芳香化酶（P450arom）mRNA在黃鱔腦組織中的表達

張厚梅，王琳

（安徽生物工程學校，安徽 合肥 230031）

芳香化酶（P450arom）mRNA在黃鱔腦組織中的表達

張厚梅，王琳

（安徽生物工程學校，安徽 合肥 230031）

為了揭示芳香化酶與黃鱔性逆轉之間的內在聯系和作用機制，本研究以不同性別黃鱔的腦組織為試驗材料，采用實時定量PCR方法揭示P450arom mRNA在不同性別黃鱔的腦組織上的表達規律。實時定量PCR結果表明P450arom mRNA在雌性、雌雄間性、雄性黃鱔的腦組織中均有表達，其表達水平不斷下降?？傊?，黃鱔腦組織中的芳香化酶可能參與黃鱔的性逆轉過程，且與其性別轉化密切相關，推測黃鱔腦組織中的芳香化酶的表達水平高低對黃鱔的性逆轉可能起著決定性的作用。

黃鱔；芳香化酶；性逆轉

芳香化酶（P450arom）屬于細胞色素P450家族中的一員，是類固醇激素代謝中的關鍵酶，廣泛存在于大多數脊椎動物的腦和性腺中，它催化體內的雄激素轉化為雌激素[1－2]。除豬科動物外，絕大多數哺乳動物以及鳥類中，P450arom只有一種，由Cyp19單基因編碼[3]。魚類芳香化酶有性腺型（P450arom A）和腦型（P450arom B）兩種不同的形式。其中，P450arom A由Cyp19a基因編碼，主要在卵巢中表達；P450arom B則由Cyp19b基因編碼。主要在中樞神經系統表達[4－6]。研究表明，P450arom A參與雌激素生物合成和卵巢分化[7－9]。P450arom B在魚類腦中的活性是其在哺乳動物腦中的100～1 000倍[10]，一般認為它也參與性腺分化的調節。本實驗為了進一步研究芳香化酶對黃鱔性逆轉的作用機制，將采用分子手段分析芳香化酶基因在不同性別黃鱔腦組織的表達規律，探討芳香化酶對黃鱔性逆轉的調控機制。俞菊華[11]對黃鱔腦組織和性腺中P－450芳香化酶基因進行克隆并進行序列分析，結果發現它們的序列完全一致。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 2016年4—12月份，從安徽省肥西縣境內共采購活體野生黃鱔128尾，實驗室暫養，實驗時，黃鱔體質量為50～180 g。

1.1.2 主要試劑 SYBR Premix Ex TaqTM（DRR041A）購自大連寶生物工程有限公司，TransScript First－Strand cDNA Synthesis Super Mix、RNA 提取試劑 （TransZol）、High pure dNTPs、DL2000 DNA Marker購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 根據長度的不同，隨后分批進行解剖 收集黃鱔腦組織，于－80℃冷凍保存，用于實時定量PCR分析。

1.2.2 總RNA的提取和反轉錄 使用反轉錄試劑盒，按照TRIzol試劑盒抽提總mRNA操作說明進行反轉錄反應，總體積20μL，反應體系如下：2μL總 RNA、1 μL Anchored Oligo（dT）18、10 μL 2×TS Raction Mix、6 μL Rnase-free Water、1 μLTransS－cript RT Enzyme Mix，42℃孵育 50 min，70℃加熱15 min，反轉錄產物于 -20℃保存待用。β-actin、P450arom的引物序列參照Liu Jifang[12]文中的序列，并由上海生工生物有限公司合成，見表1。

1.2.3 實時熒光定量PCR 按以下比例濃度稀釋cDNA：1、1×10、1×102、1×103、1×104copies/L，進行實時熒光定量PCR操作，制作標準曲線和溶解曲線，建立最佳的反應條件。

表1 大鼠基因的PCR引物序列

上游引物 （10 μmol/L）1 μL；下游引物（10 μmol/L）1 μL；SYBR Premix Ex TaqTM 12.5 μL；cDNA 2μL；無核酶水8.5μL。反應條件為：94℃預變性30 s；52℃ 30 s，70℃ 60 s，30個循環。 將目的基因的CT值（Threshold cycle）與標準曲線的CT值相比較，作為目的基因mRNA的相對含量，每個樣本重復3次，以平均值表示最后結果。

1.2.4 統計分析 所有數據以“均數±標準差”表示，采用t檢驗，分析各組之間的差異顯著性。

2 結果

2.1 標準曲線與溶解曲線

對10倍系列稀釋的模板進行實時熒光定量PCR反應，得出擴增曲線（圖1），溶解曲線（圖2）和標準曲線（圖3）。結果表明，溶解曲線成單一峰，說明目的基因和內參基因的引物特異性很好，標準曲線成良好的線性關系，且目的基因和內參基因擴增效率基本一致，可采用2-△△CT值法計算P450arom mRNA的相對表達量。

圖 1 P450arom（A）、β -actin（B）基因的擴增曲線

圖 2 P450arom（A）、β-actin（B）基因的溶解曲線

圖 3 P450arom（A）、β-actin（B）基因的標準曲線

2.2 芳香化酶（P450arom）mRNA在黃鱔腦組織中的表達

在雌性、雌雄間性、雄性黃鱔腦組織中，其芳香化酶mRNA的表達水平逐漸下降（圖4）。

圖4 P450arom mRNA在黃鱔腦組織中的表達

3 討論與分析

芳香化酶是細胞色素P450家族中的一員，催化某些雄激素轉化為雌激素，是雌激素生物合成中的關鍵酶和限速酶，廣泛存在于大多數脊椎動物的腦和垂體中[13]。研究表明，芳香化酶參與非哺乳動物性腺分化的調控[14]。Wong TT[15]發現cyp19a1a的在性腺中的表達豐度與金頭鯛的性轉化密切相關。在鱸魚性轉化過程中，雌性鱸魚的腦組織中的芳香化酶cyp19a1bmRNA的表達水平顯著高于雄魚[16]。Zhang[17]發現性腺中的P450aromA在雌性時其表達水平最高，雌雄間性時下降，到雄性時達到最低水平，P450aromB在間性時最高。由此可見，芳香化酶參與魚類的性腺分化。黃鱔是一種具有天然單向性逆轉特性的動物，雌性成熟發育的第一個周期內黃鱔個體全部表現為雌性，性成熟產卵后，卵巢內卵細胞敗育，卵巢結構逐漸退化，與此同時雄性細胞開始發育，通過雌雄間性發育過渡到雄性發育。有研究表明芳香化酶參與黃鱔的性逆轉調控，Liu等[12]發現P450arom mRNA在雌性、雌雄間性、雄性黃鱔的性腺中的水平不斷下降，這充分說明芳香化酶與黃鱔性發育之間有著潛在的聯系。Makoto P.Matsuoka[18]發現在大西洋大比目魚的腦組織中P450arommRNA（cyp19a）的表達水平略高于性腺，腦組織中芳香化酶mRNA（cyp19b）的表達水平明顯高于性腺，這意味著魚類性別決定不僅與性腺中芳香化酶的表達水平有關，而且其在腦組織中的表達水平也可能與性別分化有關。目前，關于黃鱔的性逆轉與芳香化酶mRNA的表達水平的內在聯系仍較少報道。為了進一步探索黃鱔腦組織中芳香化酶的表達與黃鱔的性逆轉的內在聯系，本實驗采用RT-PCR研究芳香化酶基因在不同性別黃鱔腦組織和性腺的表達規律，結果顯示，在雌性、雌雄間性、雄性黃鱔腦組織中，其芳香化酶mRNA的表達水平逐漸下降，且其變化模式和在性腺中一致，這就意味著，黃鱔腦組織中的芳香化酶在其性逆轉中也發揮著重要作用。同時，這和Ju-Hua Yu[19]的研究結果有類似之處，Ju-Hua Yu發現在雌性黃鱔中，腦組織和性腺中有較高水平的表達，而在雄性黃鱔中僅在垂體和肝臟中有較低水平的表達，在腦組織中幾乎沒有表達。和Ju-Hua Yu的結果不同的是，本實驗發現在雄性黃鱔腦組織中芳香化酶mRNA仍有一定水平的表達，這可能與實驗的取材有關。Kwon JY等[20]發現在不同性別的尼羅羅非魚的腦組織中，芳香化酶mRNA的表達水平差異很小。Tzchori I[21]發現在不同性別的歐洲鰻的腦組織中，芳香化酶mRNA的表達水平幾乎沒有差異。這意味著魚類腦組織中芳香化酶的表達水平有種屬差異性。從圖上我們可以看出芳香化酶mRNA在黃鱔腦組織中的表達水平顯著高于性腺，這與Ju-Hua Yu的研究結果一致。同時，意味著黃鱔腦組織中的芳香化酶mRNA表達水平高低對黃鱔的性逆轉可能起決定性作用。

[1]Chardard D，Desvages G，Pieau C，et al.Aromatase activity in larval gonads of Pleurodeles waltl（Urodele Amphibia）during normal sex differentiation and during sex reversal by thermal treatment effect[J].General and Comparative endocrinology，1995，99（1）:100-107.

[2]Dong W，Wang L，Thornton C，et al.Benzo（a）pyrene decrease brain and ovarian aromatase mrna expression in Fundulus heterolitus[J].Aquatic Toxicology，2008，88（4）：289-300.

[3]Corbin C，Hughes A，Heffelfinger J，et al.Evolution of suiform aromatases:ancestral duplication with conversation of tissue-specific expression in the collared peccary（Pecari tayassu）[J].Molecular Evolution，2007，65（4）：403-412.

[4]Simpson E，Clyne C，Boon WC，et al.Aromatase-a brief overview[J].Annual Review Physiology，2002，64（1）：93-127.[5]Kishida M，Callard G.Distinct cytochrome P450 aromatase isoforms in zebrafish（Danio rerio）brain and ovary are differentilly programmed and estrogen regulated during early development[J].Endocrinology，2001，142（2）：740-750.

[6]Valle L，Ramina A，Vianello S，et al.Cloning of two mRNA variants of brain aromatase cytochrome P450 in rainbow trout（Oncorhynchus mykiss Walbaum）[J].The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology，2002，82（1）：19-32.

[7]Devlin R，Nagahama Y.Sex determination and sex differentiation in fish:an overview of genetic，physiological，and environmental influences[J].Aquaculture，2002，208（3）：191-364.

[8]Trant J，Gavasso S，Ackers J，et al.Developmental expression of cytochrome P450 aromatase genes（CYP19a and CYP19b）in zebrafish fry （Danio rerio）[J].The Journal of experimental zoology，2001，290（5）：475-483.

[9]Patil J，Gunasekern R.Tissue and sexually dimorphic expression of ovarian and brain aromatase mRNA in the Japanese medaka （Oryzias latipes）：Implications for their preferential roles in ovarian and neural differentiation and development[J].General and Comparative endocrinology，2008，158 （4）：131-137.

[10]ALephart E D.A review of brain aromatase cytochrome P450[J].Brain Research Reviews，1996，22（1）：1-26.

[11]俞菊華，吳婷婷，李建林，等.黃鱔P-450芳香化酶基因的克隆及序列分析[J].水生生物學報，2005，29（5）：550-555.

[12]Liu Jifang， Yan Guiguen，Liu Shaojun.Aromatase（P450arom）and 11β-hydroxylase（P450 11β）Genes are differentially expressed during the sex change process of the protogynous rice field eel，monopterus albus[J].Fish Physiology and Biochemistry，2009，35（3）:511-518.

[13]Simpson E R，Mahendroo M S，Means G D，et al.Aromatase cytochrome P450，the enzyme responsible for estrogen biosynthesis[J].Endocrine Reviews，1994，15（3）：342-355.

[14]Pifferrer F，Zanuy S，Carrillo M，et al.Brief treatmentwith an aromatase inhibitor during sex differentiation causes chromosomally female salmon to develop as normal functionalmales[J].Journal of Experiment Zoology，1994，270（3）:255-262.

[15]Wong T T，Ijiri S，Zohar Y.Molecular biology of ovarian aromatase in sex reversal:complementary DNA and 5'-flanking region isolation and differential expression of ovarian aromatase in the gilthead seabream（Sparus aurata）[J].Biology of Reproduction，2006，74（5）:857-864.

[16]Blázquez M，Piferrer F.Cloning，sequence analysis，tissue distribution，and sex-specific expression of the neural form of P450 aromatase in juvenile sea bass（Dicentrarchus labrax）[J].Molecular and Cellular Endocrinology，2004（219）:83-94.

[17]Zhang Y，Zhang W，Zhang L，et al.Two distinct cytochrome P450 aromatases in the orange-spotted grouper（Epinephelus coioides）:cDNA cloning and differential mRNA expression[J].Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology，2004，92（1-2）：39-50.

[18]Makoto P M，Solveig van Nes S，Andersen，et al.Realtime PCR analysis of ovary-and brain-type aromatase gene expression during Atlantic halibut（Hippoglossus hippoglossus）development [J]. Comparative Biochemistry Physiology，2006，144（5）:128-135.

[19]Ju Huayu，Yong Kaitagn，Jian Linli.Cloning，Structure，and Expression Pattern of the P-450 Aromatase Gene in Rice Field Eel（Monopterus albus）[J].Biochemical genetics，2008，46（5）:267-280.

[20]Kwon JY，McAndrew B J，Penman D J.Cloning of brain aromatase gene and expression of brain and ovarian aromatase genes during sexual differentiation in genetic male and female Nile tilapia（Oreochromis niloticus）[J].Molecular Reproduction and Development，2001，59（4）:359-370.

[21]Tzchori I，Degani G，Hurvitz A，et al.Cloning and devel－opmental expression of the cytochrome P450 aromatase gene（CYP19）in the European eel（Anguilla anguilla）[J].Gen Comp Endocrinol，2004，138（3）:271-280.

遼寧大連向日本出口40 t鮮活河豚魚

2017年9月5—6日，日本最大兩家河豚魚進口公司的活魚船相繼來到金普新區大李家大連天正實業有限公司河豚魚養殖基地，將采購的40 t鮮活河豚魚運回日本國內，由此拉開了大連2017年河豚魚出口的序幕。

日本是世界上最大的河豚魚消費國，而其本國的河豚魚資源遠遠不足以滿足消費需求，大部分需從鄰國進口，其中最大的供應商便是中國著名的河豚魚養殖企業大連天正實業有限公司，日本國內消費的養殖河豚魚60%以上來自于這家企業。

日本活魚船每年9月至10月都來裝魚。記者登上日本進口公司的活魚船看到，工作人員船上船下忙著將鮮活河豚魚從網箱裝運到船上，經過幾個小時的緊張忙碌，將20 t河豚魚全部裝運到船上。問起這批河豚魚的質量，日方一位負責人立即豎起大拇指說，質量和規格都達到要求，還會來運河豚魚。據介紹，這批河豚魚一到港，等在日本下關唐戶魚市場的商戶就會搶購一空。

大連天正實業有限公司副總經理袁旭介紹，今年該公司出口鮮活河豚魚大約在500 t，大部分出口到日本、韓國等地區。國外市場銷售穩定，國內市場銷售量也逐年上升。2016年9月，農業部、國家食品藥品監督管理總局聯合發文，正式有條件放開養殖紅鰭東方鲀和養殖暗紋東方鲀的加工經營。2016年底，農業部及中國漁業協會按照要求進行了養殖河豚魚源基地和加工企業的備案審核，大連天正實業等16家河豚魚養殖企業和5家加工企業獲得了相關資質。目前大連天正實業有限公司已向北京、上海、廣州等地銷售100多噸河豚魚產品，預計今后銷售量還會有大幅提升。

（www.bbwfish.com）

Aromatase(P450arom)mRNA expression in eel brain tissue

Zhang Houmei，Wang Lin
（Anhui biological engineering school，Hefei 230031，China）

This study intended to further study the mechanism and intrinsic link between sex reversal and aromatase in the eel，aiming to provide basic materials for artificial sex control of rice field eel，real-time quantitative PCR were used to study expression of aromatase in the brain.Real time quantitative PCR results showed that P450arom mRNA expressed in the brain of females，intersexuals，male rice field eel，its expression level was declining.Our data provided initial evidence that aromatase participated in sex reversal，the activity of aromatase in the brain was closely related to sex change.The level of aromatase mRNA expression in eel brain might play a decisive role.

eel；aromatase；sex reversal

Q176

A

1004－2091（2017）10－0007－05

10.3969/j.issn.1004－2091.2017.10.002

張厚梅（1973－），女，講師，研究方向：特種水產養殖.E－mail：zhm07071228@126.com

王琳（1972－），男，博士.E－mail：wangl1120@163.com

2017-03-14）