水稻葉鞘原生質體轉化體系的構建及Pik-H4和AvrPik-H4蛋白的瞬時表達

劉維，劉浩，董雙玉，古豐瑋，陳志強，王加峰，王慧

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水稻葉鞘原生質體轉化體系的構建及Pik-H4和AvrPik-H4蛋白的瞬時表達

劉維，劉浩，董雙玉，古豐瑋，陳志強，王加峰，王慧

（華南農業大學國家植物航天育種工程技術研究中心，廣州 510642）

探索水稻葉鞘原生質體最佳游離時間以及轉化時間，提高瞬時表達效率，在蛋白水平對目的基因進行檢測且大批量表達。探索該系統表達抗稻瘟病蛋白Pik1-H4、Pik2-H4及無毒蛋白AvrPik-H4的可行性，對目的基因的功能進行分析。以高抗稻瘟病品種H4及對照品種中二軟占作為試驗材料，利用1/2 MS培養基種植水稻幼苗25℃恒溫培養7—10 d。利用纖維素酶及離析酶對水稻葉鞘進行酶解，血球計數板分別統計游離1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12 h的細胞數目獲得最佳的酶解時間。將目標基因Pik-H4、Pik-H4及分別與GFP融合，構建瞬時表達載體，利用PEG介導轉入水稻葉鞘原生質體。設置轉化10、12、14、16、18、20、22和24 h，分別提取細胞總RNA，管家基因為對照，設計特異性擴增引物，利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測的相對表達量，探索最佳的轉化時間。通過激光共聚焦掃描顯微鏡對目標基因進行亞細胞定位觀察，推測基因功能。提取細胞總蛋白，以Anti-GFP為一抗用Western blot對目標蛋白表達進行驗證。相對室溫土壤栽培，營養豐富且均衡的1/2 MS培養基恒溫種植的水稻幼苗質量更優質，活力更高。游離時間的長短對游離效率影響較大，游離的最佳時間為4—6 h，在3—4 h細胞游離數目增長速度最快，4—6 h細胞數量趨于平穩，6 h以后細胞總量呈現下降趨勢，特別是7 h以后，顯微下細胞碎片增多，細胞死亡速度加快。檢測的相對表達量，獲得最佳轉化時間為14—16 h，16 h達到最高值，之后逐漸下降。隨著時間的推移，熒光顯微鏡下觀察到GFP蛋白發出的熒光逐漸淬滅。亞細胞定位觀察發現AvrPik-H4蛋白主要被定位于水稻細胞膜上，初步推測是一種膜蛋白，通過某種形式運輸到宿主細胞作為激發子觸發一系列反應。是高效廣譜抗稻瘟病基因，分為Pik-H4和Pik-H4兩個部分，Pik1-H4主要定位在內質網，Pik2-H4主要定位在質體，從定位結果初步推定Pik1-H4可能主要參與AvrPik-H4蛋白的識別反應，Pik2-H4主要起到調控下游抗病的作用。Western blot結果顯示目標蛋白表達成功，分子大小正確。Pik1-H4和AvrPik-H4的表達量高于Pik2-H4，說明分子量的大小不是影響轉化效率的關鍵因素。水稻葉鞘原生質體瞬時表達系統具有高效快速的特點，通過對游離及轉化時間的探索為水稻瞬時表達體系的廣泛實踐應用提供參考。目標基因的成功表達為Pik-H4與無毒蛋白互作機制的研究提供了有價值的理論依據。

水稻；原生質體；亞細胞定位；western 雜交

0 引言

【研究意義】稻瘟病是由稻瘟病菌（）引起的全球性真菌性病害，目前世界上有85個國家已出現該病害，每年減產10%—35%[1]。實踐證明，選育和使用水稻抗病品種是控制稻瘟病最為經濟有效的措施。植物瞬時表達系統以宿主單個細胞為基礎，轉入外源的DNA在短時間內進行蛋白質高水平表達。由于水稻原生質體的生物功能在一定程度上與完整的細胞相似，為研究植物細胞內信號轉導提供了非常有利的細胞環境[2]。利用水稻葉鞘原生質體瞬時表達系統表達Pik1-H4、Pik2-H4及AvrPik-H4蛋白并進行亞細胞定位，有助于目的基因分子功能及抗病基因和無毒基因互作機制的研究。【前人研究進展】水稻抗稻瘟病蛋白基因由和組成，屬于典型的NBS-LRR類基因，對廣東的稻瘟病菌生理小種大多表現出高抗[3]。為編碼113 aa的小分子分泌蛋白，不含有保守區域，容易發生突變。相較穩定的轉基因表達系統，瞬時表達體系具有宿主范圍廣、周期短、檢測快速及高通量的特點，已被廣泛應用于分子生物學研究領域，如啟動子活性分析[4]、Cas9編輯效率檢測[5-6]、mRNA衰變[7]、microRNAs對靶基因的調控[8]、蛋白功能研究[9]、信號轉導[10-11]等。目前主要通過基因槍法、農桿菌滲透法、聚乙二醇（PEG）介導法、電擊法及植物病毒載體介導對目標基因進行轉化[12]，在小麥[5]、葡萄[9]、玉米[10]、水稻[13]、擬南芥[14]、櫻桃[15]、萵苣[16]、馬鈴薯[6,17]、煙草[18]等都有應用。水稻葉表面具有蠟質層，不利于原生質體的游離，如鹿連明等[19]利用煙草的瞬時表達體系研究水稻條紋病毒（，RSV）的相關蛋白互作，但基因產物的正確折疊、亞細胞精細定位都依賴于宿主特異性表達系統[20]。近幾年，有關水稻原生質體瞬時表達系統已經有相關報道，轉化效率也相對提高[21]，如利用Co-IP技術驗證互作蛋白[13]，探索ABA信號通路[22]，鄰近生物素（BioID）技術篩選近端蛋白[23]等。【本研究切入點】盡管對水稻原生質體瞬時表達系統的應用已經有少量報道，但原生質體游離轉化效率限制了該技術的應用，利用該技術進行抗稻瘟病基因蛋白的表達還未見報道。【擬解決的關鍵問題】探索原生質體游離及轉化的最佳時間，通過將目的片段融合綠色熒光蛋白（GFP）構建載體，利用水稻葉鞘原生質體瞬時表達體系成功表達目標蛋白，在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察蛋白在細胞內的表達部位，并且利用Western blot技術驗證結論的真實性，為水稻原生質體瞬時表達系統的推廣應用提供依據，為水稻抗病相關基因的功能性研究及互作蛋白的篩選打下基礎。

1 材料與方法

試驗于2016年10月至2017年3月在華南農業大學國家植物航天育種技術工程研究中心完成。

1.1 試驗材料

水稻材料為H4以及中二軟占，H4是經過空間搭載誘變的中二軟占突變體經地面選育的廣譜、高抗的水稻優質種質資源。

1.2 載體構建

試驗中所有的瞬時表達載體均以pYL322d1- eGFPn為骨架，如圖1所示，由花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動子、綠色熒光蛋白（GFP）片段和NOS終止子組成。目標基因Pik-H4、Pik-H4克隆于高抗稻瘟病水稻品種H4的cDNA，克隆于稻瘟病菌GD0193，利用CE Design V1.03軟件設計引物，如表1所示，去除開放閱讀框架片段終止密碼子，利用同源重組方法構建p35S-Pik1-H4/Pik2-H4/ AvrPik- H4-GFP載體。載體骨架由亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室劉耀光研究員惠贈。

表1 引物寡核苷酸序列

1.3 水稻幼苗種植

挑選飽滿的H4水稻種子，去殼，75%乙醇消毒2 min，2%的次氯酸鈉150 r/min消毒30 min。在超凈工作臺中用滅菌水洗凈殘留的次氯酸鈉后，將種子接種到1/2 MS培養基中，放到恒溫培養箱，25℃，光周期為12 h光照/12 h黑暗培養10 d左右。

1.4 水稻原生質體制備

參照YANG等[13]的原生質體游離方法，沿根部將水稻幼苗剪下，用鋒利的刀片將水稻葉鞘切割成0.5—1 mm的片段，放到0.6 mol·L-1甘露醇中，室溫預質壁分離30 min，吸干殘留的甘露醇，用W5（154 mmol·L-1NaCl，125 mmol·L-1CaCl2，5 mmol·L-1KCl，2 mmol·L-1MES，pH 5.7）溶液稍清洗后加入現配酶液（0.5 mol·L-1甘露醇，10 mmol·L-1MES，1.5%纖維素酶，0.75%離析酶，10 mmol·L-1CaCl2，0.1% BSA），30℃，60 r/min，酶解4—6 h。在普通光學顯微鏡40×物鏡下觀察細胞，視野中有20—40個完整的細胞即可。用200目篩子過濾酶液，加入10 ml預冷的W5溶液于酶解的殘渣快速手搖1 min，再次過濾，合并濾液，300×，離心5 min，吸出上清液。向BD管中加入2 ml預冷的W5溶液，讓原生質體重新懸浮，200×，離心3 min，重復此步驟一次。用500 μl W5重懸沉淀，置于冰上30 min后，150×，離心2 min，去除上清，用1 ml MMg懸浮細胞（使終濃度約為107個/ml）。

圖1 322-d1-eGFPn載體結構圖

1.5 PEG介導水稻原生質體轉化

在100 μl原生質體中，加入高純度10 μg（約10 μl）質粒，再加入110 μl 40% PEG（40% PEG4000，0.3 mol·L-1甘露醇，0.1 mol·L-1CaCl2），混勻后，28℃黑暗中橫放15 min。加入500 μl的W5溶液終止反應，充分混勻，300×離心5 min，去除上清，加入600 μl WI溶液（4 mmol·L-1MES，pH 5.7，0.5 mol·L-1甘露醇，20 mmol·L-1KCl），28℃黑暗中培養14—16 h。

1.6 亞細胞定位

使用激光掃描共聚焦顯微鏡（LSM 7 DUO）觀察轉化后含有GFP蛋白以及GFP融合蛋白的原生質體，GFP、mCherry的激發波長分別為488、561 nm，發射波長分別為530—560、580—620 nm。葉綠體自發熒光的激發波長為488 nm，發射波長為650—750 nm。

1.7 Western驗證

收集轉化后的原生質體，300×，離心6 min，盡量去除上清。加入20 μl的SDS-PAGE樣品緩沖液（50 mmol·L-1Tris-HCl，2% SDS，0.1%溴酚藍，10%甘油，1%巰基乙醇）100℃煮沸5 min，提取原生質體中的總蛋白。室溫離心1 min，吸取上清，用10%的SDS-聚丙烯凝膠（Bio-Rad）200 V 35 min分離樣品的蛋白，300 mA 3 h將蛋白轉到硝酸纖維素膜上，使用一抗Anti-GFP溫室孵育1 h，二抗Anti-Mouse溫室孵育1 h，使用化學發光試劑（Thermo Scientific）溫室孵育5 min后，進行觀察。

1.8 實時熒光定量PCR分析

為確定轉化的最佳時間，在原生質體中轉入GFP載體，分別提取轉化10、12、14、16、18、20、22、24 h的產物，300×離心5 min，棄上清，加入500 μl TRIzol，渦旋15 s，溫室靜置3 min。加入150 μl氯仿，渦旋15 s，靜置2 min，4℃，12 000×離心5 min，吸取水相到新的離心管，加入250 μl預冷的異丙醇，混勻后溫室放置3 min，4℃，12 000×離心5 min，棄上清，加入1 ml 75%乙醇，簡單混勻后4℃，12 000×離心2 min，去除殘留酒精，加入20 μl RNase水溶解沉淀。分別取1 μg RNA用SMARTScribeTMReverse Transcriptase試劑盒（TakaRa Clontech）進行逆轉錄，反應條件：30℃ 10 min，42℃ 20 min，99℃ 5 min，4℃ 5 min，瞬間離心后，將樣品濃度稀釋至300—500 ng，以此為模板做qPCR定量分析，設計PCR引物GFP-F：GACGACGGCAACTACAAGAC、GFP-R：TCGGCCATGATATA GACGTT，產物為163 bp，管家基因作為對照。使用AceQ qPCR SYBR@Green MasterMix試劑盒（Vazyme），反應條件：95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，40個循環。

2 結果

2.1 瞬時表達載體的鑒定

將目的片段分別與GFP進行組裝，如圖2所示，選用RⅠ、Ⅰ兩個限制性內切酶將載體線性化，選用這兩個酶切位點插入目的片段不會導致移碼，保證目標蛋白的正確表達。經PCR檢測后結果如圖3所示，除了Pik1-H4-GFP有一個擴增片段不正確以外，其余都正確，挑取PCR結果正確質粒送去公司測序，結果表明組裝成功。

2.2 水稻原生質體游離

選取茁壯、葉鞘較硬的幼苗，用手術刀片將葉鞘切割成小段（圖4）。通過血球計數板統計獲得不同游離時間細胞的數目，游離的最佳時間為4—6 h，在3—4 h細胞游離數目增長速度最快，4—6 h細胞數量趨于平穩，6 h以后細胞總量呈現下降趨勢，特別是7 h以后，顯微下細胞碎片增多，細胞死亡速度加快（圖5）。隨著游離時間的增加，細胞總數目增多，導致供氧不足，初始的游離細胞活力下降，加上游離過程中的機械碰撞使細胞膜破碎，從而導致總體細胞數目呈現下降趨勢。

2.3 實時熒光定量PCR分析最佳轉化時間

GFP蛋白在藍色波長范圍的光線激發下，發出綠色螢光。將GFP載體轉化到原生質體中，28℃，經過14—16 h的暗培養后，吸取5 μl在熒光顯微鏡下進行檢測，可以看到GFP蛋白發出的熒光（圖6）。從圖中可以看出，GFP載體有較高的轉化效率，經過暗培養后，大部分細胞還保持有較完整的形態，較高的生命活力。圖中也存在一部分細胞碎片，說明存在一部分的細胞死亡，有一定比例的損失。

Ⅰ: AvrPik; Ⅱ: Pik1-H4; Ⅲ: Pik2-H4

M: 1 kb Marker; 1-6: Pik1-H4-GFP; 7-12: Pik2-H4-GFP; 13-18: AvrPik-GFP

a：水稻葉鞘游離過程圖Process of rice leaf sheath protoplasts；b：水稻葉鞘原生質體圖Observation of protoplasts isolation from leaf sheath

為探索原生質體轉化的最佳時間，通過轉化GFP質粒，設置不同的轉化時間，通過提取原生質體的總RNA，用實時熒光定量技術估測的相對表達量，獲得最佳轉化時間為14—16 h相對表達量最高的轉化時間為16 h，之后逐漸下降（圖7）。

2.4 Pik1-H4、Pik2-H4及AvrPik-H4的亞細胞定位

大部分基因產物與特定的細胞器有一定的關聯，可通過亞細胞定位來探索該蛋白的功能以及蛋白相互作用的網絡。將瞬時表達載體轉染到水稻的原生質體中，通過激光共聚焦掃描顯微鏡63×水鏡觀察到目標蛋白在水稻細胞內的具體表達部位。由圖8可知AvrPik-H4主要定位于細胞膜，Pik1-H4主要定位于內質網，Pik2-H4主要定位于質體。AvrPik-H4蛋白被定位于水稻細胞膜上，說明是一種膜蛋白或者積累于膜上的蛋白，通過某種形式運輸到宿主細胞作為激發子觸發一系列反應。從定位結果初步推定Pik1-H4可能主要參與AvrPik蛋白的識別反應以及信號傳遞的作用，Pik2-H4主要起到改變能量的傳輸方式及調控下游抗病引發過敏性壞死的作用。相比煙葉、洋蔥表皮細胞的瞬時轉化體系，水稻葉鞘細胞更具有說服力，有正確的蛋白合成系統，能引導目標蛋白的正確折疊。

圖5 酶解時間對原生質體產量的影響

a：GFP熒光GFP filter；b：白光bright field

圖7 不同轉化時間GFP相對表達量

圖8 AvrPik-H4、Pik1-H4及Pik2-H4亞細胞定位

2.5 Western blot驗證

收集轉化結束后原生質體，提取總蛋白，進行Western blot驗證，結果如圖9所示。融合蛋白比目標蛋白分子量增加30 kD左右，用Anti-GFP作為一抗進行孵育，其中泳道1是沒有轉入質粒的細胞總蛋白作為陰性對照，泳道2轉入GFP質粒作為陽性對照，泳道3—5是目的片段與GFP的融合蛋白，與Marker進行對照結果表明正確，為亞細胞定位的準確性提供了有力證據。

1：陰性對照Negative control；2：陽性對照Positive control； 3：Pik1-H4-GFP；4：Pik2-H4-GFP；5：AvrPik-H4-GFP

3 討論

水稻作為單子葉模式植物被廣泛地應用于分子功能、遺傳進化研究，是探索基因組學和比較基因組學的有效工具[24]。利用水稻轉基因植株進行基因功能研究存在周期長、生物安全性問題，而水稻瞬時表達體系能在短時間內實現目標基因的高水平表達，且保留原有的合成、修飾及轉運蛋白的途徑，更有益于后續接近真實情況抗病相關蛋白的篩選。目前，水稻系統的瞬時表達主要采用原生質體表達系統[25]、農桿菌侵染[26]方法，相對來說原生質體的方法更便捷高效。水稻葉片表面的蠟質層含有10%的硅膠[27]，不利于被纖維素酶降解，而水稻幼苗葉鞘的硅膠含量較低[28]，適合做原生質體游離的材料。本研究利用1/2 MS培養基25℃種植水稻幼苗，得到了較好的游離效果。相對于土壤栽培，培養基種植能提供更豐富均衡的營養，提供了更高質的游離材料。PEG與二價陽離子共價結合時能介導DNA發生有效沉淀達到轉化的目的。有研究表明載體分子量越大轉化效率越低，Bart等[29]研究表明12 kb質粒轉化效率為25%—30%；YANG等[13]研究表明5.9 kb質粒轉化效率達到70%左右，3 kb的GFP質粒轉化效率達到90%以上；段煉等[30]用蔗糖密度梯度法純化水稻原生質體，質粒轉化濃度為0.7 μg?μL-1時轉化效率達到60%—70%。本研究中，4.7 kb的GFP載體轉化效率可達95%以上，融合GFP的目的基因載體大小分別為5、7.7、8.2 kb，GFP空載體與AvrPik-H4-GFP的轉化效率相對稍高，但并無太大差別。相對以前的報道，本研究采用離心的方法對細胞進行收集，相對蔗糖密度梯度純化法簡便高效，利用實時熒光定量PCR法得到最佳轉化時間為14—16 h，獲得了較高的轉化效率。Western blot驗證結果顯示，Pik1-H4-GFP與AvrPik-H4-GFP的表達量最高，說明轉化效率與質粒分子大小無顯著的線性關系，蛋白的表達量則與蛋白本身的功能性質有關。PEG介導的原生質體轉化對DNA屬于無選擇性吸收，要同時保證質粒的高濃度及高質量才能獲得較高的轉化效率。

位于水稻第11號染色體，由兩個相鄰的NBS-LRR基因Pik、Pik組成，NBS-LRR類是水稻抗稻瘟病基因中最常見的編碼結構域[31]。位點存在7個等位基因（、、、、、、），對稻瘟病菌都具有廣譜抗性[32-33]。利用水稻瞬時表達系統對Pik-H4及AvrPik-H4蛋白的成功表達以及亞細胞定位對蛋白的功能研究有非常重要的意義，可為揭示靶蛋白介導的抗性通路提供依據。本研究表明在H4幼苗接種GD0193稻瘟病菌24 h游離的原生質體中轉入無毒蛋白AvrPik-H4后，在短時間內大部分水稻細胞聚集成團呈現膠稠透明狀發生過敏性壞死，而對照品種中二軟占則不會有此現象，說明介導的免疫反應是通過迅速而高效地引起宿主過敏性壞死實現的。該現象為目標基因在水稻葉鞘原生質體中的成功表達提供了有力證據。

瞬時表達系統常用于靶蛋白的亞細胞定位，如農桿菌侵染煙草[34]、洋蔥[35]及擬南芥表皮瞬時表達[36]。介于異源表達系統蛋白修飾、轉運存在差異可能出現的錯定位，同源表達系統的亞細胞定位結果更接近真實情況[37]。Zhai等[38]利用水稻原生質體表達系統定位Pikh-1、Pikh-2及AvrPik-h均在細胞質和細胞核。靶基因的亞細胞定位對基因功能的研究有重要意義，本研究中將目標蛋白分別與GFP蛋白融合表達，利用水稻葉鞘原生質體瞬時表達系統進行亞細胞定位，觀察到Pik1-H4主要定位于內質網，Pik2-H4主要定位于質體，AvrPik-H4主要定位于細胞膜。Pikh是Pik-H4的等位基因，二者定位結果出現差異的原因有兩個：（1）CDS堿基序列存在差異。Pikh-1與Pik1-H4的CDS序列存在兩個堿基的差異，Pikh-2與Pik2-H4的CDS序列則完全相同，AvrPikh與AvrPik-H4的CDS序列存在一個堿基的差異，可能改變其在細胞內的定位；（2）病原菌入侵時靶蛋白定位發生改變。本研究中的游離材料取自于接種稻瘟病菌24 h后的幼苗，有研究表明一些抗病相關基因會隨著病原菌的入侵而改變細胞中的定位，由細胞核流向細胞質，如定位于葉綠體的NRIP1蛋白識別病原菌效應因子后，會從葉綠體流向細胞質及細胞核[39]。有研究表明與的CC結構域互作產生相應的信號轉導后，使宿主產生相應的抗性[38]。初步推測Pik1-H4主要起到一個無毒蛋白與宿主抗病的銜接作用，識別外源物質入侵及啟動防御信號傳遞給Pik2-H4，能夠受到病原物的誘導而表達。Pik2-H4接收到信號以后通過調配代謝物的合成以及物質運輸方式啟動宿主的防御模式，加厚被侵染細胞的細胞壁或者直接啟動自殺機制阻止相鄰細胞被侵菌絲侵入。AvrPik在稻瘟病菌孢子的細胞膜上主要起到信號傳遞的作用，便于被宿主識別。

4 結論

水稻葉鞘原生質體游離的最佳時間為4—6 h，最適轉化時間為14—16 h，FAD染色發現得到的細胞具有較高的活力，檢測GFP熒光觀察到較高的轉化效率，通過亞細胞定位觀察及Western blot驗證目標蛋白的表達，為Pik-H4與無毒蛋白互作機制的研究打下了基礎。推測Pik1-H4可能主要參與AvrPik-H4蛋白的識別反應，Pik2-H4主要調控下游抗病反應。

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（責任編輯 岳梅）

Construction of Rice Leaf sheath Protoplast Transformation System and Transient Expression of Pik-H4 and AvrPik-H4 Proteins

LIU Wei, LIU Hao, DONG ShuangYu, GU FengWei, CHEN ZhiQiang, WANG JiaFeng, WANG Hui

(National Engineering Research Center of Plant Space Breeding, South China Agricultural University, Guangzhou 510642)

The objective of this study is to obtain the suitable digestion and transformation time of protoplasts of rice sheath, improve the efficiency of transient expression, the target gene can be detected at the protein level and expressed in large quantities. To explore the feasibility of transient expression of rice blast resistance protein Pik1-H4, Pik2-H4 and avirulence protein AvrPik-H4 in protoplasts of rice leaf sheath, and to analyze the function of above target genes.High blast resistance rice variety H4 and control variety Zhonger Ruanzhan were used as experimental materials. Rice seedlings were cultured with 1/2 MS medium at 25℃ for 7-10 d. The protoplasts were isolated by cellulase and macerozyme enzymatic action. The optimal time of digestion was obtained by counting the number of cells in 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 and 12 h using hemocytometer. The target genesPik-H4,Pik-H4andwere fused with GFP to construct the transient expression vector. The total RNA was extracted from transformed protoplasts in 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 and 24 h, respectively. Real-time quantitative PCR (qRT-PCR) was used to detect the relative expression ofto obtain the best transformation time,housekeeping gene was used as control andspecific amplification primers were designed. The method of subcellular localization of the target gene by laser confocal scanning microscopy was used to estimate the gene function. The total protein was extracted and anti-GFP was used as the primary antibody, verified that the target protein successful expression by Western blot.rice seedlings were grown better quality and vitality in constant temperature 1/2 MS medium with rich and balanced nutrients, compared with soil planted at room temperature. Digested time had a greater impact on protoplast isolation efficiency. The results showed that the best time to digest was 4-6 h. The number of cells grew fastest at 3-4 h, tended to be stable at 4-6 h, showed a downward trend after 6 h, cell death rate accelerated and observed debris increased in the microscopic cell after 7 h. By detecting the relative expression of, it was found that the most suitable time for transformation was 14-16 h, reached the highest value at 16 h, and then gradually decreased. Subsequently, fluorescence of the GFP protein was observed to be quenched by fluorescence microscopy. Subcellular localization observation of AvrPik-H4 protein was mainly located in the cell membrane, presumably this is a membrane protein that is transported by some form to the host cell as an exciton to trigger a series of reactions.is composed ofPik-H4andPik-H4, which is highly efficient broad-spectrum rice blast gene. Pik1-H4 and Pik2-H4 were mainly located in the endoplasmic reticulum and plastid, respectively. From the subcellular localization results, it was presumed that Pik1-H4 might be mainly involved in the recognition of Avr-Pik protein and signal transmission, Pik2-H4 mainly play a role in changing the energy transmission and regulation of downstream disease caused hypersensitive reaction. Western blot results showed that the target protein was successfully expressed and the molecular size was correct. The expression of Pik1-H4 and AvrPik-H4 was higher than that of Pik2-H4, indicating that the size of the molecular weight is not a key factor affecting the transforming efficiency.The protoplast transient expression system of rice leaf sheath has the characteristics of high efficiency and rapidity, the exploration of protoplast isolation and transformation time has laid a foundation for the extensive practice of rice transient expression system. The successful expression of the target gene has provided a valuable theoretical basis for the study of the interaction mechanism between Pik-H4 and Avr protein.

rice; protoplast; subcellular localization; Western blot

2017-06-12；

2017-07-20

國家重點研發計劃（2017YFD0100100）、國家“863”計劃（2012AA101201）、國家自然科學基金（31401722）、廣東省省級科技計劃（2016A020210064）

聯系方式：劉維，Tel：18819266052；E-mail：1158397772@qq.com。通信作者王慧，Tel：020-85283237；E-mail：wanghui@scau.edu.cn