提高細(xì)胞融合率的實驗方法探討

侯 元，霍德勝，溫得中

(吉林大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，長春 130021)

提高細(xì)胞融合率的實驗方法探討

侯 元，霍德勝，溫得中

(吉林大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，長春 130021)

提出了通過調(diào)整pH值的方法，成功將PEG8000作為誘導(dǎo)劑應(yīng)用于細(xì)胞融合過程提高細(xì)胞融合率，效果優(yōu)于PEG4000作細(xì)胞融合的誘導(dǎo)劑，使用不同細(xì)胞驗證并提供了最佳細(xì)胞濃度。采用PEG8000誘導(dǎo)，GKN緩沖系統(tǒng)，蟾蜍紅細(xì)胞為原料，在pH8.0環(huán)境下進(jìn)行細(xì)胞融合，融合率最高。實驗驗證，此方法穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好，具有操作簡便，快速、準(zhǔn)確可重復(fù)等優(yōu)點，為細(xì)胞融合實驗提供了新方法。可用于細(xì)胞融合實驗教學(xué)，也可為科研、生產(chǎn)提供參考。

細(xì)胞融合； 誘導(dǎo)劑； 融合率； 聚乙二醇

0 引 言

細(xì)胞融合(cell fusion)是指細(xì)胞在離體條件下，通過介導(dǎo)和培養(yǎng)，由2個或2個以上的細(xì)胞合并成1個核或多核的雜核細(xì)胞的過程。細(xì)胞融合的方法有生物法(病毒法)、化學(xué)法(PEG法)、物理法(脈沖、激光法)和細(xì)胞融合芯片法[1]。細(xì)胞融合作為細(xì)胞工程重點開發(fā)的內(nèi)容[2]，在揭示疾病發(fā)生和衰老機(jī)制的研究；基因定位及干細(xì)胞介導(dǎo)的組織再生等領(lǐng)域的研究；以及微生物學(xué)，植物育種；特別是單克隆抗體的制備等方面，具有十分重要的意義[3]。

近幾年來，人們對細(xì)胞融合技術(shù)的研究不斷深入。特別是PEG介導(dǎo)的細(xì)胞融合最適條件的報導(dǎo)接連不斷。但這些報導(dǎo)中絕大多部分是從PEG的濃度、融合溫度、融合時間諸方面進(jìn)行的研究。這些條件的確立的確非常重要，但卻忽略了另一個因素——PEG相對分子質(zhì)量大小對細(xì)胞融合的影響，特別是大相對分子質(zhì)量的PEG8000在細(xì)胞融合實驗中的應(yīng)用尚未見報導(dǎo)。另外，人們對pH值在細(xì)胞融合中的重要性也關(guān)注不夠,因此導(dǎo)致細(xì)胞融合率偏低。

本文從提高細(xì)胞融合率的目的出發(fā)，針對影響細(xì)胞融合的PEG相對相對分子質(zhì)量、最適pH值、細(xì)胞濃度等因素做了初步探討。

1 材 料

1.1儀器

YXQ-LS-100A立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，SW-CJ-IF 標(biāo)準(zhǔn)凈化工作臺(蘇凈集團(tuán)安泰公司制造)，PHS-30型pH計(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)，LD5-2A型低速離心機(jī)(北京雷勃爾離心機(jī)有限公司)，BS60電熱三用水箱(北京市醫(yī)療設(shè)備廠)，PL03黑晶爐(上海奔騰電器有限公司)，生物光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS BX53)等。

1.2試劑

聚乙二醇:PEG4000和PEG8000(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司，Japan分裝)，肝素(新興化學(xué)試劑研究所)，新生牛血清(北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司),RPMI1640培養(yǎng)液(GIBCO)。

1.3動物

蟾蜍(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供)，小白鼠(ICR,質(zhì)量為18～22 g)。

2 方 法

2.1細(xì)胞的準(zhǔn)備

2.1.1蟾蜍紅細(xì)胞懸液的制備[[4]

用吸有1 mL肝素的5 mL注射器，從蟾蜍主動脈弓采血。將血液用0.85%的NaCl溶液清洗2次，再用GKN液洗1次。然后，取少量經(jīng)鹽水稀釋50～100倍后，用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)。再用GKN液調(diào)整細(xì)胞至實驗所需要的濃度。

2.1.2S180細(xì)胞懸液的制備[5]

用5 mL注射器抽取在小白鼠腹腔內(nèi)培養(yǎng)1周的S180細(xì)胞，用0.9%的生理鹽水清洗3次，再用GKN液洗1次。然后，取少量經(jīng)冰醋酸計數(shù)液稀釋50～100倍后，用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)。再用GKN液調(diào)整細(xì)胞至實驗所需要的濃度。

2.2融合方法

參照文獻(xiàn)[6]中的方法，分不同細(xì)胞濃度、不同pH值和不同相對分子質(zhì)量PEG進(jìn)行細(xì)胞融合實驗。

每支離心管加1 mL事先調(diào)好濃度的細(xì)胞懸液，置37 ℃水浴中靜止10 min，棄掉上清液。用1 mL加樣器吸取1 mL不同相對分子質(zhì)量和不同pH值的PEG，逐滴加入各離心管中。邊加邊用手指輕彈試管，并控制滴加的速度(約每滴間隔4～6 s)，1～1.5 min內(nèi)加完。然后輕搖試管，使PEG與細(xì)胞充分混勻。再將試管放回37 ℃水浴箱中。靜止15 min后，立即離心(1 000 r/min，5 min),棄上清液。加5 mL GKN液，以終止反應(yīng)。再置37 ℃水浴箱5 min后，離心，棄上清液。沉淀中加0.5 mL培養(yǎng)液混勻。涂片，染色，鏡下觀察。

2.3計算融合率

用細(xì)胞計數(shù)板，按下式計算細(xì)胞融合率[5]：

2.4單因素實驗

2.4.1PEG相對分子質(zhì)量、pH值對細(xì)胞融合率的影響

實驗分A、B兩組，A組為蟾蜍紅細(xì)胞組；B組為S180細(xì)胞組。每組取10支分別裝有1 mL濃度為5×106mL-1細(xì)胞懸液的試管進(jìn)行融合試驗。具體做法是： 1～5管，分別加入pH 7.4、7.6、7.8、8.0、8.2 5種50%PEG4000。6～10管，同樣分別加入以上5種pH值的50%PEG8000。融合方法如2.2節(jié)所述。每組試驗平行做3次，3次實驗結(jié)果取平均值。

2.4.2細(xì)胞濃度對細(xì)胞融合率的影響

實驗方法如下：選擇上述實驗中融合率高的pH 8.0的50%PEG8000做細(xì)胞誘導(dǎo)劑。將其分別加入C組(5份不同濃度(1×105、5×105、5×106、2×107、1×108mL-1)的蟾蜍紅細(xì)胞懸液)和D組(5份同樣不同濃度的S180細(xì)胞懸液中)進(jìn)行融合試驗。具體操作方法如2.2節(jié)所述。每組試驗平行做3次，3次實驗結(jié)果取平均值。

3 結(jié) 果

3.1PEG相對分子質(zhì)量、pH值對細(xì)胞融合率的影響

圖1為兩種PEG中，環(huán)境pH值對細(xì)胞融合率的影響。

(a) A組(蟾蜍紅細(xì)胞)

(b) B組(S180細(xì)胞)圖1 環(huán)境pH值對融合率的影響

3.2細(xì)胞濃度對細(xì)胞融合率的影響

細(xì)胞濃度對細(xì)胞融合率的影響見圖2。

圖2 細(xì)胞濃度對細(xì)胞融合率的影響

3.3顯微成像系統(tǒng)展示實驗結(jié)果

顯微成像系統(tǒng)展示的實驗結(jié)果如圖3所示。

(a) 蟾蜍紅細(xì)胞

(b) 小鼠S180腹水瘤細(xì)胞圖3 50%PEG8000(pH8.0)介導(dǎo)的5×106 mL-1融合圖像(×400)

4 討 論

圖1、2中顯示的實驗結(jié)果表明：PEG4000與PEG8000都有促進(jìn)細(xì)胞融合的作用，但作用程度有所不同。在相同實驗條件下，PEG8000的作用超過PEG4000。這可能是由它的相對相對分子質(zhì)量大的緣故。因為PEG作用機(jī)制是：PEG具有輕微的負(fù)極性，可與具有正極性基團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成氫鍵，脫去自由水。進(jìn)而促使細(xì)胞膜發(fā)生融合[7]。PEG8000的相對分子質(zhì)量比PEG4000相對分子質(zhì)量大1倍，顯然它的單個分子的負(fù)極性也相對強(qiáng)一些，更有利于氫鍵的形成。

另外，還清楚地看到，無論是蟾蜍紅細(xì)胞還是S180細(xì)胞，它們的融合率都與pH值有關(guān)，甚至對pH值有一定依賴性。相同條件下，pH7.4以下時細(xì)胞基本不融合。pH值影響細(xì)胞融合的機(jī)制，是由于pH值的改變，引起了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的變化[8]。在pH8.0左右，細(xì)胞融合率高，這與Sharon研究結(jié)果相似[9]。可能是此時的酸堿度使膜蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變[10]，增加了膜蛋白的運(yùn)動性，導(dǎo)致兩膜脂質(zhì)分子接觸緊密流動性增強(qiáng)的緣故。但pH值過高，會對細(xì)胞有損傷。實驗證明，pH8.2時，個別細(xì)胞破裂，細(xì)胞核游離出來。因此融合率有所降低。同時，細(xì)胞狀態(tài)不太好。這與顔永杉[11]報道的病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合情況一致。

由圖2可見，細(xì)胞濃度的變化對細(xì)胞融合率有一定影響。細(xì)胞濃度在105mL-1時，細(xì)胞融合率很低。這主要原因是，細(xì)胞密度低，細(xì)胞間距離大，分子間作用力小，不利于氫鍵形成；相反，細(xì)胞濃度升到108mL-1時，細(xì)胞融合率也不是最好。原因可能是，融合細(xì)胞過密，1分子的PEG將多個細(xì)胞黏連在一起，發(fā)生多細(xì)胞融合，甚至引起細(xì)胞膜破損。只有控制細(xì)胞濃度在107mL-1左右，才能獲得大量高質(zhì)量有應(yīng)用價值的雜交細(xì)胞。

實驗結(jié)果還表明，在pH7.47時，蟾蜍紅細(xì)胞融合，而S180細(xì)胞卻不融。在其他相同實驗條件下，蟾蜍紅細(xì)胞融合率均高于S180細(xì)胞。這主要原因是不同細(xì)胞的細(xì)胞膜分子組成略有差別[12]，膜的流動性也不同所致。

本實驗中，選用了無Ca2+、Mg2+離子和低Na+的GKN緩沖系統(tǒng)，得到了較理想的實驗結(jié)果，這可能是GKN液含有的離子強(qiáng)度足以改變細(xì)胞膜的流動性。因為細(xì)胞膜外存在的膜糖，對細(xì)胞膜起保護(hù)作用[13]。使細(xì)胞融合與外加Ca2+、Mg2+關(guān)系不大。這一現(xiàn)象同王磊報道的在鹽水中融合時的融合率，高于在培養(yǎng)基中融合的融合率[14]有點類似。此外，融合液中0.8%的氯化鈉，也顯示了較低的滲透壓有利于細(xì)胞融合。這可能是由于細(xì)胞膨脹時，細(xì)胞骨架在脂質(zhì)雙層上產(chǎn)生機(jī)械拉伸，直接影響脂質(zhì)混合所致[15]。

圖3分別顯示了蟾蜍紅細(xì)胞和S180細(xì)胞自身融合細(xì)胞的形態(tài)及在50%PEG8000(pH 8.0)，細(xì)胞濃度5×106mL-1時表現(xiàn)的較高融合率。

5 結(jié) 語

用PEG4000和PEG8000作誘導(dǎo)劑，在pH7.4～8.2,和細(xì)胞濃度105～108/mL條件下，均能使S180細(xì)胞和蟾蜍紅細(xì)胞融合。且PEG8000介導(dǎo)細(xì)胞融合的融合率高于PEG4000。蟾蜍紅細(xì)胞融合率不但高于S180，還因其細(xì)胞大，核清晰，便于觀察而成為細(xì)胞融合實驗方法研究的首選細(xì)胞。GKN緩沖系統(tǒng)因其成本低，效果好，而值得選用。

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DiscussiononExperimentalMethodofImprovingCellFusionRates

HOUYuan,HUODesheng,WENDezhong

(School of Basic Medical Sciences, Jilin University, Changchun 130021, China)

Improving the rate of cell fusion is a significant premise of improving the efficiency of preparation of monoclonal antibody and production of new species, and also of improvement of the success rate of new species.This article first puts forward the method of adjusting pH value to improve the cell fusion rate by using PEG 8000 as inducer; its effect precedes PEG 4000.Different cells are used to verify and the best cell density.Using PEG 8000 as inducer and GKN buffer system and toad red blood cells as material, the fusion rate is the highest under the environment of pH8.0 cell fusion.The experiment shows the stabilization and reliability and repeatability are good, and it has the characteristics of user-friendly control and quickness and accuracy.This is a new method of cell fusion, and it can be used in experimental teaching and provide references for scientific research and production.

cell fusion; inducer; fusion rate; polyethylene glycol (PEG)

Q 813.2

A

1006-7167(2017)10-0028-03

2016-12-15

吉林省科技發(fā)展計劃項目 (20080160)

侯 元(1961-)，女，吉林長春人，高級實驗師，主要研究分子生物學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)實驗技術(shù)。Tel.：13019139561；E-mail:houyuan@jlu.edu.cn