仙靈骨葆膠囊對去勢大鼠股骨組織形態計量學和OCN、Cbfα1 mRNA的影響

孫偉珊　霍少川　王曉東　孫平　王海彬

【摘要】 目的 探討仙靈骨葆膠囊對去勢大鼠股骨形態計量學和成骨相關基因骨鈣素（OCN）、核心結合因子（Cbfα1） mRNA的影響。方法 50只6月齡雌性SD大鼠， 隨機分為A組（作為空白對照）、B組

（作為模型）、C組（給予高劑量仙靈骨葆膠囊）、D組（給予低劑量仙靈骨葆膠囊）、E組[給予阿侖膦酸鈉維D3片（福美加）]， 每組10只。藥物干預3個月后， 采用X線顯微斷層顯像儀檢測左側離體股骨骨密度（BMD）和骨小梁數量（TbN）， 逆轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測右側股骨組織OCN、Cbfα1 mRNA表達， 比較各組檢測結果。結果 干預3個月后， B組左側股骨BMD、TbN明顯低于A組， 差異具有統計學意義（P<0.05）；與B組比較， C、E組左側股骨BMD明顯增高， E組左側股骨TbN明顯增高， 差異具有統計學意義（P<0.05）；與E組比較， C、D組左側股骨BMD、TbN明顯降低， 差異具有統計學意義（P<0.05）；五組左側股骨BMD、TbN比較差異具有統計學意義（F=86.400、28.027， P<0.05）。干預3個月后， 與A組比較， B組右側股骨Cbfα1、OCN mRNA表達量明顯降低， 差異具有統計學意義（P<0.05）；與B組比較， C、D、E組右側股骨Cbfα1 mRNA表達量明顯增高（P<0.05）， C、E組右側股骨OCN mRNA表達量明顯增高， 差異具有統計學意義（P<0.05）；與E組比較， C組右側股骨Cbfα1和OCN mRNA表達量明顯增高（P<0.05）， D組右側股骨Cbfα1 mRNA表達量明顯降低， 差異具有統計學意義（P<0.05）；五組大鼠右側股骨Cbfα1、OCN mRNA比較差異具有統計學意義（F=13.233、48.338， P<0.05）。結論 仙靈骨葆膠囊提高去勢大鼠股骨BMD可能是通過提高OCN、Cbfα1 mRNA表達量發揮作用， TbN和BMD及成骨基因OCN、Cbfα1之間的關系尚需要進一步研究。

【關鍵詞】 仙靈骨葆膠囊；去勢大鼠；骨質疏松；骨鈣素；核心結合因子

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.34.112

Effect of Xianling Gubao capsule on femoral histomorphometry and OCN and Cbfα1 mRNA in ovariectomized rats SUN Wei-shan， HUO Shao-chuan， WANG Xiao-dong， et al. First Affiliated Hospital of Guangdong Medical University， Guangzhou 510080， China

【Abstract】 Objective To discuss the effect of Xianling Gubao capsule on femoral histomorphometry and osteocalcin （OCN） and core binding factor （Cbfα1） mRNA in ovariectomized rats. Methods A total of 50 6-month-old female SD rats were randomly divided into group A （blank control）， group B （model）， group C （high-dose of Xianling Gubao capsule）， group D （low-dose Xianling Gubao capsule） and group E [alendronate sodium and vitamin D3 tablets （Fumega）]， with 10 rats in each group. After 3 months of drug intervention， the left femur bone mineral density （BMD） and trabecular number （TbN） were measured by X-ray microscopy， and the expression of OCN and Cbf α1 mRNA in right femurs was detected by reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR）. The results of each group were compared. Results After 3 months of drug intervention， group B had obviously lower left femur BMD， TbN than group A， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Compared with group B， group C and E had obviously higher left femur BMD and group E had obviously higher left femur TbN. Their difference was statistically significant （P<0.05）. Compared with group E， group C and E had obviously lower left femur BMD and TbN， and their difference was statistically significant （P<0.05）. Five groups had statistically significant difference in left femur BMD and TbN （F=86.400， 28.027， P<0.05）. After 3 months of drug intervention， group B had obviously lower right femur Cbfα1 and OCN mRNA expression than group A， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Compared with group B， group C， D and E had obviously higher right femur Cbfα1 mRNA expression （P<0.05）， and group C and E had obviously higher right femur OCN mRNA expression. Their difference was statistically significant （P<0.05）. Compared with group E， group C had obviously higher right femur Cbfα1 and OCN mRNA expression （P<0.05）， and group D had obviously lower right femur Cbfα1 mRNA expression. Their difference was statistically significant （P<0.05）. Five groups had statistically significant difference in right femur Cbfα1 and OCN mRNA expression （F=13.233， 48.338， P<0.05）. Conclusion Xianling Gubao capsule may increased femoral BMD in ovariectomized rats may by increasing expression of OCN and Cbf mRNA α1. The relationship between TbN and BMD and osteogenic genes OCN and Cbfα1 may be further studied.endprint

【Key words】 Xianling Gubao capsule； Ovariectomized rats； Osteoporosis； Osteocalcin； Core binding factor

骨質疏松（osteoporosis， OP）是一種全身性疾病， 其特征具有低骨量和骨微結構的退化， 并且導致骨的脆性增加和骨折風險[1]。世界衛生組織認為OP是僅次于心血管疾病的一個重要健康問題， 因此OP的預防及治療具有重要的意義。目前經FDA批準應用于臨床的抗OP藥物雖然可有效降低OP性骨折的風險[2]， 但長期持續應用， 大多數都有一定的副作用[3]。中醫藥治療OP能夠緩解疼痛， 改善功能， 提高患者生活質量。仙靈骨葆膠囊屬于中成藥， 能夠有效調節骨代謝， 改善骨骼強度， 防治OP[4]。為了進一步探討仙靈骨葆膠囊的作用機制， 作者以骨形成相關基因骨鈣素（osteocalcin， OCN）和核心結合因子（core binding factor apha 1， Cbfα1）為切入點， 探討仙靈骨葆膠囊對去勢SD大鼠股骨形態的影響， 以揭示仙靈骨葆膠囊防治OP的作用機制。

1 材料與方法

1. 1 材料

1. 1. 1 實驗動物 選用6月齡SPF級雌性SD大鼠50只， 平均體重（447.24±59.57）g， 購于廣州中醫藥大學實驗動物中心[許可證號：SYXK（粵）2013-0001]。所有SD大鼠均在恒溫、恒濕的清潔環境中飼養， 室濕控制在23～25℃， 濕度50%左右， 標準飼料喂養， 自由攝食飲水， 通風良好， 適應喂養1周后建立骨質疏松模型。

1. 1. 2 實驗藥物 仙靈骨葆膠囊[國藥集團同濟堂（貴州）制藥有限公司， 國藥準字Z20025337]。福美加（杭州默沙東制藥有限公司， 國藥準字J20130085）。

1. 1. 3 主要儀器和試劑 X線顯微斷層顯像儀（Skyscan公司）， 熒光定量PCR儀器（Bio-rad公司）， 多功能酶標儀（Thermo公司）， 離心機（eppendorf公司）， 逆轉錄儀（Bio-Rad公司）， 全能型凝膠成像系統（Bio-Rad公司）， 熒光定量PCR檢測試劑盒（Genecopies公司）， 逆轉錄試劑盒（DBI公司）。引物設計為：OCN（上游：5-TGACTGCATTCTGCCTCTG-3， 下游：5-CGGAGTCTATTCACCACCTTAC-3）、Cbfa1（上游：CCAAGA

AGGCACAGACAGAA， 下游：5-CGGGACACCTACTCTCATAC

T-3）， GAPDH（上游：5-GCAAGGATACTGAGAGCAAGAG-3， 下游：5- GGATGGAATTGTGAGGGAGATG-3）， 由廣州四和生物科技有限公司提供。

1. 2 實驗方法

1. 2. 1 分組與造模 將50只大鼠隨機分為A組（作為空白對照）、B組（作為模型）、C組（給予高劑量仙靈骨葆膠囊）、D組（給予低劑量仙靈骨葆膠囊）、E組（給予福美加）， 每組10只。五組大鼠用10%水合氯醛水溶液按 0.35 ml/100 g 腹腔注射麻醉大鼠， 在脊柱兩側約 1.5 cm 處作縱行切口， 切開皮膚、皮下組織及深筋膜， 在腹腔中找到梅花狀的卵巢， B、C、D、E組切除卵巢， 并用 1 號絲線在卵巢底部結扎， 觀察切口處滲血情況， 待無滲血時將脂肪回納腹腔， 縫合背部筋膜層， 生理鹽水沖洗后縫合皮膚；A組僅切除周圍少量脂肪組織。造模后大鼠置于鼠籠中單獨飼養， 術后連續3 d給予注射用青霉素鈉（北京悅康凱悅制藥有限公司， 國藥準字H11020456）肌內注射（5萬U/d）， 預防感染。

1. 2. 2 藥物干預 造模3 d后， C、D組給藥劑量分別為30.85、15.43 mg/（100 g·d）， 1次/d， 每周給藥6 d；E組給藥劑量為0.72 mg/（100 g·d）， 每周給藥1次。

1. 2. 3 指標檢測 干預3個月后， 處死各組大鼠， 取雙側股骨進行BMD、TbN及OCN、Cbfa1 mRNA檢測。從-80℃冰箱中取出左側離體股骨， 置于恒溫水浴箱解凍后采用X線顯微斷層顯像儀檢測BMD和TbN。從液氮中取出右側股骨， 取30～50 mg組織加入1 ml TRIzol Reagent， 用勻漿儀進行勻漿處理， 獲取總RNA， 按照熒光定量PCR試劑盒說明書操作， 通過RT-PCT檢測OCN、Cbfa1 mRNA表達。

1. 3 統計學方法 采用SPSS18.0統計學軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 多組比較首先進行方差齊性檢驗， 方差齊采用單因素方差分析， 若不齊時采用非參數方差分析， 多組間兩兩比較采用單因素方差分析LSD法。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2. 1 五組大鼠左側股骨BMD、TbN比較 干預3個月后， B組左側股骨BMD、TbN明顯低于A組， 差異具有統計學意義（P<0.05）；與B比較， C、E組左側股骨BMD明顯增高， E組左側股骨TbN明顯增高， 差異具有統計學意義（P<0.05）；與E組比較， C、D組左側股骨BMD、TbN明顯降低， 差異具有統計學意義（P<0.05）；五組左側股骨BMD、TbN比較差異具有統計學意義（F=86.400、28.027， P<0.05）。見表1。不同干預方法的大鼠股骨BMD、TbN情況見圖1。

2. 2 五組大鼠右側股骨Cbfα1、OCN mRNA比較 干預3個月后， 與A組比較， B組右側股骨Cbfα1、OCN mRNA表達量明顯降低， 差異具有統計學意義（P<0.05）；與B組比較， C、D、E組右側股骨Cbfα1 mRNA表達量明顯增高（P<0.05）， C、E組右側股骨OCN mRNA表達量明顯增高， 差異具有統計學意義（P<0.05）；與E組比較， C組右側股骨Cbfα1和OCN mRNA表達量明顯增高（P<0.05）， D組右側股骨Cbfα1 mRNA表達量明顯降低， 差異具有統計學意義（P<0.05）；五組大鼠右側股骨Cbfα1、OCN mRNA比較差異具有統計學意義（F=13.233、48.338， P<0.05）。見表2。endprint

3 討論

OP的發病機制就是由于在骨重建的過程中失去了成骨細胞和破骨細胞的動態平衡， 出現骨吸收速度超過骨形成速度， 新生骨量少于被吸收骨量即發生負平衡， 導致骨總量的丟失， 引起骨質疏松癥[5]。目前治療的西藥主要分為減少骨吸收藥物、促進骨形成藥物。阿侖膦酸鈉是治療OP的常用藥物， 能快速緩解患者疼痛， 但是遠期療效較差[6]。目前開發的部分針對OP發病機制的靶向藥物還處于臨床試驗階段， 其安全性、有效性還需要長期臨床觀察[7]。

從中醫角度來說， OP 屬于“骨痿”范疇， 主要是由于腎虛引起， 造成肝、脾等臟器功能發生紊亂。仙靈骨葆膠囊主要由淫羊藿、續斷、丹參、知母、補骨脂、地黃等多味中藥組成。方中， 淫羊藿具有補腎、堅筋骨的功效[8]；續斷具有補肝腎、行血脈、強筋骨的功效[9]；丹參具有活血化瘀、理氣止痛的功效；補骨脂具有溫腎助陽、提高機體免疫的功效， 能夠增強OCN mRNA 的表達[10]；地黃具有清熱涼血、滋陰生津的功效。諸藥共用， 具有活血化瘀、滋補肝腎之功效， 能增加骨強度， 改善局部血液供應， 通絡止痛， 緩解患者的癥狀。本研究中， 仙靈骨葆膠囊高劑量和福美加明顯提高去勢大鼠BMD， 仙靈骨葆膠囊高、低劑量未提高TbN表達量， 福美加明顯提高TbN表達量， BMD影響因素較多， 如組織容量、骨小梁厚度等， 中醫藥是否能夠提高BMD的同時提高TbN表達量尚需要深入探討。

OCN是由成熟的骨細胞和成骨細胞合成與分泌， 是成骨細胞的標志， 在骨組織礦化和成骨細胞分化增加時， OCN也隨之特異增加[11]。張洪躍等[12]研究發現， 大鼠骨髓間充質干細胞成骨分化過程中OCN蛋白的表達隨著補骨脂素濃度的升高而升高。張哲等[13]研究發現小鼠骨髓基質干細胞成骨誘導第7天時， 老鸛草素各劑量組OCN含量較對照組顯著升高， 呈劑量依賴性。Cbfα1屬于runt 結構基因家族的轉錄因子， 調控成骨細胞活性和分化， 是成骨細胞最早且最具有特異性的標志。李楠等[14]研究發現巴戟天水提物與巴戟天多糖均能顯著提高成骨細胞Cbfα1mRNA 的表達。劉國巖等[15]研究骨碎補對大鼠骨髓間充質干細胞增殖分化及Cbfα1表達的影響， 結果發現體外中藥骨碎補可促進大鼠BMSCs 增殖及成骨分化， 加強Cbfα1 表達。巴戟天和骨碎補屬于補腎陽中藥， 以上研究說明補腎中藥能夠促進和OCN、Cbfα1表達量。本研究結果顯示， 干預3個月后， B組左側股骨BMD、TbN明顯低于A組， 差異具有統計學意義（P<0.05）；與B組比較， C、E組左側股骨BMD明顯增高， E組左側股骨TbN明顯增高， 差異具有統計學意義（P<0.05）；與E組比較， C、D組左側股骨BMD、TbN明顯降低， 差異具有統計學意義（P<0.05）；五組左側股骨BMD、TbN比較差異具有統計學意義（F=86.400、28.027， P<0.05）。干預3個月后， 與A組比較， B組右側股骨Cbfα1、OCN mRNA表達量明顯降低， 差異具有統計學意義（P<0.05）；與B組比較， C、D、E組右側股骨Cbfα1 mRNA表達量明顯增高（P<0.05）， C、E組右側股骨OCN mRNA表達量明顯增高， 差異具有統計學意義（P<0.05）；與E組比較， C組右側股骨Cbfα1和OCN mRNA表達量明顯增高（P<0.05）， D組右側股骨Cbfα1 mRNA表達量明顯降低， 差異具有統計學意義（P<0.05）；五組大鼠右側股骨Cbfα1、OCN mRNA比較差異具有統計學意義（F=13.233、48.338， P<0.05）。說明仙靈骨葆膠囊能夠提高OCN、Cbfα1 mRNA表達量， 與上述研究一致。

綜上分析， 仙靈骨葆膠囊能夠提高去勢大鼠BMD、OCN和Cbfα1 mRNA表達量， 但未發現提高TbN。因此有理由相信仙靈骨葆膠囊能夠提高去勢大鼠BMD可能是通過提高OCN、Cbfα1 mRNA表達量發揮作用， TbN和BMD及成骨基因OCN、Cbfα1之間的關系尚需要進一步研究。

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[收稿日期：2018-10-18]endprint