活性污泥中氨氧化菌實時熒光定量PCR標準品制備方法的比較

倪 敏，劉婷婷，顧海東，潘 楊，李 祥

(蘇州科技大學 江蘇省環境科學與工程重點實驗室； 環境科學與工程學院，江蘇 蘇州 215009)

活性污泥中氨氧化菌實時熒光定量PCR標準品制備方法的比較

倪 敏，劉婷婷，顧海東，潘 楊，李 祥

(蘇州科技大學 江蘇省環境科學與工程重點實驗室； 環境科學與工程學院，江蘇 蘇州 215009)

為了快速準確地檢測活性污泥中氨氧化菌(AOB)的拷貝數，探求一種新的快速簡便的絕對定量標準品的制備方法。利用純化的PCR產物和重組質粒標準品分別進行絕對定量，比較兩者熔解曲線、擴增曲線、標準曲線和絕對拷貝數等方面的差異，分析兩種標準品制備方法應用方面的優勢。結果顯示，兩種標準品制備的熔解曲線都呈單一尖峰、擴增曲線指數期平行、標準曲線R2gt;99%，PCR產物作為標準品得到的AOB絕對拷貝數小于質粒標準品的結果(Plt;0.05)，表明純化的PCR產物作為標準品較制備重組質粒標準品而言，操作過程更加簡便、經濟、對人員專業要求更低，在其純度較高的情況下，具有和重組質粒標準品一樣的應用效果。

氨氧化菌； 絕對定量； PCR產物； 重組質粒； 腐殖酸

0 引 言

環境樣品中微生物數量眾多且成分復雜，突變和進化導致的16S rRNA保守序列有所不同。氨氧化菌(AOB)是一種與土壤微生物功能豐度相關的細菌，對污水中相關參數的沖擊敏感，被認為是硝化的限速步驟[1]。研究其含量對控制和提高污水處理過程中脫氮的穩定運行具有重要意義[2]，氨氧化菌進行實時定量PCR的分析方法主要分為相對定量和絕對定量[3-5]。相對定量無恒定的管家基因，難以對目標基因進行標準化[6]。絕對定量較為準確，也是目前環境微生物基因水平定量研究的首選。標準曲線的制備是絕對定量PCR實驗的關鍵步驟。傳統方法是將待測基因的目的片段克隆到質粒中，測定重組質粒濃度、計算其拷貝數，稀釋成不同濃度的標準品[7]。這種制備質粒標準品的方法需要經過純化PCR產物、測序、連接T-載體、制備大腸桿菌感受態細胞、轉化大腸桿菌、搖菌、抽提質粒等一系列復雜過程，該過程耗時長、人員操作和實驗環境要求較高[8-10]。而PCR產物經兩輪膠回收純化，模板純度和質量已得到優化，作為實時定量PCR的標準品是否能夠替代質粒標準品去檢測AOB基因的絕對拷貝數，沒有報道。

本文以文獻報道的構建重組質粒作為標準品的技術為參照，研究了純化的PCR產物作為標準品，定量活性污泥AOB基因應用的可行性，探討純化的PCR產物作為標準品的應用特點，為絕對定量標準品的制備提供新的有效方法。

1 材料與方法

1.1AOB的富集培養

參照北京工業大學申請的發明專利[11]，其中恒溫32 ℃；溶解氧0.5～1 mg/L進行富集培養。

1.2引物設計

利用Primer 5.0引物設計軟件，氨氧化細菌AOB16S rRNA和M13通用引物序列如表1所示。

表1 實驗所用引物

1.3DNA的抽提及瓊脂糖凝膠電泳

活性污泥DNA提取采用美國MP公司生產的DNA提取試劑盒FastDNA Spin kit for soil，MP-116560。混合DNA提取后的3個平行樣品，降低提取過程的操作誤差。利用核酸蛋白測定儀NanoDrop2000檢測基因組的A260/230、A260/280和濃度。2%的瓊脂糖凝膠，95 V電泳35 min，檢測基因組抽提的完整性及質量。

1.4PCR擴增及膠回收

0.2 mL PCR管中配置20 μL的體系如下：0.2 μL TaKaRa Taq (5 U/mL)，2 μL 10×PCR Buffer (Mg2+Plus)，2 μL dNTP Mixture (各2.5 mmol/L)，2μL模板DNA (10 ng/μL)，1 μL上游引物(10 nmol/L)，1 μL下游引物(10 nmol/L)、滅菌蒸餾水加至20 μL。將上述反應液離心、混勻、再離心在PCR儀中進行以下循環：95 ℃預變性5 min；98 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環；反應體系溫度最后降至4 ℃，待分析。

1.5制備重組質粒標準品[12-13]

按照TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0的操作說明對PCR產物進行膠回收純化(AOB基因產物長度491 bp)。以回收的PCR產物為模板，以相同條件進行PCR擴增，切膠、回收，將第二次回收的PCR產物作為標準品進行實時定量PCR。每次回收后，用核酸蛋白測定儀測定回收PCR產物的A260/230、A260/280和濃度，重復3次。第一次回收的PCR產物，按照pGEM-T Easy Vector Systems試劑盒的說明書進行與載體連接、轉化。按照質粒快速提取試劑盒(天根生化科技有限公司)的操作說明書進行質粒的提取，對提取的質粒進行PCR、酶切和測序鑒定。利用DNA樣品和純水作參照，用核酸蛋白測定儀測定重組質粒標準品和PCR產物標準品的A260/230、A260/280和濃度，測定重復3次。根據下式計算質粒標準品和PCR產物標準品的起始拷貝數：

DNA拷貝數(copies/μL)=

(6×1023×CDNA×10-9)/MW

式中：M代表拷貝DNA分子的堿基對數，bp/copy；W代表1個堿基對的道爾頓，660 Daltons/bp；CDNA為DNA濃度，ng/μL。

1.6實時熒光定量PCR

(1) 標準曲線的建立及AOB基因的檢測。10倍系列稀釋的重組質粒標準品和抽提的待測樣品基因組為模板，定量檢測。反應體系為20 μL，反應組分為：Mix 12.5 μL、P1和P2各0.58 μL、重組質粒DNA 2 μL、滅菌三蒸水9.5 μL。反應條件同常規PCR，總延伸結束后，加入熔解曲線的制備(95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s)步驟。以起始模板數的對數為x軸，循環數Ct值為y軸做回歸，建立標準曲線。PCR產物作為標準品，建立標準曲線的方法同上。

(2) 定量結果分析。以抽提樣品基因組為模板進行實時定量PCR，所得的Ct值代入標準曲線，求出兩種標準品制備方法中AOB的絕對拷貝數(copies/g)。

2 結果與討論

2.1PCR產物兩次膠回收后濃度和質量

土壤樣品成分復雜，腐殖酸、蛋白質、酚類等都會影響DNA的質量和純度，兩次膠回收后PCR產物的濃度和質量見表2，第二次PCR產物回收后的A260/230平均值0.62顯著高于第一次的0.18 (Plt;0.05)，這可能與樣品中較多的腐殖酸殘留有關[16-18]。第一次和第二次PCR產物回收后，A260/280平均值分別為1.30和1.64，第二輪純化減少了雜質的殘留，提高了PCR產物的質量，為PCR產物作為標準品提供了可能。兩次純化后PCR產物的純度仍然與高質量的質粒標準品(見表2)有一些差距[7]，兩次純化后的PCR產物是否可作為標準品，有待進一步的研究。

表2 兩次膠回收后PCR產物的濃度和質量

2.2擴增曲線

為了研究PCR產物作為標準品是否能夠替代質粒標準品，將兩種標準品和樣品AOB基因分別進行絕對定量，結果見圖1。由圖1可知，每組擴增曲線拐點清楚，低濃度樣本指數期明顯，曲線指數期斜率與擴增效率成正比，基線平直或略微下降，無明顯的上揚趨勢，曲線整體平行性好，說明每組定量PCR各管的擴增效率一致，兩組標準曲線適用于待測樣品基因的定量。

2.3熔解曲線

(a) 標準品-PCR產物和樣品AOB基因

(b) 標準品-質粒和樣品AOB基因圖1 擴增曲線

(a)標準品?PCR產物和樣品AOB基因(b)標準品?質粒和樣品AOB基因

圖2 熔解曲線

2.4標準曲線和樣品AOB基因拷貝數

為了研究標準品梯度稀釋后進行實時定量PCR的Ct值與模板的拷貝數之間的線性關系是否符合絕對定量的要求，根據兩組定量結果建立標準曲線，如圖3所示。表3中PCR產物標準品和質粒標準品對應標準曲線的相關系數R2分別為99.80%和99.60%，符合文獻報道的范圍[7]。PCR產物標準品和質粒標準品對應標準曲線的擴增效率E分別為83.47%和104.66%，質粒標準品建立的標準曲線E值在合理的范圍內[19]，表明模板、酶、雜質等各因素對擴增的抑制作用非常小；PCR產物標準品建立的標準曲線E值稍低，這可能與表1顯示的回收PCR產物中模板的純度稍低有關，Taq酶對腐殖酸較為敏感，模板中殘留的腐殖酸可能抑制了定量PCR反應[20]。根據式(1)計算兩種標準品絕對定量的起始拷貝數，代入圖3標準曲線的關系式中，得到樣品AOB基因的拷貝數，結果見表3。兩組絕對定量AOB基因的拷貝數分別為：6.36×1015copies/g，3.42×1015copies/g (Plt;0.05)，結果差異顯著，這與標準品的質量和純度有關。說明在樣品雜質較多，腐殖酸含量較高時，PCR產物作為標準品進行絕對定量的結果比質粒標準品偏小。

(a) 標準品-PCR產物和樣品AOB基因

(b) 標準品-質粒和樣品AOB基因圖3 標準曲線

表3 AOB基因標準曲線相關參數和拷貝數

3 結 語

PCR產物通過兩次膠回收純化后，質量和純度有很大的提高，可能由于腐殖酸的殘留，標準品-PCR產物絕對定量AOB的拷貝數低于標準品-質粒的結果。對于缺乏內參基因，DNA純度較高的樣品，PCR產物可作為標準品進行絕對定量；對于雜質較多，特別是腐殖酸含量較高的樣品，傳統的制備質粒標準品進行絕對定量的擴增效率較為理想，穩定性更高，結果更準確。

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AComparativeStudyoftheStandardPreparationMethodsofReal-timeFluorescenceQuantitativePCRofAmmoniaOxidizingBacteriainActivatedSludge

NIMin，LIUTingting，GUHaidong，PANYang，LIXiang

(Jiangsu Key Laboratory of Environmental Science and Engineering; School of Environmental Science and Engineering, Suzhou University of Science and Technology, Suzhou 215009, Jiangsu, China)

To detect the copy number of ammonia oxidizing bacteria (AOB) of activated sludge rapidly and accurately, and to explore an easy preparation method of absolute quantitative PCR standard, this study used purified PCR product and preparative recombinant plasmid, respectively, to conduct absolute quantification PCR (AQ-PCR).The melting curve, amplification curve, standard curve and differences of absolute copy number were compared, the advantages of the two standard preparation method were analyzed.The results showed that the two melting curves of preparation standard were a single peak, the index phases of the amplification curves were parallel,R2values of standard curves were more than 99%, the AOB absolute copy number of PCR product as a standard was less than the results of recombinant plasmid standard (Plt;0.05).It indicates the purification of PCR products as a standard is more convenient, more economic, and lower personnel professional requirements than the recombinant plasmid standard.In the case of the high purity, PCR product has the same application effect with recombinant plasmid standard.

ammonia oxidizing bacteria(AOB); absolute quantification; PCR product; recombinant plasmid; humic acid

Q 89；X 703.1

A

1006-7167(2017)10-0017-04

2017-02-03

國家研發計劃項目(2016YFC0401103)；國家自然科學基金項目(51478284，51408387)；蘇州市分離凈化材料與技術重點實驗室項目(SZS201512)；江蘇省高等教育教改研究項目(2015JSJG248)

倪 敏(1989-)，女，安徽阜陽人，實驗師，現主要從事微生物去氮除磷理論及工藝研究。Tel.：0512-68092510；E-mail: nimin@mail.usts.edu.cn

李 祥(1984-)，男，江蘇儀征人，實驗師，現主要從事廢水脫氮處理理論及工藝研究。Tel.：0512-68786192；E-mail: lixiang@mail.usts.edu.cn