藻藍蛋白對家兔心肌缺血-再灌注損傷的影響

楊莎莎，周 利

（十堰市太和醫院湖北醫藥學院附屬醫院，湖北 十堰 442000）

·實驗研究·

藻藍蛋白對家兔心肌缺血-再灌注損傷的影響

楊莎莎，周 利*

（十堰市太和醫院湖北醫藥學院附屬醫院，湖北 十堰 442000）

目的 研究藻藍蛋白對家兔心肌缺血-再灌注損傷模型的影響。方法 家兔60只,采用隨機數字表編號后隨機分為假手術組，缺血-再灌注組,藻藍蛋白1、2、3組,除假手術組外均建立心肌缺血-再灌注損傷模型。成模后2 h,藻藍蛋白1、2、3組用藻藍蛋白混懸液50 、200、400 mg/（kg·d）灌胃2周,假手術組和缺血-再灌注組灌等體積生理鹽水對照。采用酶聯免疫吸附測定法檢測2 周時家兔各組大鼠血清中肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）、一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）活性、內皮素-1（ET-1）、內皮型一氧化氮合酶（eNOS）及心肌組織丙二醛（MDA）;免疫組化染色檢測誘導型一氧化氮合酶（iNOS）陽性表達;反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測缺血區血管內皮生長因子（VEGF） mRNA的表達。結果 藻藍蛋白2、3組 NO 和SOD、eNOS明顯提高, iNOS陽性細胞數增多, 缺血區組織VEGF、VEGFmRNA高表達, ET-1、CK-MB和心肌MDA顯著降低,與模型組比較（P ＜ 0.05）,差異有統計學意義。結論 藻藍蛋白對家兔心肌缺血-再灌注損傷有保護作用。

家兔;藻藍蛋白;酶;缺血-再灌注損傷;血管內皮生長因子

心臟疾病的致死主因多為心肌缺血-再灌注損傷，在搶救和治療過程中，缺血區心肌在恢復血供后，由于清除自由基的抗氧化酶SOD合成障礙及氧自由基大量產生，常造成嚴重的缺血-再灌注損傷及心肌細胞不可逆損傷[1]。隨著心肌細胞凋亡、壞死及線粒體功能障礙，ET-1大量產生，NOS活性降低，最終導致血管內皮合成和釋放NO不足，造成拮抗ET-1作用減弱，血管內皮細胞完整性遭受嚴重破壞[2]。而使用SOD等自由基清除酶可減輕缺血-再灌注造成的組織損傷[3]。藻藍蛋白具有抗氧化活性、抗炎、抑制脂過氧化物生成等作用[4]。有研究發現其對腦缺血-再灌注損傷有防治作用，本實驗選用家兔心肌缺血-再灌注損傷模型，研究其對心肌缺血-再灌注損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 普通級雄性家兔60只，周齡8周，體質量(1.8±0.1) kg，采用隨機數字表編號后隨機分為假手術組，缺血-再灌注組，藻藍蛋白1、2、3組，每組12只。家兔購自湖北省實驗動物中心。

1.2 儀器與試劑 TKR-200C小動物呼吸機(上海寰熙醫療器械有限公司)；BL-420F生物機能記錄儀（成都泰盟）；藻藍蛋白（浙江賓美生物科技有限公司）；戊巴比妥鈉（德國分裝）；MDA、SOD、CK-MB測試盒（南京建成生物工程研究所）；VEGF 及VEGFmRNA測試盒（成都榮海生物試劑有限公司）

1.3 造模及治療 腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉家兔，除假手術組外，其他4組采用絲線結扎左冠狀動脈前降支缺血30 min再灌注30 min，反復缺血-再灌注的方法建立心肌缺血-再灌注損傷模型。假手術組不結扎，30 min后關閉胸腔。胸腔關閉后即行治療。藻藍蛋白1、2、3組分別用50、200、400 mg/(kg·d)藻藍蛋白混懸液灌胃2周，假手術組和缺血-再灌注組灌等體積生理鹽水對照。

1.4 檢測指標及方法 采用酶聯免疫吸附法測定CKMB 、SOD、NO 、MDA、eNOS和 ET-1。免疫組化染色檢測eNOS陽性表達細胞[5]。實時熒光PCR法檢測缺血區組織VEGFmRNA表達量。

1.5 統計學方法 采用SPSS 17.0分析軟件，數據以均數±標準差表示，多組間比較先進行方差分析，組間差異則采用兩樣本均數Dunnett檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 家兔心肌及冠狀動脈病理組織切片觀察 缺血-再灌注組肌纖維肥大、心肌纖維縱橫紋模、有溶解、斷裂及脂肪樣變性。冠狀動脈血管管壁損傷、狹窄、血管內皮有剝脫并有新生內膜、邊緣呈 “峰-谷”等典型理性血管重構現象，而假手術組均無以上病理改變，說明造模成功。藻藍蛋白2、3組家兔心肌纖維相對缺血-再灌注組縱橫紋清晰、整齊，但肌纖維間質仍有少量細胞增生、肥大。冠狀動脈管腔增大、血管無內皮剝脫、邊緣無“峰-谷”現象，新生內膜較缺血-再灌注組減少82%，病理性血管重構現象明顯好轉。

2.2 對家兔eNOS、NO、ET-1的影響 見表1。

2.3 對家兔心肌細胞中iNOS表達的影響 見表2。

表1 家兔eNOS、NO、ET-1水平比較（x± s,n = 12）

表2 家兔心肌細胞中i NOS陽性細胞數比較（x± s ，n = 12） 個/100

2.4 藻藍蛋白對家兔酶等相關生化指標的影響 見 表3。

表3 家兔SOD、MDA、CK-MK水平比較（x± s,n = 12）

2.5 藻藍蛋白對家兔心肌血管內皮生長因子表達的影響 見表4。

表4 家兔VEGF和VEGFmRNA表達比較（x± s,n = 12）

3 討論

本實驗病理觀察發現，藻藍蛋白2、3組較缺血-再灌注組病理性血管重構現象明顯好轉，NO 、SOD和eNOS明顯提高，iNOS陽性細胞數增多，冠狀動脈VEGF、VEGFmRNA高表達， ET-1、CK-MB和心肌MDA顯著降低，提示藻藍蛋白具有心肌缺血-再灌注損傷的保護作用。

NO是一種血管內皮功能調節因子，iNOS 和eNOS為NO限速酶，兩者均主要在心肌細胞和血管內皮細胞中表達，故其活性的改變將影響NO的生成，對血管內皮功能具有調節作用[6-8]。藻藍蛋白可能通過提高eNOS和iNOS來調節NO的生成，增加NO合成有利于減輕血管內皮損傷。SOD是清除脂質過氧化產物MDA的重要的酶，CK-MB在心肌缺血梗死可反映心肌缺血的嚴重程度[9]。藻藍蛋白2、3組SOD明顯提高，提示藻藍蛋白具有肯定的清除自由基、抑制脂質過氧化反應產物MDA 及細胞壞死產物CK-MB的作用，MDA降低是藻藍蛋白提高SOD活性的直接結果。ET-1對于維持血管正常結構具有重要作用，其降低有利于維持缺血心肌和血管的正常結構，減輕缺血-再灌注血管病理性重塑，VEGF可促進血管內皮細胞分化增殖，促進血管新生[10-12]。藻藍蛋白2、3組ET-1顯著降低，VEGF、VEGFmRNA高表達，提示藻藍蛋白具有降低ET-1、促使VEGF的調節通路開放，使缺血區大量血管新生，這有利于提高缺血區血供，減輕心肌缺血-再灌注損傷。

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Effects of phycocyanin on myocardial ischemia reperfusion injury in rabbits

YANG Shasha, ZHOU Li*
（Department of Nephrology, Taihe Hospital, Hubei University of Medical, Shiyan 442000, Hubei Province, China)

Objective To investigate the effect of phycocyanin on myocardial ischemia-reperfusion injury in rabbits. Methods 60 rabbits were randomly numbered and divided into sham operation group, ischemia reperfusion group and phycocyanin groups1,2,3, myocardial ischemia-reperfusion injury models were established in rabbits except the sham operation group. After modeling for 2 h, the three phycocyanin groups were treated by different dose of phycocyanin suspension of 50, 200, 400 mg/ (kg·d) by gavage for 2 weeks; the sham operation group and ischemia reperfusion group were given the same volume of saline as control. The ELISA assay was used to test the level of MB isoenzyme of CK (CK-MB), nitric oxide (NO), superoxide dismutase (SOD) activity, endothelin -1 (ET-1), endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and malondialdehyde (MDA) in rabbit serum; the positive expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) was detected by the immunohistochemical staining; reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to detect the mRNA expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in ischemic regions. Results In the phycocyanin group 2 and group 3, the expression level of NO, SOD and eNOS signif i cantly increased, and the number of iNOS positive cells also increased; in the ischemic tissues, the high expressions of VEGF can be detected, but the expression level of ET-1, CK-MB and MDA signif i cantly decreased compared with the modelgroup (P＜0.05), the difference was statistically signif i cant. Conclusion The phycocyanin has protective effects on myocardial ischemia reperfusion injury in rabbits.

rabbit; phycocyanin; enzyme; ischemia-reperfusion injury; vascular endothelial growth factor

R285.5

A

2095-6258(2017)06-0868-03

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.06.003

湖北省科技廳資助項目（15Y29）。

楊莎莎（1984 -）,女,大學本科,主要從事腎病研究。

*通信作者：周 利,女, 電話 - 18772853929,電子信箱 - yssyangsasajob@126.com

2017-03-07）