苦瓜總皂苷對阿霉素腎病大鼠P-GSK-3β表達(dá)的影響

王 玲，吳秋楓

（武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院中醫(yī)科,武漢 430064）

苦瓜總皂苷對阿霉素腎病大鼠P-GSK-3β表達(dá)的影響

王 玲，吳秋楓*

（武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院中醫(yī)科,武漢 430064）

目的 分析苦瓜總皂苷對阿霉素腎病大鼠磷酸化糖原合成酶激酶-3β（P-GSK-3β）表達(dá)的影響。方法 50只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、苦瓜總皂苷低、中、高治療組,造模成功后給予8周治療后處死大鼠,觀察腎臟病理學(xué),腎功能及P-GSK-3β的表達(dá)。結(jié)果 與空白組相比,模型組12 h蛋白定量、BUN、Scr、TG和CHO增加（p＜0.05）,苦瓜總皂苷治療組相較于模型組下降（p＜0.05）;與空白組相比,模型組TP、ALB、Bax和Bcl-2降低（p＜0.05）,苦瓜總皂苷治療組相較于模型組升高（p＜0.05）;組織病理學(xué)檢測,空白組腎臟無異常,模型組上皮細(xì)胞明顯變性,苦瓜總皂苷治療后明顯改善;與空白組相比,模型組P-GSK-3β大量表達(dá)（p＜0.05）,苦瓜總皂苷治療組相較于模型組明顯降低（p＜0.05）。結(jié)論 苦瓜總皂苷可改善阿霉素腎病大鼠腎功能,與其可降低腎臟P-GSK-3β表達(dá)有關(guān)。

苦瓜總皂苷;阿霉素腎病;磷酸化糖原合成酶激酶-3β

腎病綜合征是臨床中常見的一種疾病，臨床主要表現(xiàn)為大量蛋白尿、高脂血癥及低蛋白血癥等，本病在發(fā)生后危害極大，因此關(guān)于本病藥物開發(fā)受到了眾多學(xué)者的關(guān)注[1-2]。臨床中本病的治療主要有激素療法、激素和細(xì)胞毒藥相結(jié)合以及免疫抑制劑療法等[3-4]，不可否認(rèn)，采用上述方法治療周期長、同時(shí)患者容易產(chǎn)生耐藥性，因此需積極開發(fā)本病的救治藥物。苦瓜總皂苷是近年來研究較為廣泛的藥物，其在糖尿病、腎病等多種疾病中都有一定的治療作用[5-7]。本次研究采用苦瓜總皂苷治療本病，旨為今后苦瓜總皂苷的開發(fā)和本病的治療提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料 選取雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量160～180 g，購于湖北中醫(yī)藥高等專科學(xué)校實(shí)驗(yàn)動物中心 SCXK（鄂）2014-0017。TP、SCr、BUN、Alb、TG和CHO試劑盒購于南京建成生物；Bax和Bcl-2試劑盒購于上海恪敏生物科技；P-GSK-3β抗體和ECl化學(xué)發(fā)光試劑盒購于美國Santa，二抗購于中山金橋，引物購于上海生物生工。

1.2 方法 50只大鼠隨機(jī)分為空白組、阿霉素腎病組（模型組）、苦瓜總皂苷低、中和高劑量治療組，每組10只。阿霉素腎病大鼠模型的構(gòu)建參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。治療時(shí)苦瓜總皂苷低、中、高劑量組分別給藥10、20、40 mg/kg苦瓜總皂苷，空白組和模型組則給予1 mL生理鹽水灌胃，治療8周后處死大鼠，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 標(biāo)本收集 1）12 h尿和血標(biāo)本：于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9周后對大鼠12 h尿液收集標(biāo)本后置于EP管。大鼠麻醉后，暴露心臟用注射器抽取即可，后置于離心機(jī)中3 000 r/min離心，取上清液保存?zhèn)溆谩?）腎臟標(biāo)本：血液收集后摘取雙側(cè)腎臟，統(tǒng)一切取左腎一半置于4%多聚甲醛中用于組織學(xué)檢測，其余置于超低溫冰箱中保存。

1.4 觀測指標(biāo)及方法 1）一般情況：在整個(gè)造模和治療過程中對飲食量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，密切監(jiān)視其精神狀態(tài)，大小便等。根據(jù)公式：12 h尿蛋白排泄量（rag）=12 h尿蛋白濃度（mg/mL）×12 h尿量（mL）計(jì)算。2）血清生化指標(biāo)：TP、SCr、BUN、Alb、TG和CHO等檢測儀器為分光光度計(jì)，腎臟組織中Bax和Bcl-2檢測檢測儀器為酶標(biāo)儀。3）HE染色：HE染色參照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行。4）蛋白表達(dá)：將100 mg腎臟組織置于1 mL總蛋白提取液中，攆磨后提取上清液定量調(diào)平，每組各取40 μg進(jìn)行凝膠電泳后半干轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶密封2 h后洗滌3次，加入1抗過夜洗滌3次后加入2抗密封2 h，ECL發(fā)光顯色，完成后掃描圖像，Image J計(jì)算灰度值。3）半定量PCR：取30 mg腎臟組織提取總RNA，提取后定量調(diào)平逆轉(zhuǎn)錄，擴(kuò)增（95 ℃5 min，94 ℃變性60 s，65 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min）。完成后，取5 μL電泳，最后收集圖像， image J計(jì)算灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件為SPSS 20.0，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用Pearson相關(guān)分析，檢驗(yàn)水平P= 0.05。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀況 空白組大鼠精神佳，飲食正常，模型組出現(xiàn)不同程度的動作遲滯、精神萎靡、飲食下降；治療2周后，3個(gè)治療組明顯好轉(zhuǎn)。

2.2 12 h尿蛋白定量結(jié)果 由表1可明顯看出，空白組12 h蛋白定量較低，其余4組第2周開始明顯高于空白組，模型組一直呈明顯增加，3個(gè)治療組4周后明顯下降。

表1 各組別大鼠12 h尿蛋白排泄量比較（x± s ，n = 10）

2.3 生化檢測結(jié)果 見表2。

表2 大鼠腎功能檢測比較（x± s ，n = 10）

2.4 Bax和Bcl-2的測試結(jié)果 見表3。

表3 大鼠腎臟組織Bax和Bcl-2測試結(jié)果（x± s ，n = 10） ng/L

2.5 病理染色觀察 HE染色空白組大鼠腎臟無異常，而模型組則上皮細(xì)胞發(fā)生明顯變性，同時(shí)有輕微間質(zhì)纖維化，苦瓜總皂苷治療后，有明顯的改善，且改善趨勢隨著藥物濃度的增加更為明顯。

2.6 Western bloting和半定量PCR檢測 Western bloting和半定量PCR檢測呈現(xiàn)出基本一致的結(jié)果，空白組P-GSK-3β蛋白和mRNA較少，而模型組則明顯呈現(xiàn)出高表達(dá)，苦瓜總皂苷治療后，相較于模型組，其表達(dá)量明顯降低，且隨著給藥劑量的增加，其表達(dá)呈明顯的劑量依賴性。見表4。

表4 大鼠心肌組織中P-GSK-3β蛋白和mRNA相對表達(dá)（x± s ，n = 10）

3 討論

苦瓜是人們非常喜愛的一種蔬菜。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究[10]發(fā)現(xiàn)，苦瓜具有很好的降糖療效，甚至優(yōu)于目前常用的降糖藥物甲糖寧，許多學(xué)者[11-13]均采用苦瓜提取物研究降糖作用，且收到了較好的效果。苦瓜總皂苷是目前基礎(chǔ)研究中研究較多的苦瓜提取物，已有研究[14]發(fā)現(xiàn)，苦瓜總皂苷除具有降低血糖外，還具有明顯保護(hù)肝臟和腎臟作用，另外，利尿效果也非常好。本次研究筆者使用苦瓜總皂苷治療阿霉素腎病大鼠，研究發(fā)現(xiàn)，苦瓜總皂苷對其12 h尿蛋白水平具有明顯的降低作用，但是降低作用和空白組差異較大，此外結(jié)合苦瓜總皂苷具有一定的改善腎功能的作用，提示苦瓜總皂苷對阿霉素腎病大鼠具有一定的保護(hù)作用，但并不能專一治療本病。

糖原合成酶激酶-3（GSK-3）是在進(jìn)化中非常保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，其普遍存在于真核細(xì)胞[16]。一般而言，GSK-3并不發(fā)揮作用，但當(dāng)其受到磷酸化反應(yīng)，變成磷酸化糖原合成酶激酶-3β（P-GSK-3β） 后，則可發(fā)揮作用，主要為調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖以及凋亡等，特別是其對凋亡的控制作用，目前已經(jīng)受到了眾多學(xué)者的研究[16-17]關(guān)注。Bax和Bcl-2是細(xì)胞凋亡的2個(gè)關(guān)鍵蛋白，二者直接決定腎臟細(xì)胞的凋亡，其中Bcl-2主要在線粒體外膜分布，其與Bax結(jié)合后可達(dá)到抗凋亡[18-19]。本次研究發(fā)現(xiàn)，使用苦瓜總皂苷治療阿霉素腎病大鼠，可明顯降低Bax、提高Bcl-2表達(dá)，提示苦瓜總皂苷具有很好的抗腎臟凋亡作用，分析其機(jī)理，可能與其能降低腎臟中P-GSK-3β的表達(dá)有關(guān)。

綜合提示，苦瓜總皂苷可改善阿霉素腎病大鼠腎功能，這與其可降低腎臟P-GSK-3β表達(dá)有關(guān)。

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Effects of momordicosides to P-GSK-3β in rats with adriamycin nephropathy

WANG Ling, WU Qiufeng*
( Department of Traditional Chinese Medicine, Tianyou Hospital, Wuhan University of Science and Technology,Wuhan 430064, China )

Objective To study the effect of momordicosides to P-GSK-3β in rats with adriamycin nephropathy.Methods 50 SD rats were randomly divided into blank group, model group, low, middle and high momordicosides dose treatment group, after built model, renal pathology, renal function and P-GSK-3β were detected.Results Compared with the blank group, the quantitative of 12 h protein, BUN, Scr, TG and CHO in the model group were signif i cantly higher (p＜0.05), above mentioned indicators were lowed in momordicosides group compared with the model group (p＜0.05). Compared with the blank group, the levels of TP, ALB, Bax, and Bcl-2 were signif i cantly low (p＜0.05), compared with the model group, they were higher in momordicosides treatment group(p＜0.05). Histopathological can be seen, there is no abnormality in the blank group, the epithelial cells were obviously denatured in the model group, after using momordicosides, it was signif i cantly improved. Compared with the blank group, the expression of P-GSK-3β was significantly lower in the model group than in the model group (p＜0.05), the momordicosides was significantly improved compared with the model group (p＜0.05).Conclusion Momordicosides can improve the renal function of rats with adriamycin nephropathy, which may be related with it can decrease the expression of P-GSK-3β.

momordicosides; adriamycin nephropathy; P-GSK-3β

R915

A

2095-6258(2017)06-0871-04

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.06.004

湖北省科技廳創(chuàng)新項(xiàng)目（2015CFC187）。

王 玲（1982 -）,女,主要從事中醫(yī)基礎(chǔ)與臨床研究。

*通信作者：吳秋楓,女,主任醫(yī)師,電話 - 13638642330，電子信箱 - hb70521@126.com

2017-02-17）