“御敵于國門之外”
——病毒入侵抑制劑的研究進展

姜世勃 蘇 珊 夏 帥 鄒 鵬 陸 路

(復旦大學基礎醫學院病原生物系,復旦大學醫學分子病毒學教育部/衛計委重點實驗室 上海 200032)

專家簡介姜世勃,教授,博導,國家 “千人計劃” 特聘專家,復旦大學病原微生物研究所所長。畢業于第一和第四軍醫大學并獲得碩士和博士學位,1987—1990年在美國紐約洛克菲勒大學進修學習和博士后訓練,1990—2010年在紐約血液中心LFK研究所先后擔任助理研究員、副研究員、研究員和研究室主任。曾是武漢大學、復旦大學、廣州第一軍醫大學、西安第四軍醫大學、中國軍事醫學科學院客座教授,中國科學院海外評審專家、清華大學高級訪問學者、上海計劃生育研究所特聘顧問、南方醫科大學抗病毒中心榮譽主任和特聘教授。2010年10月入選國家 “千人計劃” ,回國擔任復旦大學上海醫學院醫學分子病毒學教育部/衛生部重點實驗室教授。

從事抗病毒 (HIV、SARS-CoV、MERS-CoV、RSV、HPV、流感病毒、埃博拉病毒、寨卡病毒等) 藥物及疫苗研究多年,是國際上最早參與研發預防HIV性傳播“殺微生物劑”的研究人員之一。20世紀90年代初發現了第一個抗HIV的C-多肽,發明專利轉讓給美國Trimeris和羅氏制藥公司,用于開發國際上第一個抗HIV多肽藥物——恩夫韋肽 (Enfuvirtide,又名T20)。該發現開辟了研發病毒融合/入侵抑制劑和抗病毒多肽藥物的全新領域。在此基礎上,帶領團隊又先后發現了抗SARS-CoV、MERS-CoV和寨卡病毒的多肽,并研發出最為安全、有效的SARS和MERS候選亞單位疫苗。最近,又在中國成功開發上市一個可防控HPV感染、降低宮頸癌發生率的JB01生物蛋白,現已在全國500多家三甲醫院使用,年銷售量2～3億元人民幣。

已發表385篇SCI論文和117篇非SCI論文,累計影響因子1 881 (篇均4.9),其中包括Nature、NatMed、NatCommun、NatRevMicrobiol、Lancet、Cell、JExpMed、ProcNatlAcadSciUSA等,被引用11 000多次,h指數57。已申請美國專利32項 (授權21項) 和中國及PCT專利37項 (授權7項),作為PI獲得美國NIH研究基金項目9項2 000多萬美元、中國國家和省部級研究基金項目9項2 000多萬元人民幣,在30多個國家作學術報告200多場。

國際抗病毒研究學會、國際艾滋病學會、美國微生物學會、美洲華人生物科學學會會員,國際頂尖醫學雜志TheLancet編輯顧問 (editorial consultant),PLoSOne科學編輯,EmergMicrobInfect、Retrovirology、PLoSOne、BiochimBiophysActa、MicrobInfect雜志編委,為60多家英文雜志 (如Science、SciTransMed、NatMed、Lancet等) 審稿,美國健康研究院 (NIH)、香港研究資助局 (RGC)、中國自然科學基金會 (NSFC)、加拿大健康研究院 (CIHR)、新加坡科學技術研究局 (A*STAR) 評審委員。

上海醫學院創建90周年寄語先驅湯飛凡,后任林飛卿;勇者聞玉梅,滅毒為人民;主任袁正宏,帶隊向前進;分子病毒室,日漸更興盛;本人受感召,歸國為使命;入侵抑制劑,突破加創新;御敵國門外,抗擊傳染病。

“御敵于國門之外”
——病毒入侵抑制劑的研究進展

姜世勃△蘇 珊 夏 帥 鄒 鵬 陸 路

(復旦大學基礎醫學院病原生物系,復旦大學醫學分子病毒學教育部/衛計委重點實驗室 上海 200032)

25年前,我們在國際上開辟了研發人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)融合/入侵抑制劑和抗HIV多肽藥物的全新領域。近6年來,我們在HIV、中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)、埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)和寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)入侵抑制劑的研發工作中取得了一系列重要研究成果。本文概要性地綜述了相關高致病性病毒入侵抑制劑的研究進展。

高致病性病毒; 病毒入侵抑制劑; 病毒滅活劑

病毒是一類只能在有機體活細胞內完成自身復制的病原微生物。由于病毒不具有完整的細胞結構,無法通過自體的分裂來完成自身增殖,所以其只能寄生在宿主細胞內利用宿主細胞的代謝系統來完成自身的擴增。所以病毒的完整生命周期包括進入宿主細胞并完成復制的整個過程,大致分為如下步驟:附著 → 入侵 → 脫殼 → 合成 → 組裝 →釋放。

現有的主要抗病毒藥物作用在病毒生命周期的各個階段。其中,入侵抑制劑作用在較早的病毒黏附及入侵階段,也稱為進入抑制劑(entry inhibitor)。病毒通過特異性結合靶細胞表面的受體附著到宿主細胞表面,然后通過受體介導的內吞或者膜融合途徑進入靶細胞(圖1)。相應的,入侵抑制劑主要分為黏附抑制劑(attachment inhibitors),受體/共受體拮抗劑(receptor/coreceptor antagonists),融合抑制劑(fusion inhibitors)和病毒滅活劑(virus inactivators),分別阻斷病毒與宿主靶細胞的黏附,與受體/共受體的結合,與靶細胞膜融合,及在細胞外滅活病毒。病毒除了通過靶細胞膜進入靶細胞內復制,也能通過感染細胞傳遞到相鄰的未感染細胞,該途徑同樣由病毒包膜蛋白介導,所以入侵抑制劑也能阻斷這一傳播途徑,在這個方面相較于其他抗病毒藥物有明顯優勢。入侵抑制劑包括多肽,抗體,修飾蛋白及化學小分子,各有其優勢和缺點。

A:Virus enters the target cell by receptor-mediated endosomal membrane fusion;B:Virus enters target cell by receptor-mediated plasma membrane fusion.

圖1病毒進入靶細胞過程
Fig1Entryprocessofavirus

與其他入侵抑制劑的作用機制不同,病毒滅活劑可直接作用于人體內游離的病毒顆粒,使病毒包膜蛋白發生構象變化,使得病毒喪失感染靶細胞的能力;或者直接破壞病毒膜的完整性,導致病毒基因組釋放,失去活性。

由于病毒滅活劑能直接地滅活游離病毒顆粒,而其他入侵抑制劑能阻斷病毒進入細胞,它們均能保護細胞不受病毒感染。其相較于其他必須進入宿主細胞內抑制病毒復制的抗病毒藥物而言,能更好地保護宿主細胞的功能以及活性,避免病毒進入細胞后整合到人類基因組,并減少對細胞的毒性作用。所以,如果能夠開發出抗病毒活性強,成藥性好的病毒入侵抑制劑,將能夠更有效地防控病毒對宿主細胞的感染,真正做到“拒敵于國門之外”。

人類免疫缺陷病毒(HIV)入侵抑制劑和滅活劑人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)是包含兩條相同正鏈RNA的逆轉錄病毒,通過其包膜蛋白介導的膜融合進入宿主細胞內。該過程中,HIV包膜蛋白亞單位gp120首先與靶細胞上的受體及共受體反應,導致 gp41亞單位暴露。暴露后的gp41 N末端的融合多肽(FP)插入靶細胞膜,其N端七重復螺旋序列(N-terminal heptad repeats,NHR)和C端七重復螺旋序列(C-terminal heptad repeats,CHR)相互反應,形成發夾樣六聚體結構(six helix bundle,6-HB)[1],拉近病毒與靶細胞發生膜融合。HIV入侵抑制劑即作用在這個階段,現在美國食品藥品管理局(FDA)已批準上市的HIV入侵抑制劑包括融合抑制劑——恩夫韋肽(enfuvirtide,又叫T20)和CCR5拮抗劑——馬拉維若(maroviroc)。其中,T20能與gp41的NHR區結合,阻斷6-HB的形成,抑制HIV與靶細胞的膜融合進程(圖2)。

Binding of the HIV-1 gp120 to the receptor and co-receptor triggers the exposure of gp41.An HIV-1 fusion inhibitor can binds to the exposed gp41 to block the 6-HB formation,thus inhibiting HIV-1 entry into the target cell.

圖2HIV-1融合抑制劑作用機制
Fig2MechanismofactionofHIVfusioninhibitors

多肽類藥物 1990年初,姜世勃及同事在國際上首次發現來源于HIV-1 gp41蛋白CHR結構域的多肽(C-多肽)-- SJ-2176能有效抑制HIV感染[2-3],其發明專利(USP5,444,044)轉讓給美國Trimeris藥物公司,該公司與羅氏制藥公司合作,開發出國際上第一個能抑制HIV進入靶細胞的多肽藥物T20。該藥物被譽為是艾滋病藥物研究史上的一個里程碑,其出現開創了國際病毒入侵抑制劑和抗病毒多肽藥物的新領域。T20在臨床治療上表現出了較好的效果,特別是對于逆轉錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑產生抗性的艾滋病患者,具有顯著的療效。但由于T20半衰期較短,活性較低,需每日皮下注射兩次,導致注射局部反應重及費用高。而且,T20在臨床使用久了以后易誘導HIV耐藥毒株的產生。因此,對T20藥物的改造及新型同類藥物的設計成為該領域研究的主要方向。我們團隊在該方面也做了大量的工作,發現了多種更高效和更長效的多肽類HIV入侵抑制劑。

首先,為了改造T20,使其活性提升,我們對T20的作用機制開展了更深入的研究。我們發現T20與大部分C多肽不同,它需要借助脂質結合結構域(lipid binding domain,LBD)與細胞膜作用后才能有效結合到gp41的NHR區,進而阻斷6-HB形成和抑制病毒與細胞膜的融合[4]。而其他C-多肽(如C34)不含有LBD,但含有可與NHR上的口袋形成區(pocket forming domain,PFD)密切結合的口袋結合區(pocket binding domain,PBD),所以這些C-多肽可以直接與NHR結合形成更穩定的6-HB,更有效地阻止病毒6-HB的形成,從而擁有比T20更好的抑制活性[5]。因此,我們將注意力更加聚焦于包含有PBD的C-多肽的研究上。

基于C34序列,引入更多帶電荷的氨基酸殘基來穩定螺旋結構而設計出的西夫韋肽(Sifuvirtide)比T20具有更強的抗抗HIV活性,且對T20抗性株也有顯著的抑制效果[6]。該藥物目前已在國內通過了臨床I期和II期試驗。同時,我們還發現包含了C34上游(621-627:QIWNNMT)序列的CP621-652多肽擁有更好的抗HIV感染的活性[7]。進一步引入增加其α螺旋性的E-K鹽橋突變后,得到的CP32M多肽具有低納摩爾級別的抑制HIV融合和進入靶細胞的活性[8]。

進一步分析QIWNNMT序列與NHR的反應,何玉先等發現(626)MT(627)序列能形成鉤狀結構,將該M-T鉤子加到C-多肽的N末端后,可有效地提高這些C-多肽的HIV抑制活性[9-10]。最近,我們設計了基于IDL序列的另一類鉤狀結構,將其加到C-多肽的C末端后也能顯著提升C-多肽的抑制活性。同時將M-T鉤子和IDL鉤子分別加到一個C多肽N和C末端,可以更顯著提升該C多肽的抗HIV-1活性,對一些HIV-1臨床株的半數抑制濃度(IC50)能達到0.1納摩爾[11]。

此外,我們還對多肽的設計模型進行了深入的研究,發現以往對于C-多肽上的點突變位點選擇均是基于6-HB經典螺旋模型,但是該模型沒有考慮氫鍵、鹽橋和氨基酸側鏈的作用,有一定的局限性。所以,我們利用已解析的多個6-HB晶體結構分析了CHR上每個殘基對于結合NHR的作用,提出了NHR-CHR-NHR新模型,將參與螺旋模型形成的氨基酸殘基從29%提高到76%,使設計突變的選擇范圍大大提高,同時基于新模型設計的C34突變體多肽也較C34有更好的抗HIV-1活性[12]。

同時,我們還發現,截至目前大部分C-多肽的設計均是基于CHR的天然序列,所以部分HIV感染者體內預先存在的靶向CHR的抗體將拮抗C-多肽的抗HIV-1活性。因此,我們基于人工多肽模板5HRu,結合MT序列設計了多肽AP1、AP2和AP3。其中AP3效果最好,較T20半衰期更長,且血清中預存的抗HIV-1抗體不但沒有削弱其活性,反而增強了其抗病毒的效果[13]。我們的研究還證明將膽固醇分子連接到人工多肽的N-末端可明顯提高該人工多肽的抗病毒活性[14]。

除了以上手段,還有研究者使用了非天然氨基酸[15-16]、酯化肽[14,17-18]以及氨基酸定點共價交聯[19]等手段來提升C-多肽的性能(表1),并獲得了多種高活性或具有顯著優勢的C-多肽抑制劑。

在聯用策略方面,我們還發現雖然C-多肽均靶向gp41 NHR,但第一代融合抑制劑T20和第二代融合抑制劑T1144或者西夫韋肽聯合使用時,均具有很好的協同作用效果,且對T20耐受株也有效。這一研究成果也為臨床聯合使用不同的HIV融合抑制劑提供了依據[20]。

除了C-多肽的研究,我們也開展了來源于gp41 NHR區的N-多肽的研究工作。目前,學界大多數研究都集中于來源于gp41 CHR區的C-多肽,因為NHR來源的序列疏水性強,在中性溶液中極易發生聚集沉降,大大影響了其抑制活性。我們利用T4 fibritin三聚域(Fd)構建了NHR三聚體,大大提高了N-多肽的水溶性和抗HIV-1活性[21],為設計基于N-多肽的抗HIV藥物提供了新的思路。

小分子類藥物 相較于多肽類藥物,小分子藥物成本低,且可以口服,因此也成為入侵抑制劑設計的重要方向之一。本團隊在國際上首次發現了ADS-J1對HIV-1有低毫摩爾級別的抑制作用[22],并對其機制進行了深入的研究,發現其可阻斷6-HB的形成和HIV-1包膜蛋白Env介導的膜融合,證明了研發小分子類入侵抑制劑的可能。

表1 多肽類HIV入侵抑制劑的修飾策略Tab 1 Strategies to optimize the peptide-based HIV entry inhibitors

本團隊還利用在之前研究所發現的能特異性識別6-HB結構的單克隆抗體-NC-1,建立起了可高通量篩選具有阻斷6-HB形成活性的HIV入侵抑制劑篩選模型,并利用該模型篩選了大量的小分子入侵抑制劑。其中包括NB-2和NB-64[23-24],它們可結合到NHR的疏水溝槽中,對各型HIV均有較好的抑制作用。進一步優化NB-64得到了A12,GLS-22,GLS-23,NB-206以及NB206的衍生物11b,11d,11a,121,12m,5f和5g[25-26]等,其中一些抗HIV-1活性得以顯著提升,具有開發成為藥物的潛力。并且,為了得到活性和耐受性都更好的藥物,我們還設計了多肽與小分子化合物相結合的新型藥物。我們將人工設計的四重復多肽-m4HR與小分子pssm結合,得到了具有低毫摩爾級別抗HIV-1活性的新型融合抑制劑[14],其在入侵抑制劑的設計和作用機制研究上具有重要意義。

HIV滅活劑 現有的抗HIV臨床藥物均是作用于HIV附著到靶細胞表面或者是進入HIV后各個階段的,均不能在沒有靶細胞存在的情況下,直接滅活游離HIV的病毒顆粒,使其失去感染活性。可溶性CD4(sCD4)在體外實驗中顯示在較高濃度的情況下,具有一定滅活HIV病毒的能力,但體內研究發現其在較低濃度下還會促進一些HIV-1亞型的感染,因此sCD4較難作為HIV滅活劑來進行開發。在仔細分析了sCD4的作用機制后,我們以創新的思路構建了一個新型的HIV滅活劑,將CD4的D1D2結構域和T1144多肽串聯在一起,命名為2DLT[27]。D1D2結構域結合gp120上的CD4結構區后,T1144能緊接著結合到D1D2所誘導的gp41融合中間態上的NHR區,從而使HIV-1 Env發生不可逆轉的構象變化,成為融合后構象,使HIV病毒顆粒喪失了感染力,并且還解除了sCD4促進HIV感染的作用(圖3)。通過進一步的研究,我們還發現,2DLT不但單獨使用就有較高的抑制活性,而且其與核苷類逆轉錄酶抑制劑以及非核苷類逆轉錄酶抑制劑聯合使用還具有顯著的協同效應[28],有潛力加入到“高效抗逆轉錄病毒療法(HAART)”中,來提升各類藥物的抗病毒活性及抗變異。我們最近的研究證明將C-多肽(如T20,T1144,或SFT)與作用于gp120的雙特異性抗體復合物——4Dm2m 合用可大大提高4Dm2m對HIV-1的滅活作用[29]。

A:T1144 alone can bind to gp41 after gp120 interacts with the receptor and co-receptor,thus blocking the membrane fusion process;B:2D in 2DLT binds to HIV-1 gp120,triggering the exposure of gp41.T1144 in 2DLT then interacts with gp41,resulting in the inactivation of the virion.

圖3HIV-1滅活劑2DLT作用機制示意圖
Fig3MechanismofactionofHIVinactivator-2DLT

嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)入侵抑制劑冠狀病毒是一類有包膜的單股正鏈RNA病毒。其中,SARS-CoV(severe acute respiratory syndrome coronavirus)及中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)是感染人類并對人高致病性的冠狀病毒,對人類的生命健康帶來了嚴重威脅。冠狀病毒的感染機制與HIV-1類似,其包膜蛋白(S蛋白)在介導感染的過程發揮著重要作用[30-31]。近年來,本團隊所研發的靶向于S蛋白的多肽和抗體可有效抑制病毒的進入,具有很好的抗病毒效果。

2002年,SARS-CoV于廣州首次爆發,導致8 000多人的感染,并具有近10%的死亡率[31]。在SARS-CoV疫情的傳播過程中,果子貍是其中間宿主,而菊頭蝙蝠是其原始宿主。SARS-CoV可從果子貍等中間宿主直接傳播到人類,但是否存在由蝙蝠直接傳播到人類的可能還不是很清楚[32](圖4)。在抗SARS-CoV的入侵抑制劑研究方面,本團隊于2004年成功地分析出SARS-CoV S蛋白中七肽重復區域的具體特征,發現分別源自于HR1和HR2的多肽CP-1和NP-1,相互作用下可形成六螺旋結構,并且多肽CP-1可有效地抑制SARS-CoV的融合進入過程,具有很好的抗SARS-CoV活性[33]。在針對S蛋白抗體類入侵抑制劑的研發方面,也取得了顯著的進展。我們發現源自于S蛋白受體結合域(receptor-binding domain,RBD)的重組蛋白,在動物體內可誘導產生高效價的中和抗體,我們從中分離出27株鼠源單克隆抗體,其中25株能識別SARS-CoV RBD中不同空間構型中和表位的單抗具有很好的廣譜SARS-CoV中和活性[34]。同樣,Dimitrov等與我們合作在抗體庫中篩選出針對于SARS-CoV RBD的全人源單克隆抗體m396,具有高效并且廣譜的中和活性[35]。這些單克隆抗體的發現進一步豐富了抗SARS-CoV 的入侵抑制劑種類[31]。

中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)入侵抑制劑2012年,中東地區首次爆發了新型人感染冠狀病毒MERS-CoV。流行病學表明,蝙蝠是其自然宿主,而單峰駱駝(dromedary)則可能是其中間宿主。目前已有直接證據證明MERS-CoV的“駱駝-人”的傳播途徑,但是否存在“蝙蝠-人”的直接傳播途徑,還有待進一步研究(圖5)[32]。

The horseshoe bat is the natural reservoir of SARS-CoV,while the palm civet is its intermediate reservoir.The civet-to-human transmission of SARS-CoV has been confirmed,but it is still unclear whether MERS-CoV can be transmitted directly from bat to human.

圖4SARS-CoV傳播途徑
Fig4TransmissionpathwayofSARS-CoV

The fruit bat is the natural reservoir of MERS-CoV,while the dromedary camel is its intermediate reservoir.The camel-to-human transmission of MERS-CoV has been confirmed,but it is still unclear whether MERS-CoV can be transmitted directly from bat to human.

圖5MERS-CoV傳播途徑
Fig5TransmissionpathwayofMERS-CoV

MERS-CoV疫情爆發后,本團隊快速地建立起MERS-CoV假病毒系統和細胞-細胞融合系統,為后續的MERS-CoV入侵抑制劑的研發、活性評估及機制研究奠定了重要基礎[36-37]。同時,我們成功地解析出MERS-CoV S2 的六螺旋結構,并根據晶體結構設計出抗MERS-CoV的多肽類入侵抑制劑HR2P,發現該多肽能非常有效地抑制MERS-CoV S蛋白介導的膜融合及假病毒和活病毒的感染。通過對HR2P序列的優化,獲得優化多肽HR2P-M2,后者的水溶性、穩定性及抗病毒活性都有顯著提高[36]。多肽HR2P-M2通過鼻道給藥,在含有hDPP4基因的重組腺病毒Ad5構建的Ad5-hDPP4小鼠和hDPP4轉基因(hDPP4-Tg)小鼠中均顯示出非常好的保護效果[36,38-39]。另外,根據晶體結構提示,在其六螺旋的N端潛在一個疏水性口袋,針對該結構,在抗MERS-CoV多肽M0的N端添加“EAN”序列,可顯著地提高M0多肽的抗病毒活性,也為針對于其他I型包膜病毒的多肽類入侵抑制劑的設計和優化提供了新思路[11]。同時我們還發現將MERS-CoV S蛋白中RBD的截斷體(aa377-588)與IgG Fc fragment (S377-588-Fc)融合表達后,所獲得的重組蛋白可有效地與受體DPP4結合,并具有競爭性抑制MERS-CoV進入靶細胞的效果,表明該重組蛋白可開發成為蛋白類MERS-CoV入侵抑制劑。另外,與SARS-CoV的RBD性質的類似[30-31,34-35],該重組蛋白含有關鍵中和位點,可在動物體內誘生大量高效價的中和抗體,可直接阻斷MERS-CoV 的RBD與受體的結合,因此可開發成安全有效的抗MERS疫苗[40-41]。在可抑制MERS-CoV進入靶細胞的抗體研發方面,我們也取得了很大的進展。使用MERS-CoV 的RBD免疫小鼠獲得一個鼠源單克隆中和抗體Mermab1,可有效地阻止MERS-CoV與受體的結合及MERS-CoV的入侵過程[42]。此外,我們與Dimitrov合作,利用其超大容量噬菌體全人源抗體庫篩選出一系列針對MERS-CoV RBD的全人源抗體單克隆抗體,其中的m336具有超高效價的MERS-CoV中和活性,對MERS-CoV假病毒和活病毒半數中和濃度分別為 0.005和0.07 μg/mL[43],該抗體在兔子和hDPP4-Tg小鼠體內具有很好的保護效果[44-45]。另外,該抗體屬于人的類胚系抗體(germline-like antibody),具有對人免疫原性極低的優點,因而,在防治MERS-CoV感染方面具有更好的應用前景[44,46]。

埃博拉病毒(EBOV)入侵抑制劑EBOV(Ebola Virus)屬絲狀病毒科,分為5個亞種,分別為扎伊爾型、蘇丹型、本迪布焦型、科特迪瓦型及雷斯頓型[47]。EBOV是造成埃博拉病毒病(Ebola virus disease,EVD)的病原體,埃博拉病的患者通常死于嚴重的多器官衰竭以及系統性感染造成的休克[48]。

EBOV主要是通過與含有高濃度病毒的患者體液接觸后發生傳播[49]。EBOV可在 EVD 幸存者的精液中持續存活數月[50],表明EBOV可通過性傳播[51]以及EVD生還者精液中長期存活的EBOV可引起新的EVD爆發。

截至目前,還沒有針對EBOV的有效藥物或者疫苗被批準上市。ZMapp是混合了幾種針對EBOV包膜蛋白抗體的聯合制劑[52]。 2014年,ZMapp雖然還處于動物試驗階段,但該抗體聯合制劑在西非的EBOV爆發流行中被成功地用于少數幾個EVD患者的治療[53]。 2016年,ZMapp臨床試驗完成。雖然證明ZMapp 對于EVD的治療有一些效果,但遠未達到其預測的功效[54]。此外,Zmapp僅能中和扎伊爾型EBOV,對其他四型EBOV不能提供保護作用[55]。

本團隊在以前的研究中發現酸酐化修飾蛋白對一些病毒,如HIV[56]、HPV[57]等具有很好的抑制作用。于是我們設計并表達了一系列酸酐化修飾蛋白,發現3-羥基苯二甲酸酐修飾的人血清白蛋白(HP-HSA)對表達扎伊爾型和蘇丹型EBOV包膜蛋白的假病毒均具有較高的抑制活性,半數抑制濃度(IC50)達到了納摩爾水平,甚至比EBOV中和抗體MIL77-2 (ZMapp的成分之一)活性更高[58]。更重要的是,HP-HSA在45 ℃儲存8周后,依然保持良好的抗病毒活性。與抗體需要冷鏈運輸及高生產費用相比,該酸酐化蛋白更適合在熱帶和亞熱帶的發展中國家(特別是EBOV流行地區)使用。我們發現HP-HSA與MIL77-2還具有協同作用的效果,使得該蛋白既能單使用,也可與其他抗EBOV的藥物聯合使用。此外,HP-HSA還可被開發成為阻斷EBOV性傳播的殺微生物劑,在生殖道局部使用防控EBOV的性傳播。

寨卡病毒(ZIKV)入侵抑制劑ZIKV(Zika Virus)是一種蚊媒傳播病毒,與登革病毒(Dengue Virus,DENV)、黃熱病病毒(Yellow Fever Virus,YFV)和西尼羅病毒(West Nile Virus,WNV)同屬于黃病毒科家族成員。2007年之前,ZIKV僅偶爾在亞洲和非洲的局部地區造成零星感染。2007年后,人感染ZIKV病例逐漸增多。本次ZIKV大爆發始于巴西,并迅速傳播到美洲、非洲和亞洲的84個國家和地區[59]。ZIKV感染能損傷神經系統,引起包括小頭癥在內的嚴重的先天性腦發育障礙[60-62](圖6A),并能導致吉蘭-巴雷綜合征(Guillain-Barré syndrome)[63-64]。研究還表明ZIKV感染能造成雄性生殖系統損傷[65-66]。

寨卡病毒為具有囊膜的單股正鏈RNA病毒,在ZIKV囊膜表面覆蓋著介導病毒感染的E蛋白。我們對E蛋白的序列進行分析后,基于其頸部(stem)保守氨基酸序列設計了一條多肽—Z2。我們研究發現該多肽可與ZIKV的E蛋白結合,破壞病毒膜的完整性,導致病毒的基因組釋出,從而滅活ZIKV病毒顆粒。在多種體外細胞模型及體內動物模型的實驗中,Z2多肽均能有效地抑制ZIKV的感染。進一步研究發現Z2多肽具有穿透胎盤屏障的能力,不僅能夠降低ZIKV感染的孕鼠血清中的病毒滴度,還能顯著降低胎盤和胎鼠的病毒感染率,從而阻止ZIKV的垂直傳播(圖6B)。該多肽滅活劑對孕鼠及胎鼠均表現出良好的安全性,有望發展為可防治ZIKV感染的新型藥物,尤其適用于孕婦等ZIKV感染的高危人群[67]。

經過與應天雷課題組合作研究,我們從超大容量噬菌體全人源抗體庫成功地篩選到一系列可與ZIKV的E蛋白的DIII結構域(domain III)結合的全人源單克隆抗體。其中一株抗體m301能廣泛地中和多種目前流行的ZIKV毒株,并與另一株抗體m302合用具有協同效應。表位作圖和競爭性結合研究表明m301和m302結合于DIII結構域C-C’loop的相鄰區域,該區域代表了一個最近鑒定的間歇性暴露的隱蔽表位(cryptic epitope)。此隱蔽表位可能通過一個稱為病毒呼吸(viral breathing)的過程間歇性地暴露而被m301和m302抗體識別。這些人源單克隆抗體也都是類胚系抗體,與其相應的胚系免疫球蛋白重鏈可變區基因有98%～100%的同源性,其與體細胞超突變抗體(somatically hypermutated antibody)相比,顯示更低的免疫原性和更好的成藥性。因此,此項研究有助于我們理解ZIKV抗體的抗原表位和設計更有效的抗ZIKV疫苗和血清學診斷方法,并且這些抗ZIKV的全人源中和抗體還具有進一步研發為抗體治療藥物的潛力[68]。

A:Infection of ZIKV during pregnancy may result in congenital malformation of fetal brain and microcephaly;B:Peptide Z2 can inactivate ZIKV and reduce the virus load in maternal blood,and can also penetrate the placental barrier,thus significantly reducing the infection rate of placenta and fetus,and preventing the vertical transmission of ZIKV.

圖6ZIKV入侵抑制劑和滅活劑
Fig6EntryinhibitorsandinactivatorsofZIKV

雖然已經確證ZIKV感染可引起包括小頭癥在內的胎兒先天性畸形和成人吉蘭-巴雷綜合征等疾病,但對ZIKV感染孕婦后導致先天性畸形的胎兒的預后及其成年后可能出現的后遺癥知之甚少。許多ZIKV感染相關的小鼠模型雖已建立[69-70],但感染的胎鼠通常在出生之前或之后不久死亡[71-72],先天性感染的胎鼠難以成功出生并成年,限制了先天性ZIKV感染的成年后遺癥的研究及防治該后遺癥的藥物及疫苗的篩選和評估。經過與張嘉漪課題組合作研究,我們成功地建立了一種小鼠先天性ZIKV感染新模型[73],通過羊膜腔內注射途徑接種ZIKV,大量胎鼠順利出生并成長至成年期。檢測發現小鼠出生后ZIKV可在小鼠體內持續感染并復制,直到成長至青春期后,隨著免疫系統成熟,病毒可被清除。感染小鼠與對照組相比,大腦體積顯著減小,皮層變薄,視覺系統和小腦出現解剖缺陷以及顱內鈣化,且先天性感染ZIKV的小鼠中出現后肢癱瘓和運動不協調。“曠場實驗”、“懸尾實驗”、“轉棒實驗”、“高架十字迷宮”、“步態分析”等行為學檢測,表明先天性ZIKV感染的小鼠預后出現運動功能障礙以及視覺功能障礙等后遺癥,重現了人先天性ZIKV感染的若干臨床表現,有助于人先天性ZIKV感染的預后研究。此模型通過采用行為學分析的預后評估系統,可用于篩選和鑒定能修復神經損傷從而改善預后病癥的候選藥物和評估抗ZIKV治療的預后效果。

展望病毒入侵抑制劑主要分為多肽類、抗體類、修飾蛋白類以及小分子類抗病毒藥物及其候選。其中,本團隊在HIV、SARS-CoV、MERS-CoV、EBOV以及ZIKV多肽類及修飾蛋白類入侵抑制劑研究領域處于國際領先水平。多肽類入侵抑制劑具有入侵抑制劑普遍具有的作用于病毒入侵的早期階段,能有效保護靶細胞免受病毒傷害的優點。同時,由于其分子量較小,免疫原性較低,不易引發機體產生針對病毒入侵的抑制劑的抗體。但是,多肽類藥物也有其相應的缺點。如20年前研發的第一個多肽抑制劑類抗HIV藥物——T20具有抗病毒活性低[4],臨床用量大,注射次數多等缺點。這些問題正在通過選取對膜蛋白親和力更高的結構域[7],添加人工設計的鉤狀結構[9-11],設計酯化肽[14]等手段解決。另一問題是由于其分子量較小,導致其半衰期較短,臨床使用時導致用藥頻率較高。研究人員采用在全人工設計的非天然序列中引入β氨基酸[16]或使用酸酐修飾C-多肽使其與人血清白蛋白發生快速和不可逆轉的結合[74]等方法一定程度上延長了多肽類藥物的半衰期,但長效多肽的研發仍然是未來研究需努力的方向之一。另外,由于RNA病毒基因組易發生突變,各病毒均有各種不同的亞型,不同區域的流行亞型也不盡相同,所以開發針對病毒在入侵過程中具有重要作用的保守位點(如6-HB)的廣譜抗病毒藥物也是未來抗病毒藥物的發展重點之一。尤其是對于新發病毒(如MERS-CoV和ZIKV)來說,如果能提前開發出廣譜抗冠狀病毒和廣譜抗黃病毒的藥物,可在這些新發病毒疫情發生時,第一時間使用來挽救感染者的性命,大大節省國家的公共衛生投入。

修飾蛋白類藥物作為局部使用藥物可防控病毒的性傳播,如酸酐修飾的牛血清白蛋白作為針對HPV的陰道用殺微生物劑,其有效性和安全性都在臨床試驗中得到了確認[75-76]。其中酸酐修飾的β乳球蛋白對HIV-1、HIV-2、HPV、HSV及EBOV也具有廣譜的抑制效果[56-58,77]。修飾類蛋白局部用藥劑型生產成本低、作用廣譜、性質穩定、非常安全、使用方便,十分適合被開發成可防控上述病毒性傳播的局部用藥。

抗體類病毒入侵抑制劑多為針對病毒包膜蛋白特定位點的單克隆抗體,特別是全人源的類胚系抗體,具有抗病毒活性高和免疫原性低的優點。但是,抗體藥物在病毒防治領域較難推廣使用的重要原因之一是其制造成本太高。為解決這一問題,學界也進行了很多研究,包括開發分子量較小的新結構抗體,以及將抗體與多肽藥物聯合使用來降低抗體藥物的使用量等手段。同時,抗體類入侵抑制劑針對的病毒表位單一,易出現病毒逃逸的情況。研究人員也因此提出聯合使用多種單克隆抗體或構建雙/三特異性抗體等來解決病毒逃逸的問題,但是這將更進一步增加用藥成本。所以本團隊提出聯合使用抗體類和多肽類入侵抑制劑的策略,以期大大增加藥物靶向的位點范圍,減少耐藥情況產生。

以上多肽類以及抗體類入侵抑制劑同樣具有的一個問題是只能通過注射用藥,相較于口服藥,患者依從性較低。小分子類入侵抑制劑能有效解決這些問題。但目前小分子類入侵抑制劑的活性普遍較低,還不適合開發成藥物。所以該類病毒入侵抑制劑的研究方向仍聚焦于如何有效提高其抗病毒活性。

病毒滅活劑能作用于患者體內的游離病毒,在藥物利用率等方面具有明顯優勢。如能通過胎盤的ZIKV多肽滅活劑Z2不僅能用于治療母體的感染,還能保護胎兒不受病毒感染。由于Z2多肽具有滅活游離病毒的功能,可以在病毒進入胎鼠腦部前將病毒滅活,因此可有效減低胎鼠腦部的病毒感染率,具有顯著的優勢[67]。此外,病毒滅活劑還可被發展成為清除HIV潛伏細胞的細胞殺滅劑,在艾滋病治愈藥物的開發上具有潛力。例如,HIV潛伏庫的清除一直是HIV治愈領域的一大研究重點,其中激活并殺死(shock and kill)的策略被認為是最有希望清除HIV潛伏庫的方法之一[78]。HIV滅活劑就能運用到該策略上,直接滅活被激活的潛伏病毒,有效保護機體不受激活后產生的新病毒的影響,并且還能通過偶聯毒素等策略設計成為有效地將被激活的、表面表達HIV-1 Env的潛伏細胞殺滅,從而將其清除。所以,設計出滅活效率高的病毒滅活劑是今后抗病毒治療及治愈藥物發展的一大方向。

致謝感謝聞玉梅院士、袁正宏教授及醫學分子病毒學教育部/衛生部重點實驗室其他同事的大力支持,感謝姜世勃/陸路課題組全體成員的貢獻。

[1] CHAN DC,FASS D,BERGER JM,etal.Core structure of gp41 from the HIV envelope glycoprotein[J].Cell,1997,89(2):263-273.

[2] JIANG S,LIN K,STRICK N,etal.HIV-1 inhibition by a peptide[J].Nature,1993,365(6442):113.

[3] JIANG S,LIN K,STRICK N,etal. Inhibition of HIV-1 infection by a fusion domain binding peptide from the HIV-1 envelope glycoprotein GP41[J].BiochemBiophysResCommun,1993,195(2):533-538.

[4] LIU S,LU H,NIU J,etal.Different from the HIV fusion inhibitor C34,the anti-HIV drug Fuzeon (T-20) inhibits HIV-1 entry by targeting multiple sites in gp41 and gp120[J].JBiolChem,2005,280(12):11259-11273.

[5] LIU S,JING W,CHEUNG B,etal.HIV gp41 C-terminal heptad repeat contains multifunctional domains.Relation to mechanisms of action of anti-HIV peptides[J].JBiolChem,2007,282(13):9612-9620.

[6] HE Y,XIAO Y,SONG H,etal.Design and evaluation of sifuvirtide,a novel HIV-1 fusion inhibitor[J].JBiolChem,2008,283(17):11126-11134.

[7] HE Y,CHENG J,LI J,etal.Identification of a critical motif for the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) gp41 core structure:implications for designing novel anti-HIV fusion inhibitors[J].JVirol,2008,82(13):6349-6358.

[8] HE Y,CHENG J,LU H,etal. Potent HIV fusion inhibitors against Enfuvirtide-resistant HIV-1 strains[J].ProcNatlAcadSciUSA,2008,105(42):16332-16337.

[9] CHONG H,YAO X,SUN J,etal.The M-T hook structure is critical for design of HIV-1 fusion inhibitors[J].JBiolChem,2012,287(41):34558-34568.

[10] CHONG H,QIU Z,SUN J,etal.Two M-T hook residues greatly improve the antiviral activity and resistance profile of the HIV-1 fusion inhibitor SC29EK[J].Retrovirology,2014,11:40.

[11] SU S,ZHU Y,YE S,etal.Creating an artificial tail anchor as a novel strategy to enhance the potency of peptide-based HIV fusion inhibitors[J].JVirol,2017,91(1):e01445-16.

[12] SU S,WANG Q,XU W,etal.A novel HIV-1 gp41 tripartite model for rational design of HIV-1 fusion inhibitors with improved antiviral activity[J].AIDS,2017,31(7):885-894.

[13] ZHU X,ZHU Y,YE S,etal.Improved pharmacological and structural properties of HIV fusion inhibitor AP3 over enfuvirtide:highlighting advantages of artificial peptide strategy[J].SciRep,2015,5:13028.

[14] WANG C,SHI W,CAI L,etal.Artificial peptides conjugated with cholesterol and pocket-specific small molecules potently inhibit infection by laboratory-adapted and primary HIV-1 isolates and enfuvirtide-resistant HIV-1 strains[J].JAntimicrobChemother,2014,69(6):1537-1545.

[15] WELCH BD,FRANCIS JN,REDMAN JS,etal.Design of a potent D-peptide HIV-1 entry inhibitor with a strong barrier to resistance[J].JVirol, 2010,84(21):11235-11244.

[16] STEPHENS OM,KIM S,WELCH BD,etal.Inhibiting HIV fusion with a beta-peptide foldamer[J].JAmChemSoc, 2005,127(38):13126-13127.

[17] ASHKENAZI A,VIARD M,UNGER L,etal. Sphingopeptides:dihydrosphingosine-based fusion inhibitors against wild-type and enfuvirtide-resistant HIV-1[J].FASEBJ,2012,26(11):4628-4636.

[18] DING X,ZHANG X,CHONG H,etal. Enfuvirtide (T20)-based lipopeptide is a potent HIV-1 cell fusion Inhibitor:implications for viral entry and inhibition[J].JVirol,2017,91(18):e00831-17.

[19] SIA SK,CARR PA,COCHRAN AG,etal.Short constrained peptides that inhibit HIV-1 entry[J].ProcNatlAcadSciUSA, 2002,99(23):14664-14669.

[20] PAN C,LU H,QI Z,etal.Synergistic efficacy of combination of enfuvirtide and sifuvirtide,the first- and next-generation HIV-fusion inhibitors[J].AIDS,2009,23(5):639-641.

[21] CHEN X,LU L,QI Z,etal. Novel recombinant engineered gp41 N-terminal heptad repeat trimers and their potential as anti-HIV-1 therapeutics or microbicides[J].JBiolChem,2010,285(33):25506-25515.

[22] JIANG S,LIN K,LU M.A conformation-specific monoclonal antibody reacting with fusion-active gp41 from the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein[J].JVirol, 1998,72(12):10213-10217.

[23] LIU K,LU H,HOU L,etal.Design,synthesis,and biological evaluation of N-carboxyphenylpyrrole derivatives as potent HIV fusion inhibitors targeting gp41[J].JMedChem,2008,51(24):7843-7854.

[24] JIANG S,LU H,LIU S,etal.N-substituted pyrrole derivatives as novel human immunodeficiency virus type 1 entry inhibitors that interfere with the gp41 six-helix bundle formation and block virus fusion[J].AntimicrobAgentsChemother, 2004,48(11):4349-4359.

[25] KATRITZKY AR,TALA SR,Lu H,etal.Design,synthesis,and structure-activity relationship of a novel series of 2-aryl 5-(4-oxo-3-phenethyl-2-thioxothiazolidinylidenemethyl)furans as HIV-1 entry inhibitors[J].JMedChem,2009,52(23):7631-7639.

[26] JIANG S,TALA SR,LU H,etal.Design,synthesis,and biological activity of novel 5-((arylfuran/1H-pyrrol-2-yl)methylene)-2-thioxo-3-(3-(trifluoromethyl)phenyl)thi azolidin-4-ones as HIV-1 fusion inhibitors targeting gp41[J].JMedChem,2011,54(2):572-579.

[27] LU L,PAN C,LI Y,etal.A bivalent recombinant protein inactivates HIV-1 by targeting the gp41 prehairpin fusion intermediate induced by CD4 D1D2 domains[J].Retrovirology,2012,9:104.

[28] XU W,WANG Q,YU F,etal.Synergistic effect resulting from combinations of a bifunctional HIV-1 antagonist with antiretroviral drugs[J].JAcquirImmuneDeficSyndr,2014,67(1):1-6.

[29] QI Q,WANG Q,CHEN W,etal.HIV-1 gp41-targeting fusion inhibitory peptides enhance the gp120-targeting protein-mediated inactivation of HIV-1 virions[J].EmergMicrobesInfect,2017,6(6):e59.

[30] XIA S,LIU Q,WANG Q,etal.Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) entry inhibitors targeting spike protein[J].VirusRes,2014,194:200-210.

[31] DU L,HE Y,ZHOU Y,etal.The spike protein of SARS-CoV--a target for vaccine and therapeutic development[J].NatRevMicrobiol,2009,7(3):226-236.

[32] 代嫣嫣,夏帥,王茜,等.人類高致病性冠狀病毒SARS-CoV 和MERS-CoV 的流行與突變— 共性與個性特征的啟示[J].生命科學,2016,28(3):357-366.

[33] LIU S,XIAO G,CHEN Y,etal.Interaction between heptad repeat 1 and 2 regions in spike protein of SARS-associated coronavirus:implications for virus fusogenic mechanism and identification of fusion inhibitors[J].Lancet,2004,363(9413):938-947.

[34] HE Y,LI J,LI W,etal.Cross-neutralization of human and palm civet severe acute respiratory syndrome coronaviruses by antibodies targeting the receptor-binding domain of spike protein[J].JImmunol,2006,176(10):6085-6092.

[35] ZHU Z,CHAKRABORTI S,HE Y,etal.Potent cross-reactive neutralization of SARS coronavirus isolates by human monoclonal antibodies[J].ProcNatlAcadSciUSA,2007,104(29):12123-12128.

[36] LU L,LIU Q,ZHU Y,etal.Structure-based discovery of Middle East respiratory syndrome coronavirus fusion inhibitor[J].NatCommun,2014,5:3067.

[37] ZHAO G,DU L,MA C,etal. A safe and convenient pseudovirus-based inhibition assay to detect neutralizing antibodies and screen for viral entry inhibitors against the novel human coronavirus MERS-CoV[J].VirolJ,2013,10:266.

[38] CHANNAPPANAVAR R,LU L,XIA S,etal.Protective effect of intranasal regimens containing peptidic Middle East respiratory syndrome coronavirus fusion inhibitor against MERS-CoV infection[J].JInfectDis,2015,212(12):1894-1903.

[39] TAO X,GARRON T,AGRAWAL AS,etal.Characterization and demonstration of the value of a lethal mouse model of Middle East respiratory syndrome coronavirus infection and disease[J].JVirol,2015,90(1):57-67.

[40] DU L,KOU Z,MA C,etal.A truncated receptor-binding domain of MERS-CoV spike protein potently inhibits MERS-CoV infection and induces strong neutralizing antibody responses:implication for developing therapeutics and vaccines[J].PLoSOne,2013,8(12):e81587.

[41] DU L,ZHAO G,KOU Z,etal.Identification of a receptor-binding domain in the S protein of the novel human coronavirus Middle East respiratory syndrome coronavirus as an essential target for vaccine development[J].JVirol, 2013,87(17):9939-9942.

[42] DU L,ZHAO G,YANG Y,etal. A conformation-dependent neutralizing monoclonal antibody specifically targeting receptor-binding domain in Middle East respiratory syndrome coronavirus spike protein[J].JVirol, 2014,88(12):7045-7053.

[43] YING T,DU L,JU TW,etal.Exceptionally potent neutralization of Middle East respiratory syndrome coronavirus by human monoclonal antibodies[J].JVirol,2014,88(14):7796-7805.

[44] HOUSER KV,GRETEBECK L,YING T,etal.Prophylaxis with a Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV)-specific human monoclonal antibody protects rabbits from MERS-CoV infection[J].JInfectDis,2016,213(10):1557-1561.

[45] AGRAWAL AS,YING T,TAO X,etal.Passive transfer of a germline-like neutralizing human monoclonal antibody protects transgenic mice against lethal middle east respiratory syndrome coronavirus infection[J].SciRep,2016,6:31629.

[46] YING T,PRABAKARAN P,DU L,etal.Junctional and allele-specific residues are critical for MERS-CoV neutralization by an exceptionally potent germline-like antibody[J].NatCommun,2015,6:8223.

[47] WEYER J,GROBBELAAR A,BLUMBERG L.Ebola virus disease:history,epidemiology and outbreaks[J].CurrInfectDisRep,2015,17(5):480.

[48] FELDMANN H,GEISBERT TW.Ebola haemorrhagic fever[J].Lancet,2011,377(9768):849-862.

[49] DE LA VEGA MA,CALEO G,AUDET J,etal.Ebola viral load at diagnosis associates with patient outcome and outbreak evolution[J].JClinInvest,2015,125(12):4421-4428.

[50] CROZIER I.Ebola virus RNA in the semen of male survivors of Ebola virus disease:The uncertain gravitas of a privileged persistence[J].JInfectDis,2016,214(10):1467-1469.

[51] MATE SE,KUGELMAN JR,NYENSWAH TG,etal.Molecular evidence of sexual transmission of Ebola virus[J].NEnglJMed,2015,373(25):2448-2454.

[52] QIU X,WONG G,AUDET J,etal. Reversion of advanced Ebola virus disease in nonhuman primates with ZMapp[J].Nature,2014,514(7520):47-53.

[53] LYON GM,MEHTA AK,VARKEY JB,etal.Clinical care of two patients with Ebola virus disease in the United States[J].NEnglJMed,2014,371(25):2402-2409.

[54] GROUP PIW,MULTI-NATIONAL PIIST,DAVEY RT,JR,etal.A randomized,controlled trial of ZMapp for Ebola virus infection[J].NEnglJMed,2016,375(15):1448-1456.

[55] FURUYAMA W,MARZI A,NANBO A,etal.Discovery of an antibody for pan-ebolavirus therapy[J].SciRep,2016,6:20514.

[56] LI L,HE L,TAN S,etal.3-hydroxyphthalic anhydride-modified chicken ovalbumin exhibits potent and broad anti-HIV-1 activity:a potential microbicide for preventing sexual transmission of HIV-1[J].AntimicrobAgentsChemother, 2010,54(5):1700-1711.

[57] LU L,YANG X,LI Y,etal.Chemically modified bovine beta-lactoglobulin inhibits human papillomavirus infection[J].MicrobesInfect, 2013,15(6-7):506-510.

[58] LI H,YU F,XIA S,etal.Chemically modified human serum albumin potently blocks entry of Ebola pseudoviruses and viruslike particles[J].AntimicrobAgentsChemother,2017,61(4):e02168-16.

[59] WHO.Zika virus and complications:2016 Public health emergency of international concern[R/OL].[2017-09-28]http://www.who.int/emergencies/zika-virus/en/.

[60] GARCEZ PP,LOIOLA EC,MADEIRO DA COSTA R,etal.Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids[J].Science,2016,352(6287):816-818.

[61] CALVET G,AGUIAR RS,MELO ASO,etal.Detection and sequencing of Zika virus from amniotic fluid of fetuses with microcephaly in Brazil:a case study[J].LancetInfectDis,2016,16(6):653-660.

[62] CUGOLA FR,FERNANDES IR,RUSSO FB,etal.The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in experimental models[J].Nature,2016,534(7606):267-271.

[63] BRASIL P,SEQUEIRA PC,FREITAS AD,etal. Guillain-Barre syndrome associated with Zika virus infection[J].Lancet,2016,87(10026):1482.

[64] PARRA B,LIZARAZO J,JIMENEZ-ARANGO JA,etal. Guillain-Barre syndrome associated with Zika virus infection in Colombia[J].NEnglJMed,2016,375(16):1513-1523.

[65] MA W,LI S,MA S,etal.Zika virus causes testis damage and leads to male infertility in mice[J].Cell,2016,167(6):1511-1524.

[66] GOVERO J,ESAKKY P,SCHEAFFER SM,etal.Zika virus infection damages the testes in mice[J].Nature,2016,540(7633):438-442.

[67] YU Y,DENG YQ,ZOU P,etal.A peptide-based viral inactivator inhibits Zika virus infection in pregnant mice and fetuses[J].NatCommun,2017,8:15672.

[68] WU YL,LI S,DU LY,etal.Neutralization of Zika virus by germline-like human monoclonal antibodies targeting cryptic epitopes on envelope domain III[J].EmergMicrobesInfect,2017,Accepted.

[69] MOR F,COHEN IR.Pathogenicity of T cells responsive to diverse cryptic epitopes of myelin basic protein in the Lewis rat[J].JImmunol,1995,155(7):3693-3699.

[70] MORRISON TE,DIAMOND MS.Animal models of Zika virus infection,pathogenesis,and immunity[J].JVirol,2017,91(8):e00009-17.

[71] MINER JJ,CAO B,GOVERO J,etal.Zika virus infection during pregnancy in mice causes placental damage and fetal demise[J].Cell,2016,165(5):1081-1091.

[72] LI C,XU D,YE Q,etal. Zika virus disrupts neural progenitor development and leads to microcephaly in mice[J].CellStemCell, 2016,19(5):672.

[73] CUI L,ZOU P,CHEN E,etal. Visual and motor deficits in grown-up mice with congenital Zika virus infection[J].EBioMedicine,2017,20:193-201.

[74] XIE D,YAO C,WANG L,etal. An albumin-conjugated peptide exhibits potent anti-HIV activity and long in vivo half-life[J].AntimicrobAgentsChemother,2010,54(1):191-196.

[75] GUO X,QIU L,WANG Y,etal.A randomized open-label clinical trial of an anti-HPV biological dressing (JB01-BD) administered intravaginally to treat high-risk HPV infection[J].MicrobesInfect,2016,18(2):148-152.

[76] GUO X,QIU L,WANG Y,etal.Safety evaluation of chemically modified beta-lactoglobulin administered intravaginally[J].JMedVirol,2016,88(6):1098-1101.

[77] NEURATH AR,JIANG S,STRICK N,etal.Bovine beta-lactoglobulin modified by 3-hydroxyphthalic anhydride blocks the CD4 cell receptor for HIV[J].NatMed,1996,2(2):230-234.

[78] HAMER DH.Can HIV be Cured? Mechanisms of HIV persistence and strategies to combat it[J].CurrHIVRes,2004,2(2):99-111.

[79] NISHIKAWA H,OISHI S,FUJITA M,etal.Identification of minimal sequence for HIV-1 fusion inhibitors[J].BioorgMedChem,2008,16(20):9184-9187.

[80] JOHNSON LM,MORTENSON DE,YUN HG,etal.Enhancement of alpha-helix mimicry by an alpha/beta-peptide foldamer via incorporation of a dense ionic side-chain array[J].JAmChemSoc,2012,134(17):7317-7320.

Defeatingenemyoutsidetheborder-developmentofviralentryinhibitors

JIANG Shi-bo△, SU Shan, XIA Shuai, ZOU Peng, LU Lu

(MOE/MOHKeyLaboratoryofMedicalMolecularVirology,ShanghaiMedicalCollege,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

About 25 years ago,we had pioneered the research fields of developing human immunodeficiency virus (HIV) fusion/entry inhibitors and anti-HIV peptide drugs.Over the past six years,we have gained some promising results in research and development of the HIV,Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-COV),the Ebola virus (EBOV),and the Zika virus (ZIKV) entry inhibitors.This article provides an overview of the research progress of viral entry inhibitors against the related highly pathogenic viruses.

highly pathogenic viruses; virus entry inhibitors; virus inactivators

R511

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2017.06.0014

國家自然科學基金 (81102476,81173098,81261120382,81361120378,81373456,81410308013,81590762,8161101485,81630090,81672019);國家重點研究計劃“生物安全關鍵技術研發”重點項目 (2016YFC1201000,2016YFC1200400,2016YFC1202901)

△Corresponding author E-mail:shibojiang@fudan.edu.cn

*ThisworkwassupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(81102476,81173098,81261120382,81361120378,81373456,81410308013,81590762,8161101485,81630090,81672019)andNationalKeyResearchProgramofChina-ResearchandDevelopmentofKeyTechnologiesforBiosafety(2016YFC1201000,2016YFC1200400,2016YFC1202901).

2017-09-30;編輯:張秀峰)