅠ指數（151.4±17.16和131.8±11.79，P=0.432）和ACE指數（150.2±15.14和133.8±12.23，P=0.405）顯示兩種采樣方法對于樣品細菌群落豐富度無顯著影響。Shannon指數（4.282±0.262和4.381±0.203，P=0.243）和Simpson指數（0.912±0.018和0.924±0.010，P=0.235）顯示，兩種采樣方法所獲樣品的多樣性指數也無顯著性差異（表2）。

表2 樣品測序概況Table 2 Sequencing results for each sample

2.3 冷鮮雞表面細菌菌群結構

圖3 各樣品的細菌菌群結構Fig. 3 Bacterial community structures of different samples

將8 個樣品中獲得的OTU分別在門和屬水平上進行物種注釋，具體結果見表2和圖3?？梢钥闯?，本實驗所得到的冷鮮雞表面細菌樣品的序列主要分屬于7 個門，分別為變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）、脫鐵桿菌門（Deferribacteres）以及待定門TM7。其中變形菌門占70%以上，為優勢門，其次為厚壁菌門和擬桿菌門，三者共同構成了冷鮮雞菌群的主要結構。在屬的水平，希瓦氏菌屬（Shewanella）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）和環絲菌屬（Brochothrix）為主要菌屬，約占冷鮮雞菌群的90%以上，豐度分布較均勻；此外，還有少量的黃桿菌屬（Flavobacterium）、香味桿菌屬（Myroides）、魏斯氏菌屬（Weissella）、漫游球菌屬（Vagococcus）以及肉桿菌屬（Carnobacterium）。

希瓦氏菌屬和假單胞菌屬是典型的腐敗菌，其低溫環境適應能力強，是冷藏禽畜肉中的優勢菌，具有很強的產生氨等腐敗產物的能力[18-22]。此外，不動桿菌屬、嗜冷桿菌屬以及環絲菌屬中的熱死環絲菌（Brochothrix thermosphacta）也能在冷藏溫度下快速生長，是冷鮮禽畜肉及水產品低溫貯藏過程中的常見腐敗菌[23-28]。這些腐敗菌主要是在屠宰、加工、包裝、運輸及銷售等過程中污染雞肉，且在冷藏過程中大量繁殖，最終會導致冷鮮雞腐敗變質[29-30]。本研究顯示以上菌屬分別占冷鮮雞表面菌群的約10%～20%，除環絲菌屬外，兩種采樣方法沒有顯著性差異（表3）。

表3 不同分類水平上樣品的細菌群落結構及其相對豐度Table 3 Bacterial community structures and their relative abundances at different classification levels in the swabbing and rising samples

2.4 樣品的聚類與主坐標分析

根據各樣品OTU的種類及其豐度計算各樣品間的加權UniFrac距離（圖4A），并基于此對8 個樣品進行PCoA（圖4B）。結果表明，同一只冷鮮雞的樣品顯示出明顯聚集，而不同冷鮮雞樣品之間相距較遠。這表明涂抹和沖洗兩種采樣方法對于冷鮮雞表面微生物的菌群結構無明顯影響。

圖4 各樣品菌落結構的聚類和PCoAFig. 4 Cluster analysis and PCoA of bacterial community structure among the samples

3 結 論

本實驗采用涂抹法和沖洗法對冷鮮雞表面微生物進行采集，提取細菌基因組DNA，進行基于16S rRNA基因的高通量測序分析。結果表明：1）涂抹法和沖洗法對冷鮮雞表面微生物DNA提取效果無顯著差異；2）冷鮮雞表面細菌菌群主要分布于7 個門，變形菌門為優勢菌門，其中的希瓦氏菌屬、假單胞菌屬、不動桿菌屬和嗜冷桿菌屬為優勢菌屬，此外，厚壁菌門的環絲菌屬豐度也較高，這些優勢菌為典型的腐敗菌[26,30]；3）兩種采樣方法對冷鮮雞表面細菌菌群的豐富度、多樣性以及菌群結構均沒有明顯影響，但沖洗法比涂抹法簡單易行，且不易發生二次污染，因此更具有實用性。

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Effects of Different Sampling Methods on Microbial DNA Extraction from Chilled Chicken and the High-Throughput Sequencing of Amplification Products

XIAO Yingping1, HE Xiangxiang2, DAI Baoling1, GUI Guohong1, TANG Biao1, YANG Hua1,*
(1. Institute of Quality and Standard for Agro-Products, State Key Laboratory Breeding Base for Zhejiang Sustainable Pest and Disease Control, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China;2. College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

Objective∶ To compare the swabbing and rinsing methods used for sampling chilled chicken by evaluating their effects on microbial DNA extraction and subsequent high-throughput sequencing. Methods∶ Four chilled chickens were divided into equal halves and sampled by superficial swabbing and rinsing methods for each half, respectively. Microbial genomic DNA was extracted from the collected samples and the V3-V4 region of the bacterial 16S rRNA gene was amplified by PCR. The PCR products were then subjected to high-throughput sequencing on an Illumina HiSeq sequencing platform. The obtained sequences were processed and analyzed using QIIME and other softwares. Results∶ There was no difference in bacterial genomic DNA extraction or bacterial community richness, diversity and structures between the samples collected by the two methods (P ＞ 0.05). High-throughput sequencing showed that the bacterial community in chilled chicken samples consisted mainly of 7 phyla and 10 genera. Proteobacteria was the dominant phylum, accounting for more than 70% of the bacterial community; Shewanella, Pseudomonas, Acinetobacter, Psychrobacter, and Brochothrix were the dominant genera, each representing 10%-20% of the bacterial community. Conclusions∶ The two sampling methods exhibit no obvious difference in bacterial DNA extraction from chilled chicken or high-throughput sequencing. However,compared with swabbing, rinsing has the advantages of easy operation and non-secondary contamination, so it is more practical in microbiological analysis of chilled chicken. The experiment also provides useful data for the study of bacteria on chilled chicken.

chilled chicken; bacterial community; swabbing method; rinsing method; high-throughput sequencing

2016-12-11

浙江省公益技術運用研究項目（2016C32073）；

浙江省植物有害生物防控重點實驗室——省部共建國家重點實驗室培育基地項目（2010DS700124-ZM1608）

肖英平（1984—），男，助理研究員，博士，研究方向為畜產品質量安全。E-mail：ypxiaozju@126.com

*通信作者：楊華（1972—），男，高級畜牧師，碩士，研究方向為畜產品質量安全。E-mail：yanghua806@hotmail.com

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724042

TS251.55；TS207.4

A

1002-6630（2017）24-0260-05

肖英平, 何祥祥, 戴寶玲, 等. 采樣方法對冷鮮雞表面細菌DNA提取及高通量測序結果的影響[J]. 食品科學, 2017,38(24): 260-264.

10.7506/spkx1002-6630-201724042. http://www.spkx.net.cn

XIAO Yingping, HE Xiangxiang, DAI Baoling, et al. Effects of different sampling methods on microbial DNA extraction from chilled chicken and the high-throughput sequencing of amplification products[J]. Food Science, 2017, 38(24)∶ 260-264.(in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724042. http∶//www.spkx.net.cn