紫柏凝膠抑制宮頸癌Siha細胞增殖和誘導凋亡的實驗研究

溫利娟，李 婭，薛曉鷗

（ 北京中醫藥大學東直門醫院，北京 100700）

紫柏凝膠抑制宮頸癌Siha細胞增殖和誘導凋亡的實驗研究

溫利娟，李 婭，薛曉鷗*

（ 北京中醫藥大學東直門醫院，北京 100700）

目的 研究紫柏凝膠對HPV陽性宮頸癌細胞Siha的增殖抑制和凋亡誘導作用。方法 選取對數生長期Siha細胞，采用不同濃度（15、7.5、3.25 mg/mL）組，不加藥物Siha細胞為對照組。MTS檢測細胞生長抑制，臺盼藍染色檢測細胞 存活率， HOECHST 33342/PI染色法檢測凋亡細胞形態學改變。 結果 MTS法檢測，各組紫柏凝膠對Siha細胞的生長均有不同程度的抑制作用，3.125 mg/mL劑量組與空白組相比有統計學意義（p＜0.05），IC50為（15±2.1） mg/mL；臺盼藍染色，紫柏凝膠對Siha細胞生長有一定抑制作用，各濃度組細胞生長抑制率均高于對照組（p＜0.05）；紫柏凝膠作用Siha細胞后細胞間質變松，細胞質顆粒增多，染色質凝聚，分塊，胞質濃縮； HOECHST 33342/PI染色，熒光顯微鏡下觀察到紫柏凝膠引起細胞發生凋亡。結論 紫柏凝膠能抑制宮頸癌Siha細胞的增殖和誘導其凋亡。

紫柏凝膠；Siha；細胞增殖；細胞凋亡；MTS

紫柏凝膠主要由紫草、黃柏、莪術、金銀花、苦參、 百部、白及等藥物組成。全方具有清熱祛濕、解毒活血、殺蟲止癢、斂瘡生肌之功。藥物治療后熱得退、濕得除、瘀得化、毒得清，自然帶下自止，流血自止，創面收斂愈合，陰癢腹痛等諸癥緩解。該方由我院名老中醫郭志強教授，運用中醫“治病當治未病”的理論精髓創立，該方經過前期部分臨床觀察，用于治療宮頸高危型HPV（HR-HPV）感染，療效甚佳[1-10]，但該方的具體作用機理尚不十分明確，值得運用現代化手段去深入研究。本實驗通過MTS、細胞形態觀察、臺盼藍染色及Hoechst 33342染色，觀察紫柏凝膠對HPV陽性宮頸癌Siha細胞增殖和凋亡誘導作用，為抗 HPV感染進而預防宮頸癌的藥物研發提供研究基礎。

1 材料

1.1 藥材與試劑 紫柏凝膠由本實驗室萃取（莪術加8倍量水浸泡后水蒸氣蒸餾提取，揮發油與冰片用β-環糊精包合，莪術藥渣與金銀花、白及加8倍量水煎煮2次，過濾，濾液減壓濃縮至相對密度為1.10～1.15清膏。紫草、黃柏、苦參、百部、兒茶等5味藥加入80%乙醇回流提取2次，提取液，過濾，濾液濃縮至相對密度為1.10～1.15（60～65 ℃）清膏。合并所有上述清膏，噴霧干燥，得干膏粉。

1.2 細胞株與試劑 人宮頸癌細胞Siha購自（上海復祥生物科技有限公司）；DMEM購自（gibco公司）；胰酶購自（gibco公司）；雙抗購自（gibco公司）；胎牛血清購自（ExCell Bio公司）；MTS購自（Promega），Hoechst 33342/PI（碧天云）。

1.3 儀器 酶標儀（Thermo公司）；細胞培養箱（Thermo公司）；倒置顯微鏡（Nikon）；生物潔凈使用超凈臺（Opti MAIR）；低速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）。

2 方法

2.1 藥液的配置 本實驗分為3個不同濃度的紫柏凝膠組，空白組，共4組。分別用精密移液器將紫柏凝膠提取液，用DMEM培養液稀釋25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0.781 25、0.406 25 mg/mL，空白組不用藥。

2.2 細胞生長抑制實驗 采用MTS法檢測。選取對數生長期的HPV陽性宮頸癌Siha細胞，調整其細胞濃度為1×105個/mL，每孔100 μL，分別接種于96孔板中培養。培養24 h后加入不同濃度的紫柏凝膠提取液，以不加藥物孔為對照組，繼續培養24、48、72 h。檢測前，用1 mL移液槍將含藥培養液吸出，1 mLPBS液洗2次，后加入MTS:DMEM = 1:4混合液1 mL，繼續將細胞放置37 ℃培養箱中孵育2 h。用酶標儀測定每孔的吸光度（A），檢測波長為570 nm。抑制率（%）=（1 － 藥液組 /空白組）×100%[11]。

2.3 對細胞形態的影響 選取對數生長期的HPV 陽性宮頸癌Siha細胞，調整期細胞濃度為3 ×105個/mL，每孔200 μL，分別接種于6孔板中。培養24 h后分別加不同濃度的紫柏凝膠藥液，每孔200 μL繼續培養。分別于加藥后24 h用光學顯微鏡進行觀察。

2.4 臺盼藍檢測細胞存活率 Siha細胞貼壁生長于60 mm培養皿中，用高、中、低濃度紫柏凝膠作用于Siha細胞24 h，并設立空白對照組，空白對照組不用藥。用精密移液器將細胞培養液及藥物吸出，PBSmL洗細胞2次，用含25% EDTA胰酶消化Siha細胞，把收集的細胞放在15 mL離心管中 以1 000 r/min離心5 min，棄上清，用1 mL細胞重懸液重新懸起細胞。吸取100 μL重懸的細胞到0.6 mL EP管內，加入100 μL1%臺盼藍染色液（2×），輕輕混勻，染色3 min。 吸取少量經過染色的細胞，用紅細胞計數板計數。數出藍色細胞和細胞總數。細胞存活率=（細胞總數－藍色細胞數）/細胞總數×100%[11]。

2.5 Hoechst 33342雙熒光染色法觀察凋亡細胞的形態表現 Hoechst 33342/PI 雙 染 檢 測 細 胞 凋 亡，活細胞不發熒光或發弱藍色熒光；早期凋亡細胞發出較明亮的藍色熒光；晚期凋亡細胞及死亡細胞發明亮的藍色熒光及紅色熒光[12-17]。高、中、低濃度（濃度分別為15、7.5 、3.25 mg/mL）紫柏凝膠分別作用于HPV 陽性宮頸癌Siha細胞24 h后，離心收集并稀釋為細胞懸液5×104，加入 Hoechst33342 0.5 mL，PI 0.5 mL，4 ℃繼續孵育30 min，制作臨時裝片，置于熒光顯微鏡下觀察。

3 結果

3.1 細胞生長抑制實驗 見表1。

由表1所示，不同濃度紫柏凝膠對HPV陽性宮頸癌Siha細胞的生長均有不同程度的抑制作用，3.125 mg/mL劑量組與空白組相比均有顯著差異（P＜0.05），并呈劑量依賴關；各個濃度組對細胞的抑制率為紫柏凝膠作用時間48 h是最高，并計算紫柏凝膠作用于宮頸癌Siha細胞IC50為（15±2.1） mg/mL。

3.2 對細胞形態的影響 倒置顯微鏡下觀察，空白對照組Siha細胞貼壁生長，細胞伸張，扁平狀，細胞質均勻透明，細胞核內一般有1～ 4個核仁，細胞核及細胞膜輪廓明顯，細胞間結構連接緊密，生長旺盛。而紫柏凝膠高中低3個濃度組作用后，細胞間質變松，細胞質顆粒增多，染色質凝聚，分塊，胞質濃縮（見圖1）。

3.3 各組細胞存活率比較 臺盼藍染色結果，對照組細胞透明無染色，死亡細胞呈藍染，各組濃度紫柏凝膠對Siha細胞生長均有一定影響，見表2。

3.4 Hoechst 33342/PI染色觀察凋亡細胞形態 經過Hoechst 33342/PI染色后，熒光顯微鏡下見凋亡細胞形態不規則，早期凋亡細胞發出較明亮的藍色熒光，部分凋亡細胞碎裂呈點狀，大小不一，出現明顯的凋亡細胞形態。見圖2。

表2 高中低濃度作用于Siha細胞存活率（x± s ）

圖2 Hoechst 33342/PI染色觀察凋亡細胞形態

4 討論

本實驗通過臺盼藍和MTS實驗觀察紫柏凝膠對HPV陽性宮頸癌細胞增殖的抑制作用，得到其IC50為（15±2.1）mg/mL，提示紫柏凝膠對宮頸癌Siha細胞具有殺傷作用。宮頸癌Siha細胞經過15、7.5、3.25 mg/mL濃度紫柏凝膠作用后，經Hoechst 33342/PI染色后細胞出現細胞核碎裂，染色質濃縮和細胞形態不規則等明顯的早期細胞凋亡狀態，藥物作用后的細胞存活率由明顯下降，但紫柏凝膠對于宮頸HPV陽性Siha細胞的具體作用機制尚需要進一步研究。

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Effect of Zibai gel on Siha cells proliferation inhibition and induction of apoptosis

WEN Lijuan, LI Ya, XUE Xiao’ou*
(Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China)

Objective To study the Zibai gel on proliferation inhibition and apoptosis of HPV positive Siha cells.Methods Siha cells in logarithmic growth phase were selected, divided into different concentrations groups (15, 7.5,3.25 mg/mL) of Siha cells, and Siha cells without medicine was used as control group. Cell growth inhibition was detected by MTS. Trypan blue staining was used to detect cell survival rate. Acridine orange / ethidium bromide(HOECHST 33342) staining method was used to detect the changes of apoptosis. Results MTS assay: The inhibitory effect of each group “Zibai gel” on Siha cell growth were different, the 3.125 mg/L dose group was statistically signif i cant compared with the control group (p＜0.05), IC50 (15±2.1) mg/mL; trypan blue staining: Zibai gel has a certain inhibitory effect on the growth of Siha cells, the inhibition rate of cell growth in each concentration group was higher than that in control group (p＜0.05); action of Zibai gel on Siha cells leads to a qualitative change between cells, loosening of cytoplasm, increase of cytoplasmic granules, condensation of chromatin and fragmentation of cytoplasm; HOECHST 33342/PI staining: the apoptosis of the cells was observed by fluorescence microscope.Conclusion Zibai gel can inhibit cervical cancer Siha cell proliferation and induce apoptosis.

Zibai gel; Siha; cell proliferation; apoptosis; MTS

R285.5

A

2095-6258(2017)06-0883-04

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.06.008

G20工程支撐保障 “十病十藥研發——紫柏凝膠用于治療宮頸HR-HPV感染的研究與開發”（Z151100003815084）。

溫利娟（1983 - ），女,博士研究生,主要從事婦科內分泌和腫瘤研究。

*通信作者：薛曉鷗,女,博士研究生導師,電話 - 13910430076,電子信箱 - pro_xue@163.com

2017-02-20）