分辨率革命
——冷凍電子顯微學在結構生物學研究中的進展

陳振國 徐彥輝

(1復旦大學生物醫學研究院 上海 200032; 2復旦大學附屬上海市第五人民醫院 上海 200240;3復旦大學附屬腫瘤醫院 上海 200032)

專家簡介徐彥輝,復旦大學附屬腫瘤醫院研究員,復旦大學生物醫學研究院兼職教授、博士生導師,國家杰出青年基金獲得者,教育部長江學者特聘教授。中國生物物理學會理事,科技部“重點研發計劃”項目負責人。

長期從事表觀遺傳調控的結構與功能研究,系統地闡明了DNA甲基化和組蛋白甲基化修飾關鍵酶的催化、底物識別和酶活性調節的分子機制。在DNA甲基化和去甲基化調控的分子機制及結構研究方面取得了一系列國際前沿的成果,不僅對表觀遺傳調控機制的深入理解有重要貢獻,也為靶向表觀遺傳調控蛋白的藥物設計提供了重要的結構基礎。發表通訊作者論文20余篇。其中包括Nature(2篇)、Cell(1篇)、MolecularCell(2篇)、NatureCommunications(2篇)、Genesamp;Development(2篇)、CellResearch(7篇)等。研究成果得到國內外同行的高度評價(在Faculty1000、Cell、NatureChina、ScienceSignaling等專門評述),曾多次受邀在重要國際會議上作大會報告。

曾榮獲2016年教育部自然科學一等獎(第一完成人)、首屆中國優秀青年科技獎、談家楨生命科學獎、樹蘭醫學青年獎、中源協和生命醫學獎、藥明康德生命化學獎、貝時璋青年生物物理學家獎、明治生命科學獎(杰出獎)、第7屆上海青年科技英才等多個獎項。

專家簡介陳振國,博士畢業于荷蘭格羅寧根大學應用物理系,后師從著名結構生物學教授Michael Rossmann,從事冷凍電子顯微鏡在結構生物學研究中的應用?，F為復旦大學附屬上海市第五人民醫院青年研究員,復旦大學生物醫學研究院兼職青年研究員,從事結構生物學的冷凍電鏡方向研究,解析與疾病相關生物大分子的原子結構,揭示相應大分子的致病機制,為疫苗研發、小分子抑制劑設計、以及治療性藥物開發提供理論基礎。

上海醫學院創建90周年寄語值此上醫90年慶之際,衷心祝愿上醫更上一層樓,我們年輕人要向前輩學習,為生命醫學的發展貢獻微薄之力。

分辨率革命
——冷凍電子顯微學在結構生物學研究中的進展

陳振國1,2徐彥輝1,3△

(1復旦大學生物醫學研究院 上海 200032;2復旦大學附屬上海市第五人民醫院 上海 200240;3復旦大學附屬腫瘤醫院 上海 200032)

冷凍電子顯微學具有悠久的歷史,近年來隨著硬件設備的革命性技術突破和軟件算法方面技術發展,已經成為結構生物學領域最為重要的研究方法,也代表了未來的發展方向。其中,單顆粒三維結構重構法在最近的幾年發展迅速,極大地拓展了研究方法的適用范圍,并不斷刷新所解析結構的高分辨率記錄,成為結構生物學及相關學科最為激動人心的研究領域。本文將針對冷凍電子顯微學發展的歷史,近期革命性技術突破,以及復旦大學在該領域的布局和進展做簡要介紹。

冷凍電子顯微學; 結構生物學; 單顆粒重構

結構生物學是分子生物學、生物化學和生物物理學的分支,研究生物大分子尤其是核酸,蛋白質及其復合物的分子結構,通過解析生物大分子的原子分辨率或近原子分辨率三維結構,指導基于結構的功能分析,揭示生物大分子結構與功能的關系,闡明分子機器的工作機制,為靶向藥物提供結構基礎[1-3]。核磁共振波譜學、X射線晶體學和冷凍電子顯微學是結構生物學的三大主要分支。

自1957年核糖核酸酶的結構解析以來,核磁共振波譜法已成為一種成熟的結構生物學方法[4-5]。但是,該方法所分析生物大分子樣品的分子量一般不超過50 kD。同樣是在1957年,John Kendrew 運用X射線晶體方法解析了第一個生物大分子晶體結構——抹香鯨肌紅蛋白結構,分辨率達到了6 ?[6]。并經過3年努力將分辨率提高到了2 ?[7]。同時發展出來的同晶置換法[8]和分子置換法[9],成功解決了晶體學的相位問題。隨著后續一系列技術突破和硬件設備提升,尤其是同步輻射光源大范圍建設和射線強度的提升,使得X射線晶體學逐步發展成為結構生物學的最為主要的研究手段。從20世紀90年代初至今,X射線晶體學在結構解析數量和質量方面都遙遙領先于其他結構生物學方法。利用該方法獲得的生物大分子結構,從分子層面上提高了我們對于生命過程的認識,并大大促進了現代醫學的發展[10]。X射線晶體學最大的局限就是要獲得可衍射的晶體,而生物大分子結晶本身就是一個非常耗時和具有挑戰性的工作,尤其是對膜蛋白和超大分子量的復合物,其結晶異常困難,極大地阻礙了對這些重要生命分子結構的解析和功能的理解[11]。冷凍電子顯微學在近年來有了關鍵的技術突破,很好的解決了上述限制,使得曾經非常難以獲得的結構解析難度大大降低,與核磁共振波譜學和X射線晶體學形成了完美的互補,并帶來了結構生物學前所未有的蓬勃發展。

2017年10月4日,瑞典皇家科學院宣布將2017年度諾貝爾化學獎授予瑞士洛桑大學科學家Jacques Dubochet、美國哥倫比亞大學科學家Joachim Frank 和英國醫學研究委員會科學家Richard Henderson,以表彰他們在開發冷凍電子顯微學、用于確定溶液中生物分子的高分辨率結構方面所作出的貢獻。該學科的發展同時簡化并改進了生物分子的成像,將生物化學推進到一個新的時代。冷凍電子顯微學用于結構生物學研究有3個基本方法:電子晶體學、單顆粒三維重構法和電子斷層掃描成像技術。其中,單顆粒三維重構法可以將幾十萬甚至幾百萬個大分子顆粒的圖像,根據方向性進行分類和平均以提高圖像信噪比,更容易得到大分子的原子分辨率三維結構,使得該方法成為結構生物學研究中至關重要且不可替代的研究手段[12-13]。

冷凍電子顯微學與結構生物學冷凍電子顯微學以深冷溫度下(-150 ℃以下,通常是液氮溫度即-196 ℃)的生物大分子樣品為研究對象,整個流程包括冷凍樣品制備、電子顯微鏡圖像收集、圖像數據處理進行生物大分子三維結構重構以及三維結構的解析等幾個基本步驟。區別于傳統電子顯微學鏡生物樣品的染色或者固定處理方法,樣品的快速冷凍處理在最大程度上保持其原始狀態。1974年,R.Glaeser 和 K.Taylor 使用液氮快速冷凍蛋白質晶體樣品[14],大大減少了生物樣品在觀察過程中的電子輻射損傷;1984年,J.Dubochet等將該液氮快速冷凍技術實用化,得到了非晶冰層中冷凍的病毒顆粒[15]。之后,該方法成為冷凍電鏡通用樣品制備方法。與之相反的是,X射線晶體學樣品的制備要求將大分子樣品進行結晶,把樣品置于非生理的環境中,這就可能偶然引起樣品與功能無關的構象變化。因此,冷凍電鏡子問世以來就具有其獨特的優勢。

電子晶體學 電子晶體學使用電子顯微鏡收集生物大分子晶體的襯度圖像或者衍射圖樣,用于解析這些生物大分子的三維結構。由于電子波長(100 kV和300 kV加速電壓時分別為3.70 pm和1.96 pm)比X射線波長要小很多(位于美國芝加哥阿貢國家實驗室的先進光子源常用波長為0.5 ?或更大,而小角X射線散射所用波長可以達到0.035～0.3 ?,1 ?=100 pm),因此電子晶體學作為X射線晶體學的一個補充方法出現,可以研究很小的晶體(lt;0.1 μm)。通常,這些小尺寸的晶體是沒法通過X射線晶體學進行研究的。雖然早在1975年,中等分辨率膜蛋白結構已經通過電子晶體學方法解析,但是,第一個原子分辨率結構直到1990年才由Richard Henderson獲得[16]。

單顆粒三維重構法 1968年,A.Klug和D.De Rosier發現中心截面定理——實空間三維物體沿某角度的二維投影,其傅里葉變換等價于該三維物體的傅里葉變換中與投影方向垂直的中心截面。據此,他們提出了單顆粒三維重構的思想,并應用于重構噬菌體T4的尾部結構[17]。簡單地講,單顆粒法三維重構法通過收集大分子樣品在成像設備上的襯度圖像,通常包括幾十萬甚至上百萬單個大分子顆粒,將相同或相近方向性的顆粒進行平均,得到信噪比較高的二維圖像,如果這些二維圖像的分布足夠彌散,代表著單個顆粒不同角度的二維投影,應用中心截面定理,將他們的傅里葉變換插入到三維傅立葉空間中,然后進行反傅里葉變換,就可以得到實空間的三維物體。

冷凍電子顯微學單顆粒三維重構法(此后簡稱單顆粒法),自問世以來因其對樣品純度和數量更為寬松的要求,在生物大分子三維結構解析中,因無需結晶且所得結構更接近原始狀態,使其成為最具有發展前途的技術手段[13]。在過去幾十年中,整個領域見證了單顆粒法所解析結構分辨率的持續改進,從上世紀末的亞納米分辨率,到2008年的近原子分辨率,以及2010年的原子分辨率[13,18]。

2013年12月份,程亦凡和D.Julius 合作發表在Nature上的2篇文章,在結構生物學領域造成了巨大的反響。他們首次運用單顆粒法獲得了膜蛋白TRPV1的3.4 ?分辨率結構,并成功搭建了該大分子的原子模型,標志著冷凍電鏡單顆粒法進入了一個新的時代[19-20]。一項革命性的技術運用到了他們的工作中,即基于互補金屬氧化物半導體(complementary metal oxide semiconductor,CMOS)的直接電子探測器(direct electron detection device,DDD)。在DDD出現之前的圖像收集通過感光底片或者電荷耦合元件(charge-coupled device,CCD)相機來完成,兩種方法都有其致命缺點。使用感光底片時,為了積累足夠的信息,一張底片的曝光時間約為1 s。因此,電子照射引起的樣品漂移就會積累在圖像中,引起圖像細節的模糊。同時,底片的檢測量子效率(detective quantum efficiency,DQE)也低于DDD的DQE。使用CCD時,雖然可以通過多次短時曝光消除過大漂移引起的圖像模糊,但是由于CCD特有的成像原理,經過了電子-光子-電子的二次轉換,使得CCD在中高分辨率范圍的DQE大大低于DDD[21]。因此,底片和CCD收集的圖像數據在高分辨率范圍的數據質量都低于DDD圖像數據。

直接電子探測器硬件技術的進步推動了軟件算法的革新。電子輻射引起的樣品漂移可以通過MotionCorr[22]和Unblur[23]軟件進行校正,使得長時間低劑量曝光成為可能,這正是被普遍認為的提高DQE的關鍵[24-26]?；诟咝阅苡嬎銠C集群、以及后來出現的基于圖形處理器(graphics processing unit,GPU)加速工作站的數據處理軟件Relion[27]和Frealign[28],在大大減少計算機時的同時,也體現了數據處理的可視化和用戶友好化的發展趨勢。

隨著硬件和軟件的相互促進,單顆粒法大大拓寬了結構生物學的研究對象,尤其是之前難以獲得晶體的膜蛋白和大分子量的蛋白復合物[29-30]。同時,單顆粒法所解析結構的分辨率也在不停被刷新。2015年,20S蛋白酶體的冷凍電鏡結構達到了2.8 ?的高分辨率[31]。同一年,β-半乳糖苷結構的分辨率達到了2.2 ?[32]。2016年,冷凍電鏡單顆粒法所能解析結構的極限分辨率更是被推進到了1.8 ?的較高原子分辨率水平[33]。一般來講,大分子的分子量越小,越難以解析高分辨結構,比如1.8 ? 分辨率的谷氨酸脫氫酶的分子量為334 kD,而分子量為145 kD的乳酸脫氫酶和 93 kD的異檸檬酸脫氫酶通過同樣的方法,解析所得結構的分辨率分別只有2.8 ? 和3.8 ?[33]。在提高冷凍電鏡數據圖像信噪比、提高單顆粒法三位重構結構分辨率方面,尤其是解析較小分子量樣品時,與傳統基于欠焦的方法相比,相位板技術展現出了不可比擬的優勢,已經成功解析分子量只有64 kDa的人類血紅蛋白的3.2 ? 原子分辨率結構[34]。所有這些進步使得冷凍電鏡單顆粒法成為高分辨率生物大分子結構解析中,可以與X射線晶體學相媲美的快速、經濟的測定方法。

電子斷層掃描成像技術 1970年,在單顆粒法提出兩年之后,同樣是A.Klug和D.De Rosier 發展了電子斷層掃描成像技術[35]。該方法通過在電子顯微鏡內將樣品傾轉至不同角度,獲取同一區域多個角度的投影圖來重構所研究對象的三維結構[36]。電子斷層成像使用尺度非常廣泛,從分子水平的蛋白質大分子,到亞細胞水平的細胞器,甚至細胞水平的組織結構等。雖然,在目前技術水平下,該方法還不能獲得核磁共振波譜法、X射線晶體學和冷凍電鏡單顆粒法等所能獲得的高分辨率結構,但是它有效填補了以上高分辨率結構與光學顯微鏡地分辨率結構之間的中等分辨率水平細胞整體圖像的空白。

冷凍電子顯微學的獨特優勢

自然生理狀態 冷凍電鏡快速冷凍技術,將懸浮在水溶液中的樣品,快速冷凍至深冷溫度。由此,保存在玻璃態冰層中的生物樣品保留了生物樣品在溶液中的狀態,更接近其在細胞中的自然生理狀態[15]。

樣品需求量少 冷凍電鏡樣品需求量非常少。比如單顆粒法,制備1個冷凍樣品只需體積3 μL濃度為1～10 μg/μL的溶液。如果生物大分子的結構均一性比較好,一般只需幾萬至幾十萬單個顆粒,就可以通過單顆粒法重構其高分辨結構[19-20]。而對于具有二十面體結構(12個等價頂點,每個頂點具有5重旋轉對稱性,總60重對稱性)的病毒顆粒,只需幾千個顆粒就可重構其原子分辨率結構[37]。這與核磁波譜法和X射線晶體法需要大量樣品形成了鮮明對比。

樣品均一性要求比較低 與核磁波譜法和X射線晶體法分析所得樣品統計平均信息不同,冷凍電鏡法通過電子顯微鏡將生物大分子通常放大幾萬至幾十萬倍,并收集其單個顆粒的數字化圖像。因此,數據處理軟件可以將單個顆粒與其他顆粒進行比對,根據相似性,一定程度上(受限于分辨率)區分出不同組成甚至不同構象的顆粒類型,分別重構出相應組成或構象顆粒的高分辨結構。從而,對樣品的均一性要求比核磁波譜法和X射線晶體法的要求要低。并且,由于單顆?？赡芡瑫r重構大分子在同一批次樣品中的不同組成或構象,有助于我們理解大分子的熱力學及動力學信息[38]。

研究對象廣泛 核磁波譜法所分析的生物大分子的分子量一般不超過50 kD,而獲得大分子晶體是X射線晶體學一直面臨的最大挑戰和限制[11],使得這兩種結構生物學方法具有不可避免的限制性。而冷凍電鏡方法可以研究的對象十分廣泛,從分子水平的蛋白質大分子,到亞細胞水平的細胞器,甚至細胞水平的組織結構等。其中,單顆粒法所能解析高分辨大分子的分子量,不斷在突破上限和下限。目前,分子量下限為64 kD的人類血紅蛋白的3.2 ? 原子分辨率結構[34],以及上限約為50 000 kD的T4噬菌體的3.3 ? 原子分辨率結構已經被成功解析[39]。

冷凍電子顯微學的挑戰和前景由于DDD元件的應用,冷凍電鏡法在過去5年內所解析的高分辨結構數量遠遠超過了自誕生以來至DDD技術之前50年的總和。但是,隨著冷凍電鏡學研究的深入,對該學科各項技術提出了更高的要求。一些技術難點逐漸凸顯,成為制約其發展的瓶頸。

冷凍樣品制備 高純度生物大分子樣品提純分離之后,冷凍樣品的制備一直是冷凍電鏡學中至關重要的一步,尤其是對分辨率結果要求比較高的單顆粒法。冷凍制樣技術[15]自從30年前發明以來沒有實質性的革新,實驗條件的通用性和重現性都較差。首先,樣品溶液與負載碳膜的相互作用受溶液的緩沖液種類、活性劑或添加劑、大分子性質和濃度等因素的制約,決定了是否能夠制備冰層厚度適中、厚薄均一的冷凍樣品。其次,大分子在冰層中的分布是否均勻無聚集,是否有利于分布在冰層孔洞中而不是較厚承載碳膜上,統計上來講所有顆粒是否有擇優取向等,對數據質量的影響舉足輕重[40]。在替代性冷凍樣品制備方法研究方面,Carragher博士及同事一直走在同行的前面[41],并積極研發極微量皮升量級(目前通用3 μL的百萬分之一)噴墨式制樣技術。而冷凍聚焦粒子束技術使得觀察生理狀態細胞內局部區域的高分辨結構成為可能[42]。

電子光學成像技術 亞埃尺度的材料科學超高分辨率研究在過去十幾年取得了長足的進步,配備了色差矯正和球差矯正的透射電鏡可以達到0.5 ?的水平[43]。而在冷凍電鏡進行生物樣品的結構解析中,使用了球差校正技術所收集數據只是突破了3 ?[44]。因為冷凍樣品冰層厚度的限制,使得色差矯正或球差矯正并不能發揮其應有的作用。但是,在增強信噪比方面,Volta相位板的使用在提高分辨率水平方面具有明顯促進的作用[34,45-46]。該技術的升級或者新型相位板的開發和使用,會進一步提高信噪比提高分辨率水平。

體內環境細胞結構研究 不管是核磁波譜法,X射線晶體法,還是冷凍電鏡單顆粒法,這幾種結構生物學的研究方法都通用分離純化體外環境的生物大分子的方法,解析其三維結構,來理解大分子在生物學過程中的重要作用。冷凍電鏡中的電子斷層掃描成像技術是唯一可以讓我們直接觀察細胞內或體內大分子的結構。但是,其分辨率受限于10 ?左右[46],無法達到原子分辨率。主要原因是,電子斷層掃描的樣品選用同一區域來收集約100張不同傾轉角度的圖像,為了防止任何一張傾轉圖過度曝光,每一張圖像的信號強度都比較小。這就限制了圖像的信噪比。同時,即使選擇很小的角度增量,同一區域所能收集的傾轉圖像還是有限的。因此無法通過疊加大批量的數據來增強信噪比。這兩個原因都決定了相位板等圖像信噪比增強技術的任何進步,都會大大推動電子斷層掃描成像技術的分辨率水平。

復旦大學冷凍電鏡平臺建設規劃及進展復旦大學生物醫學研究院于2013年底向復旦大學提議,建設高分辨冷凍電鏡平臺。經過認真調研和專家論證等過程,復旦大學于2015年底正式批復,投入近7 000萬人民幣建設完備的冷凍電鏡平臺,積極引進相關人才。2016年底完成設備招標與合同簽訂,2017年底所有設備到貨。整個過程中得到了復旦大學各級校領導和職能部門的高度重視和大力支持。

我校擬建設的高分辨冷凍電鏡平臺主要包括3臺冷凍電鏡及附屬設備和高性能計算機集群。其中電鏡包括1臺300 kV的Titan Krios透射電鏡,配備K2直接電子探測相機和能量過濾器,主要用于高分辨數據的采集;1臺200 kV的Talos Arctica透射電鏡,配備K2直接電子探測相機,主要用于冷凍電鏡樣品的篩選和部分數據采集;1臺120 kV的Talos 120電鏡,主要用于樣品的初步篩選和制樣條件優化。這3臺設備互為補充,能夠使高端產品(300 kV電鏡)充分發揮功效而不浪費機時,這是目前國內外搭建冷凍電鏡平臺普遍采用的方案。高性能計算機集群投入450萬人民幣,搭建高速讀寫優化的整體框架,包括1 000個核的CPU計算系統和6個GPU節點(每個節點含4塊Tesla P100顯卡)及200 T的存儲服務器,用于存儲處理電鏡系統所產生的大量數據和后續的結構解析。

該平臺為復旦大學公共技術平臺的組成部分,委托生物醫學研究院(Institutes of Biomedical Sciences)代為籌建管理。擬放置于正在建設的復旦大學醫學院科研2號樓地下3層,占地面積約500平方米。該設備對震動、電磁信號干擾、溫度變化等因素都非常敏感,因此對設備所在的環境提出了非常高的要求。為了使設備能夠以最佳狀態運作,復旦大學醫學院工程建設指揮部、工程建設承擔單位、生物醫學研究院、冷凍電鏡相關設備供應商(FEI公司和Gatan公司等)指定專門人員,根據設備要求對2號樓相關空間進行了充分的論證,從而確定了最優方案。目前低端120 kV的電鏡和高性能計算機集群系統已經在生物醫學研究院安裝完成,處于試運行階段。待科研2號樓工程竣工,即可開展房間裝修和設備安裝調試,預計于2018年底投入試運行。

該平臺面向復旦大學所有用戶,并保證部分機時以滿足對外服務。運行維護團隊將包括由2～3位精通冷凍電鏡系統的專家組成的指導小組,2位高級工程師和2位中高級工程師。擬提供24 h服務,全年除重要節假日和儀器維護時間外均對外開放。

總結冷凍電子顯微學研究開始于1974年,經過了幾十年的發展,于本世紀初第一次實現了原子分辨率結構的成功解析。2013年的革命性技術突破以及過去幾年的快速發展,奠定了冷凍電鏡尤其是單顆粒法在結構生物學中不可或缺的地位。隨著冷凍電鏡研究的深入開展,一些技術難點逐漸凸顯。世界各地的研究組圍繞這些問題開展的創新性研究,已經在冷凍樣品制備、電子光學成像和體內環境細胞結構研究等方面展現出了良好的發展前景。

[1] BANASZAK LJ.Foundations of structural biology[M].Burlington:Elsevier,2000.

[2] THORNTON JM,TODD AE,MILBURN D,etal. From structure to function:approaches and limitations[J].NatStructBiol,2000,7(Suppl):991-994.

[3] SALI A,GLAESER R,EARNEST T,etal.From words to literature in structural proteomics[J].Nature,2003,422(6928):216-225.

[4] SAUNDERS M,WISHNIA A,KIRKWOOD JG.The nuclear magnetic resonance spectrum of ribonuclease[J].JAmChemSoc,1957,79:3289-3290.

[5] MARION D.An introduction to biological NMR spectroscopy[J].MolCellProteomics,2013,12(11):3006-3025.

[6] KENDREW JC,BODO G,DINTZIS HM,etal.A three-dimensional model of the myoglobin molecule obtained by x-ray analysis[J].Nature,1958,181(4610):662-666.

[7] KENDREW JC,DICKERSON RE,STRANDBERGBE,etal.Structure of myoglobin:A three-dimensional Fourier synthesis at 2? resolution[J].Nature,1960,185(4711):422-427.

[8] PERUTZ MF,ROSSMANN MG,CULLIS AF,etal.Structure of haemoglobin:a three-dimensional Fourier synthesis at 5.5-? resolution,obtained by X-ray analysis[J].Nature,1960,185(4711):416-422.

[9] ROSSMANN MG,BLOW DM.The detection of sub-units within the crystallographic asymmetric unit[J].ActaCryst,1962,15:24-31.

[10] SHI Y.A glimpse of structural biology through X-ray crystallography[J].Cell,2014,159(5):995-1014.

[11] RHODESG.Crystallography made crystal clear:A guide for users of macromolecular models[M].3rd Edition.Cambridge:AcademicPress,2006.

[12] FRANK J.Three-dimensional electron microscopy of macromolecular assemblies:visualization of biological molecules in their native state[M].Oxford:OxfordUniversityPress,2006.

[13] ZHOU ZH.Atomic resolution cryo electron microscopy of macromolecular complexes[J].AdvProteinChemStructBiol,2011,82:1-35.

[14] TAYLOR KA,GLAESER RM.Electron diffraction of frozen,hydrated protein crystals[J].Science,1974,186(4168):1036-1037.

[15] ADRIAN M,DUBOCHET J,LEPAULT J,etal.Cryo-electron microscopy of viruses[J].Nature,1984,308(5954):32-36.

[16] HENDERSON R,BALDWIN JM,CESKA TA,etal.Model for the structure of bacteriorhodopsin based on high-resolution electron cryo-microscopy[J].JMolBiol,1990,213(4):899-929.

[17] DE ROSIER D,KLUG A.Reconstruction of three dimensional structures from electron micrographs[J].Nature,1968,217(5124):130-134.

[18] ZHANG X,JIN L,FANG Q,etal.3.3 A cryo-EM structure of a nonenveloped virus reveals a priming mechanism for cell entry[J].Cell,2010,141(3):472-482.

[19] LIAO M,CAO E,JULIUS D,etal.Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy[J].Nature,2013,504(7478):107-112.

[20] CAO E,LIAO M,CHENG Y,etal.TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms[J].Nature,2013,504(7478):113-118.

[21] BAMMES B,ROCHAT R,JAKANA J,etal.Direct electron detection yields cryo-EM reconstructions at resolutions beyond 3/4 Nyquist frequency[J].JStructBiol,2012,177(3):589-601.

[22] LI X,MOONEY P,ZHENG S,etal.Electron counting and beam-induced motion correction enables near atomic resolution single particle cryoEM[J].NatMethods,2013,10(6):584-590.

[23] BRILOT AF,CHEN JZ,CHENG A,etal.Beam-induced motion of vitrified specimen on holey carbon film[J].JStructBiol,2012,177(3):630-637.

[24] MCMULLAN G,CHEN S,HENDERSON R,etal.Detective quantum efficiency of electron area detectors in electron microscopy[J].Ultramicroscopy,2009,109(9):1126-1143.

[25] MCMULLAN G,FARUQI AR,HENDERSON R,etal.Experimental observation of the improvement in MTF from backthinning a CMOS direct electron detector[J].Ultramicroscopy,2009,109(9):1144-1147.

[26] MCMULLAN G,CLARK AT,TURCHETTA R,etal.Enhanced imaging in low dose electron microscopy using electron counting[J].Ultramicroscopy,2009,109(12):1411-1416.

[27] KIMANIUS D,FORSBERG B,SCHERES S,etal.Accelerated cryo-EM structure determination with parallelisation using GPUs in relion-2[J].eLife,2016,5:e18722.

[28] LYUMKIS D,BRILOT AF,THEOBALD DL,etal.Likelihood-based classification of cryo-EM images using FREALIGN[J].JStructBiol, 2013,183(3):377-388.

[29] PARK E,CAMPBELL E,MACKINNON R.Structure of a CLC chloride ion channel by cryo-electron microscopy[J].Nature,2017,541(7638):500-505.

[30] CHEN S,ZHAO Y,WANG Y,etal.Activation and desensitization mechanism of AMPA receptor-TARP complex by cryo-EM[J].Cell,2017,170 (6):1234-1246.

[31] CAMPBELL M,VEESLER D,CHENG A,etal.2.8 ? resolution reconstruction of the Thermoplasma acidophilum 20S proteasome using cryo-electron microscopy[J].eLife,2015,4:e06380.

[32] BARTESAGHI A,MERK A,BANERJEE S,etal.2.2 ? resolution cryo-EM structure of β-galactosidase in complex with a cell-permeant inhibitor[J].Science,2015,348(6239):1147-1151.

[33] MERK A,BARTESAGHI A,BANERJEE S,etal.Breaking cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery[J].Cell,2016,165(7):1698-1707.

[34] KHOSHOUEI M,RADJAINIA M,BAUMEISTER W,etal.Cryo-EM structure of haemoglobin at 3.2 ? determined with the Volta phase plate[J].NatCommun,2017,30(8):16099.

[35] CROWTHER R,DE ROSIER D,KLUG A.The reconstruction of a three-dimensional structure from projections and its application to electron microscopy[J].ProcRSocLondBBiolSci,1972,182(1066):89-102.

[36] SUBRAMANIAM S,ZHANG P,LEFMAN J,etal.Electron tomography:a powerful tool for 3D cellular microscopy[J].ASMNews,2003,69(5):240-245.

[37] ZHANG X,GE P,YU X,etal. Cryo-EM structure of the mature dengue virus at 3.5-? resolution[J].NatStructMolBiol,2013,20(1):105-110.

[38] FRANK G,SHUKLA S,RAO P,etal.Cryo-EM analysis of the conformational landscape of human P-glycoprotein (ABCB1) during its catalytic cycle[J].MolPharmacol,2016,90(1):35-41.

[39] CHEN ZG,SUN L,ZHANG Z,etal.Cryo-EM structure of the bacteriophage T4 isometric head at 3.3-? resolution and its relevance to the assembly of icosahedral viruses[J].ProcNatlAcadSci,2017,114(39):E8184-E8193.

[40] THOMPSON R,WALKER M,SLEBERT CA,etal.An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology[J].Methods,2016,100:3-15.

[41] JAIN T,SHEEHAN P,CRUM J,etal.Spotiton:A prototype for an integrated inkjet dispense and vitrification system for cryo-TEM[J].JStructBiol,2012,179(1):68-75.

[42] RIGORT A.Recent developments in FEI’sinsitucryo-electron tomography workflow[J].NatMethods,2016,13:3-4.

[43] TIEMEIJER PC,BISCHOFF M,FREITAG B,etal.Using a monochromator to improve the resolution in TEM to below 0.5 ?.Part II:application to focal series reconstruction[J].Ultramicroscopy,2012,118:35-43.

[44] FISCHER N,NEUMANN P,KONEVEGA A,etal.Structure of theE.coliribosome-EF-Tu complex at lt;3 ? resolution by Cs-corrected cryo-EM[J].Nature,2015,520(7548):567-570.

[45] DANEV R,BUIJSSE B,KHOSHOUEI M,etal.Volta potential phase plate for in-focus phase contrast transmission electron microscopy[J].ProcNatlAcadSciUSA,2014,111(44):15635-15640.

[46] KHOSHOUEI M,PFEFFER S,BAUMEISTER W,etal.Subtomogram analysis using the Volta phase plate[J].JStructBiol,2017,197(2):94-101.

Resolutionrevolution:advancesandprospectsofcryo-EMinstructuralbiology

CHEN Zhen-guo1,2, XU Yan-hui1,3△

(1InstitutesofBiomedicalSciences,FudanUniversity,Shanghai200032,China;2ShanghaiFifthPeople’sHospital,FudanUniversity,Shanghai200240,China;3ShanghaiCancerCenter,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

Cryo electron microscopy (cryo-EM) is one of the most important methods in structural biology.In the past five years,cryo-EM has milestone breakthrough due to revolutionary advances in hardware and methodology.The resolution has been pushed to as high as 1.8 ?,which significantly extended the research scope of this method.Single particle reconstruction method has become one of the most exciting fields of structural biology and related subjects.Here we will briefly introduce the history of cryo-EM,recent revolutionary breakthrough,and the facility at Fudan University.

cryo electron microscopy; structural biology; single particle reconstruction

Q617

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2017.06.017

國家重點研發計劃(2016YFA0500700)

△Corresponding author E-mail:xuyh@fudan.edu.cn

*ThisworkwassupportedbytheMinistryofScienceandTechnologyofChina(2016YFA0500700).

2017-10-08;編輯:張秀峰)