白斑綜合征病毒膠體金免疫層析試劑板的研制

劉長軍 ，王振國 ，陳青舟 ，夏武強 ，繆翁晟途 ，平夏婷

（1.象山縣海洋與漁業質量技術檢測中心，浙江 寧波 315700；2.杭州南開日新生物技術有限公司，浙江 杭州 311215）

白斑綜合征病毒膠體金免疫層析試劑板的研制

劉長軍1，王振國2，陳青舟2，夏武強1，繆翁晟途2，平夏婷2

（1.象山縣海洋與漁業質量技術檢測中心，浙江 寧波 315700；2.杭州南開日新生物技術有限公司，浙江 杭州 311215）

將膠體金免疫層析技術應用于對蝦白斑綜合征的診斷，研制了一種檢測對蝦中白斑綜合征病毒的膠體金免疫層析試劑板。將膠體金標記的抗白斑綜合征病毒單克隆抗體包被在金標墊上，將抗白斑綜合征病毒多克隆抗體和羊抗鼠IgG分別包被在硝酸纖維素膜的檢測線和質控線上。通過雙抗體夾心法檢測樣品中白斑綜合征病毒含量。結果表明，該試劑板對白斑綜合征病毒的最低檢出限為1.0 mg/kg，特異性好，穩定性高，整個檢測所需時間為8～10 min，適合現場快速檢測。

白斑綜合征病毒；雙抗體夾心法；免疫層析；膠體金

白斑綜合征（White Spot Syndrome，簡稱 WSS）是由白斑綜合征病毒（White Spot Syndrome Virum，簡稱WSSV）引起的一種對蝦嚴重傳染性疾病，典型癥狀為病蝦頭胸甲內側出現不同大小的白色斑點。該病發病快、病死率高、傳播速度快、宿主范圍廣，對對蝦養殖造成了嚴重的經濟損失[1]。WSS還被列入了世界動物衛生組織（OIE）水生動物疫病名錄[2]。在2008年我國農業部第1125號公告《一、二、三類動物疫病病種名錄》中，WSS被劃為一類動物疫病[3]。

目前尚未發現有效的治療WSS的方法，因此發展快速、靈敏、穩定的WSSV檢測技術成為科研人員研究的重點。通過有效的檢測技術，對蝦養殖戶可盡早采取預防措施，切斷傳播途徑，最大限度地減少生產上的損失。近年來，WSSV檢測的方法發展迅速，主要有：肉眼觀察法，電鏡觀察法，生化檢測、免疫學方法，細胞培養法，分子生物學法等。Numan等[4]采用巢式PCR進行WSSV的引物設計，實驗結果與實時熒光定量PCR相比靈敏度得到較大的提高，檢出限為1拷貝的WSSV。鄭曉聰等[5]選用抗WSSV單克隆抗體包被ELISA板，用兔多抗作為捕獲抗體，建立了具有良好特異性和敏感性的雙抗體夾心法用于WSSV的檢測。張玲[6]研發的白斑綜合征病毒膠體金免疫層析半定量快速檢測試紙條將不同類型的WSSV單克隆抗體混合后包被于試紙條檢測線，用來檢測樣本中的WSSV，實驗結果表明該試紙條在WSSV濃度為783 ng/mL～6.26μg/mL范圍內可實現半定量檢測。研究采用WSSV制備單克隆抗體與多克隆抗體，成功建立了檢測WSSV的雙抗體夾心法膠體金免疫層析試劑板。相比于現有的檢測方法，即簡化了操作流程，又縮短了檢測時間，適用于快速現場檢測。對實現病原的快速篩查，病情的防治有很大的促進作用。

1 材料與方法

1.1 材料

對蝦白斑綜合征病毒（WSSV），傳染性肌肉壞死病毒（Infection Myonecrosis Virus，IMNV）、桃拉綜合征病毒（Taura Syndrome Virus，TSV）、鯉春血癥病毒（Spring Viraemia of Cup Virus，SVCV）、病毒性出血性敗血癥病毒（Viral Haemorrhagic Septicaemia Virus，VHSV）均由本實驗室分離、鑒定、保存。家兔、BALB/c小鼠、ICR小鼠購自浙江大學動物實驗中心。小鼠骨髓瘤細胞SP2/0由本實驗室保存。健康對蝦，10～20 g/尾，購于農貿市場。

1.1.1 試劑

氯金酸 （HAuCl4·4H2O）、聚乙二醇 20000（PEG20000）、聚乙二醇 40000（PEG40000）和羊抗鼠IgG、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購于Sigma公司；DMEM培養基、HAT和HT選擇性培養基購于HyClone公司；硝酸纖維素膜（NC）、膠體金結合墊、樣品墊、吸水墊購于Millipore公司。白斑綜合征病毒ELISA試劑盒購于北京綠源伯德生物技術有限公司。

1.1.2 儀器

BioJet XYZ3000型點膜儀購于美國BioDot公司、Avanti J－26 XP高速冷凍離心機購于美國Beckman公司、恒溫鼓風干燥箱購于上海精宏實業設備有限公司、切割機購于杭州市恒通設備有限公司、78HW－1恒溫磁力攪拌器購于杭州儀表電機有限公司。

1.2 方法

1.2.1 抗WSSV單克隆抗體制備

1.2.1.1 動物免疫 取適量WSSV與弗氏完全佐劑等量混合乳化，皮下注射BALB/c小鼠（抗原蛋白量為100μg/只）。初次免疫兩周后，WSSV與弗氏不完全佐劑混合乳化免疫BALB/c小鼠，免疫方法同上。之后免疫不再加佐劑，分別在第6周及融合前3 d腹腔再加強免疫一次。

1.2.1.2 細胞融合 先將免疫小鼠的脾細胞與SP2/0混合于融合管內，1 000 r/min下離心10 min，除去上清液，底層細胞輕振松散后再置于37℃水浴中預熱。再向細胞邊緩慢滴加已預熱的PEG4000溶液1 mL邊進行攪拌，然后緩慢加入不完全DMEM培養基，終止融合。靜置10 min后1 000 r/min下離心10 min，除去上清液，然后加入HAT培養基，使細胞懸浮并混勻。加入預先制備的ICR小鼠的腹腔巨噬細胞，充分混勻后分裝至96孔細胞培養板。于6%CO2培養箱內培養至第4～5天每孔各補加1滴HAT培養基，至第9～10天用HT培養基取代HAT培養基，上清液變黃后開始檢測篩選。

1.2.1.3 陽性克隆的篩選及建株 用ELISA試劑盒檢測細胞上清液中的抗WSSV抗體。按常規方法進行，將實驗結果為陽性的細胞擴大培養并及時凍存，同時按有限稀釋法進行亞克隆2～3次，直至每孔的陽性率為100%時才可定株[8]。

1.2.1.4 腹水的制備及純化 抗WSSV單克隆抗體細胞株復蘇并將其轉入培養瓶中，培養至2×107注入小鼠腹腔內（提前一周每只BALB/c健康小鼠腹腔內注射0.5 mL無菌液體石蠟），10～12 d小鼠出現腹部明顯膨大，處死小鼠收集腹水。用60 mM pH 4.2的醋酸鹽緩沖液4倍稀釋，加腹水體積1/10的辛酸，攪拌30 min。12 000 r/min離心20 min取上清液。用1N NaOH調節上清液pH值至7.2，加硫酸銨至33%飽和度，12 000 r/min離心20 min，沉淀溶解于0.01 M pH值為7.2的PBS緩沖液中。最后透析除鹽得到抗WSSV單克隆抗體，置－80℃備用[9]。

1.2.2 WSSV多克隆抗體的制備 采用常量免疫法。調整WSSV的蛋白濃度，免疫量為1 mg/只，采用相應程序共免疫6次。初次免疫后每隔2周加強免疫一次。最后一次免疫后2周，耳靜脈采血，分離血清，用ELISA試劑盒檢測抗體效價。效價達1∶5 000以上時，通過頸動脈放血，收集全血，分離血清。用辛酸－飽和硫酸銨法提取IgG，得到抗WSSV多克隆抗體，置－80℃備用[5]。

1.2.3 金標抗體的制備

1.2.3.1 膠體金的制備 將實驗需要的所有玻璃器皿清洗干凈。先用自來水清洗干凈，然后在重鉻酸鉀洗液中浸泡過夜，最后依次使用自來水、蒸餾水、超純水沖洗5次。在56℃烘箱中烘干備用。取0.01%氯金酸溶液100 mL加熱2 min至沸騰，邊攪拌邊加入1%檸檬酸三鈉水溶液1 mL，繼續煮沸10 min至酒紅色后冷卻，加蒸餾水恢復到原體積，冷卻后用0.22μm濾膜過濾雜質，4℃保存備用[10]。

1.2.3.2 膠體金標記單克隆抗體 取已制備好的膠體金溶液100 mL，用0.1 mol/L的K2CO3溶液調節pH值至8.0。邊攪拌邊添加抗WSSV單克隆抗體直至膠體金溶液恢復酒紅色，并在10 min內不褪色。共加入抗WSSV單克隆抗體1.5 mg。磁力攪拌器上攪拌20 min，再逐滴加入2 mL 25 g/L PEG20000，攪拌15 min。20 000 r/min離心15 min，除去上清液，用10 mL pH值7.4的PBS緩沖液（含0.4 g/L PEG20000）清洗2次。將沉淀物用5 mL含質量濃度為20 g/L BSA的PBS緩沖液（pH值7.4）溶解，過0.22μm無菌過濾器，4℃保存備用[12]。

1.2.4 試劑板的組裝

將樣品墊（玻璃纖維）用含2%BSA、2.5%蔗糖、1%吐溫－20、0.3%PVP－k30 以及 0.02%NaN3的0.002 mol/L的硼酸溶液緩沖液（pH值7.4）封閉，于37℃溫箱中干燥[11]。用點膜儀將制備好的金標抗體噴涂到玻璃纖維上，噴膜量為1μL/cm。立即放入冷凍真空干燥機中抽干。抗WSSV多克隆抗體和羊抗鼠IgG用 0.01 mol/L PBS（pH 值 7.2）稀釋至 2 mg/mL，用點膜儀分別噴涂在NC膜上作為檢測線（T線）和質控線（C線），噴膜量為1μL/cm。樣品墊、金標結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊按順序黏貼于PVC背襯上。用切割機將貼好的板切割成4 mm寬的細條，裝入塑料模板中制成檢測試劑板，然后放入帶干燥劑的鋁箔袋中密封。試劑板組成如圖1所示。

圖1 膠體金免疫層析試紙條組成

1.2.5 樣品檢測操作

取出檢測試劑板，用滴管吸取待檢樣品溶液，滴加2滴于加樣孔中，加樣后開始計時：結果應在3～5 min讀取，其他時間判讀無效；讀取結果。若試劑板上T線與C線均顯色，結果為陽性；若試劑板僅C線出現紫紅色而T線未顯色，結果為陰性；若試劑板上C線與T線均為顯色，結果無效，需要重新檢測。檢測結果如圖2所示。

圖2 檢測結果示意圖

1.2.6 檢出限檢測

稱取健康對蝦（PCR檢測無WSSV感染）的蝦鰓 2 g，加入 WSSV 溶液至終濃度為 0.25、0.5、0.75、1.0、2.0、4.0 mg/kg，再加入 0.01 M PBS 按 1 ∶10（W/V）的比例混合，加少量石英砂用研缽研磨、勻漿1 min，再沉淀5～10 min，取上清液作為加標檢測樣品，用1.2.4制備的試劑板分別對其進行檢測，陰性對照為0.01 mol/L PBS溶液。每組設6個平行樣。

1.2.7 特異性檢測

按照上述方法將 IMNV、TSV、SVCV、VHSV 四種病毒加入健康對蝦的蝦鰓中配置成加標檢測樣品，陽性對照為WSSV加標檢測樣品，濃度均與1.2.6測定的檢出限相同。陰性對照為0.01 mol/L PBS溶液。用1.2.4制備的試劑板分別對其進行檢測，每組設6個平行樣。

1.2.8 試劑板檢測與ELISA的符合率

取健康對蝦蝦鰓樣本20份，其中10份加入WSSV制成陽性樣本，另外10份加入0.01 mol/L PBS溶液制成陰性樣本。分別使用ELISA試劑盒及試劑板檢測WSSV的含量比較兩者的符合率。

1.2.9 穩定性檢測

取3個不同批次的試紙條在20～25℃條件下連續放置 12 個月，期間于生產當天、1、2、3、6、9、12個月分別從3個批次產品中抽取檢測試劑卡檢測陽性和陰性樣品各50份，測定檢出限、假陽性率和假陰性率。

2 結果與分析

2.1 檢出限

將陰性對照以及WSSV終濃度為0.25、0.50、0.75、1.0、2.0、4.0 mg/kg 的加標檢測樣品，用試劑板進行測定。每個試樣做6個重復，3～5 min后觀察結果，檢測線顏色呈梯度遞增，實驗結果如圖3所示。在陰性對照及WSSV終濃度為0.25、0.50 mg/mL范圍內，C線顯色而T線不顯色；0.75 mg/mL濃度下C線顯色，T線條帶模糊；1.0～4.0 mg/kg范圍內T線與C線顯紫紅色，條帶清晰。實驗結果表明，該試劑板的WSSV檢測限為1.0 mg/kg。

圖3 膠體金試劑板的檢出限實驗結果

2.2 特異性

將 IMNV、TSV、SVCV、VHSV 四種病毒加入健康對蝦的蝦鰓中配置成1.0 mg/kg加標檢測樣品，用試劑板進行測定，判斷其檢測的特異性情況。其中陽性對照為終濃度為1.0 mg/kg的WSSV加標檢測樣品，陰性對照為0.01 mol/L PBS溶液。實驗結果如表1所示。試劑板對IMNV、TSV、SVCV、VHSV四種病毒反應呈陰性，實驗結果表明試劑板對WSSV具有較高的特異性。

表1 膠體金試劑板特異性實驗結果

2.3 符合率

用試劑板對含不同質量濃度的WSSV蝦鰓處理樣品進行檢測并與ELISA的檢測結果相比較。共檢測20份樣品，其中陰性樣品10份，陽性樣品10份，部分樣品檢測結果如表2所示：在WSSV濃度高于1.0 mg/kg時，試劑板的實驗結果為陽性；在WSSV濃度低于1.0 mg/kg時，試劑板實驗結果為陰性，均與ELISA實驗結果相符。所以該試劑板的定量檢測限為1.0 mg/kg。

2.4 試紙條穩定性

用同一批次不同檢測試劑檢測同一樣品，用不同批次檢測試劑檢測同一樣品，其質控線、檢測線的顯色時間及顏色深淺和最終結果判斷基本相同。將3個不同批次的試劑板在20～25℃條件下連續放置 12 個月，期間于生產當天、1、2、3、6、9、12 個月分別從3個批次產品中抽取檢測試劑卡檢測陽性和陰性樣品各50份，測定檢出限、假陽性率和假陰性率。實驗結果如表3所示。在12個月之內，試劑板的檢出限未發生變化，假陽性率和假陰性率在4%以下，為可接受范圍。因此試劑板能在室溫條件下（20～25℃）保存12個月。

3 結論與展望

試劑板用于對蝦蝦鰓中WSSV的檢測，靈敏度為1.0 mg/kg。具有特異性高、穩定性好、檢測時間短、操作簡便等特點。可用于對蝦中WSSV的現場快速檢測，為WSSV的預防和診斷提供依據。

表2 膠體金免疫層析試劑板與ELISA檢測結果比較

表3 膠體金免疫層析試劑板的穩定性試驗結果

試劑板的制備基于雙抗體夾心原理。金標結合墊上包被的抗WSSV單克隆抗體與T線上包被的抗WSSV多克隆抗體將樣本中的WSSV分別進行固定和截留，最終以T線與C線均顯色作為WSSV存在的判別標準。抗WSSV單克隆抗體與抗WSSV多克隆抗體的分離純化直接影響到最終產品的靈敏度，過柱是提高抗體純度的方法之一。谷萬港[13]在硫酸銨沉淀法的基礎上增加親和層析能親和柱進行抗VP28單克隆抗體（抗WSSV單克隆抗體的一種類型）的純化，但該方法會存在抗體消耗量大的問題，因此大批量制備時要考慮到其中的損益。在膠體金標記單克隆抗體的過程中，膠體金的顆粒大小和標記過程的pH值等均會對金標抗體的質量造成影響。本實驗中采用的膠體金制備方法使膠體金顆粒直徑在40μm，對于其抗體吸附能力和穩定性均能適應檢測的需要。為使膠體金pH值等于單克隆抗體等電點pH值，使膠體金與單克隆抗體結合最緊密，形成的金標抗體最穩定，本實驗用0.1 mol/L的K2CO3溶液精確地找到膠體金標記單克隆抗體的最佳pH值。但本實驗的適用對象固定在經濟作物對蝦，這就意味著對于其他宿主如蟹類、橈足生物等無法做到WSSV的準確檢測。因此在檢出限的設置方面可以再進行其他樣本的實驗，從而推廣其應用范圍。

目前，膠體金免疫層析技術在毒素檢測、抗生素檢測、重金屬檢測、微生物檢測、病毒檢測等領域都有應用。定性檢測向定量檢測的轉化，檢測儀器的跟進加快了膠體金快速檢測試劑的發展。操作方便、靈敏、快速等現場檢測方面的優點和低成本的特定優勢使其具有商業化的發展前景。

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[6]張玲.白斑綜合征病毒膠體金免疫層析半定量快速檢測試紙條的研制與應用[D].青島：中國海洋大學，2015.

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廣東湛江出口中國2017年首批輸澳生蝦

廣東湛江檢驗檢疫局2017年9月11日向媒體通報，中國2017年首批出口澳大利亞生蝦經湛江檢驗檢疫局檢驗合格后，目前正由湛江港裝船運往澳大利亞。

據了解，該批生蝦產品共6個貨柜，由廣東國美水產食品有限公司生產，重量97.64 t，貨值190.25萬美元。

湛江是中國水產品養殖、加工和出口大市，水產業形成了完整的產業鏈，并代表中國先后通過了美國、歐盟、韓國、日本、俄羅斯等國家和地區的水產品質量監控體系的考察評估，當地養殖的生蝦、活魚也實現了中國內地首次直供香港。

據介紹，2017年1月初，澳大利亞因國內發生白斑病綜合征病毒（WSSV）暫停各國生蝦進口，給包括湛江在內的中國水產品出口企業帶來嚴重損失，產業發展面臨困境。

為扭轉不利局面，湛江檢驗檢疫局主動應對，加強轄區養殖場疫病監測，提升產品質量，增強湛江水產品國際競爭力，并協助做好與澳方的溝通交涉，推動禁令解除。

（www.bbwfish.com）

Development of coloidal gold immunochromatographic plate for white spot syndrome virum

Liu Changjun1,Wang Zhenguo2,Chen Qingzhou2,Xia Wuqiang1,Miaoweng Shengtu2,Ping Xiating2
（1.Xiangshan Ocean and Fishery Quality and Technical Testing Center，Ningbo 315700，China；2.Hangzhou Nankai Biotech Co.，Ltd.，Hangzhou 311215，China）

A coloidal gold immunochromatographic plate for white spot syndrome virum in shrimp was developed.The colloidal gold conjugate pad combined anti－white spot syndrome virus monoclonal antibody.The anti－white spot syndrome virus polyclonal antibody and goat anti－mouse IgG were coated on test line and control line，respectively.White spot syndrome virum could be detected by this plate through double antibody sandwich method.The results of this paper showed that detection limit of the plate was 1.0 mg/kg，the specificity and the stability of the plate were high，and the results could be known just in 8～10 min.This plate was suitable for rapid detection in outdoors.

white spot syndrome virum；double antibody sandwich method；immunochromatographic；coloidal gold

S917

A

1004－2091（2017）10－0001－06

10.3969/j.issn.1004－2091.2017.10.001

杭州市科技發展計劃（20150432B34）

劉長軍（1978－），男，高級工程師，研究方向為生物檢測技術.E－mai:xs65763110@126.com

2017－01－09）