人殺菌/滲透增強蛋白N端功能片段基因突變文庫的構建和鑒定

李晶琴 孔慶利 安云慶*

(1.首都醫科大學燕京醫學院醫學檢驗學系，北京 101300；2.首都醫科大學基礎醫學院免疫學系，北京 100069)

·基礎研究·

人殺菌/滲透增強蛋白N端功能片段基因突變文庫的構建和鑒定

李晶琴1孔慶利2安云慶2*

(1.首都醫科大學燕京醫學院醫學檢驗學系，北京 101300；2.首都醫科大學基礎醫學院免疫學系，北京 100069)

目的為提高殺菌/滲透性增強蛋白N端功能片段BPI23對內毒素(lipopolysaccharides,LPS)的親和性，通過易錯聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)和DNA改組技術，對其編碼序列BPI600進行突變，在大腸桿菌XL10-Gold中構建BPI600基因突變體庫。方法通過控制Mg2+和Mn2+的濃度進行易錯PCR，獲得BPI600隨機突變基因片段，經測序和基因比對，確定BPI600的隨機突變率。再對易錯PCR產物進行DNA改組，將改組產物克隆至pYD1載體中，轉化大腸桿菌XL10-Gold，從Amp抗性(Luria-Bertani,LB)固體培養平板上任選10個單菌落，增菌后提取質粒，得到pYD1-shuffledBPI600重組質粒，將質粒進行HindⅢ/XhoⅠ酶切鑒定，取5個陽性質粒進行DNA測序，通過基因和氨基酸比對鑒定突變情況。結果測序和基因比對顯示，BPI600經易錯PCR所獲突變文庫的隨機突變率達2.3%；改組后重組質粒的酶切結果表明，在隨機選擇的10個菌落所提質粒中，有6個含BPI600，表明構建了重組質粒pYD1-shuffledBPI600；在5個陽性質粒中，有4個重組質粒的BPI23編碼序列分別發生了6、9、11和14個堿基突變；1個不僅有10個堿基突變，還存在1個堿基的缺失。氨基酸比對表明，有2個質粒(分別有6和14個堿基突變)具有正確的讀碼框，能夠翻譯完整的蛋白質，各有4或14個氨基酸突變。3個質粒因含終止密碼子而不能表達完整目的蛋白。結論成功構建pYD1-shuffledBPI600重組質粒，獲得庫容量為2×105的突變文庫，為高內毒素親和力突變體的篩選奠定了基礎。

人殺菌/滲透增強蛋白；定向進化；易錯PCR；DNA改組

殺菌/滲透增強蛋白(bactericidal/permeability increasing protein，BPI)是生物體內存在的一種陽離子抗菌蛋白，BPI及其功能性N端片段BPI23具有廣譜殺傷包括耐藥菌株在內的革蘭陰性菌以及中和內毒素的作用[1]，在臨床上具有較大的應用前景。

為進一步提高BPI23與內毒素的親和性和抗感染效果，本實驗在前期構建的pYD1-BPI600重組質粒的基礎上，對BPI N端功能片段BPI23的編碼序列BPI600進行定向進化。蛋白質定向進化可以模擬自然進化的過程(隨機突變或重組)，通過人為地改變反應條件，在體外進行基因的突變或重組，以構建突變體庫并從中篩選出理想突變體。易錯PCR(error-prone polymerase chain reaction,EP-PCR)和DNA改組(DNA shuffling)是目前常用的定向進化技術[2]。易錯PCR基于Taq DNA聚合酶不具備3′→5′外切酶活性，缺乏校對功能，故在DNA擴增過程中會發生錯誤摻入而引起突變[3]。DNA改組是將親本基因進行盡可能多的組合，最終獲得大容量基因突變體庫的技術[4]。本實驗通過易錯PCR和DNA改組技術，構建了大容量的BPI600突變體庫，為優勢突變體的篩選打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒和菌株

大腸桿菌DH5α由本室保存，大腸桿菌XL10-Gold超級感受態細胞購自美國Stratagene公司，pMD18-T載體購自日本TaKaRa公司，質粒pYD1-BPI600由本室構建，包含BPI600基因(約600 bp)。載體pYD1全長5 009 bp，購自美國Invitrogen公司。

1.1.2 主要試劑

dCTP、dTTP、dATP、dGTP、Taq DNA 聚合酶、MnCl2、MgCl2購自上海生工生物工程公司。NZ胺購自美國Amresco公司、β-巰基乙醇(β-ME)購自美國Stratagene公司。限制性內切酶BamHI、HindⅢ購自日本TaKaRa公司。100 bp Ladder Marker、DL2000 Marker購自中國BioDev公司。DL15000購自日本TaKaRa公司。DNA小片段膠回收試劑盒購自中國BioDev公司。質粒大量提取試劑盒購自威格拉斯生物技術有限責任公司。其余試劑為國產分析純。

1.1.3 引物設計與合成

參照GenBank中BPI基因的序列，設計擴增BPI600的引物，P1：5′-CCC AAG CTT GTC AAC CCT GGC GTC GTG-3′，添加HindⅢ酶切位點(下劃線標示)，P2：5′-CCG CTC GAG TCA TAT TTT GGT CAT TAC TGG-3′，添加XhoⅠ酶切位點(下劃線標示)；P3:5′-AGTAACGTTTGTCAGTAATTGC-3′，P4:5′-GTCGA TTTTGTTACATCT ACAC-3′，為載體pYD1測序引物；P5：5′-GTC AAC CCT GGC GTC GTG-3′，P6:5′-TAT TTT GGT CAT TAC TGG-3′為易錯PCR設計引物。P1/P2、P5/P6由上海生工生物工程公司合成；P3/P4購自美國Invitrogen公司。

1.2 易錯PCR

1.2.1 隨機突變片段的獲得

在高Mg2+離子濃度(5.0 mmol/L)和Mn2+存在的條件下，通過選擇不同的Mg2+濃度來控制隨機突變的頻率。以質粒pYD1-BPI600為模板進行易錯PCR。反應體系為(50 μL)：10×EP-PCR 緩沖液5 μL，dNTP混合物(各10 mmol/L)1 μL，P5、P6引物(均為10 μmol/L)各2 μL，質粒模板1 μL，MnCl2(5 mmol/L)5 μL，Taq DNA 聚合酶(5 u/μL)0.25 μL，去離子水加至50 μL。擴增條件為：95℃預變性5 min；94℃ 1 min、55℃ 1 min、72 ℃ 1 min，共30個循環。用1%(質量分數)瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產物，并在紫外燈下分離出含大小約600 bp基因片段的凝膠，利用DNA小片段膠回收試劑盒純化回收BPI600隨機突變片段；以回收物為模板，再行第二輪易錯PCR，按上述方法回收純化大小約為600 bp突變基因片段。

1.2.2 突變基因的克隆和鑒定

將純化的易錯PCR產物連接至克隆載體pMD18-T中，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞。利用Amp抗性(Luria-Bertani,LB)固體培養基進行篩選，菌落PCR鑒定是否含插入片段，并從含插入片段的陽性菌落中隨機挑取5個菌落進行測序和基因比對，并計算隨機突變率。

1.3 DNA改組

1.3.1 隨機突變基因片段化處理

將易錯PCR獲得的隨機突變基因片段利用超聲波進行碎片化處理，條件為：功率設為4 W，冰浴下超聲6 s，間隔12 s，循環處理400次。產物經2%(質量分數)瓊脂糖凝膠電泳，切下大小為50～100 bp左右的條帶，用DNA小片段回收試劑盒進行回收純化。

1.3.2 無引物PCR

反應體系(20 μL)為：10×PCR buffer 2 μL，dNTP(10 mmol/L)0.5 μL，MgCl2(25 mmol/L)1.2 μL，DNA小片段10 μL，Taq DNA 聚合酶(5 u/μL)0.25 μL，加超純水至20 μL。反應條件為：95℃預變性5 min；94 ℃ 30 s、45 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共50個循環；72 ℃延伸10 min。用1%(質量分數)瓊脂糖凝膠電泳鑒定反應產物片段大小。

1.3.3 有引物PCR

將上述無引物PCR產物1∶20稀釋后，作為模板進行有引物PCR擴增。反應體系(20 μL)為：無引物PCR產物稀釋液5 μL，10×PCR buffer 2 μL，dNTP(10 mmol/L)1 μL，MgCl2(25 mmol/L)3 μL，P1和P2各1 μL，Taq DNA 聚合酶(5 μ/μL)0.25 μL，加超純水至50 μL。擴增條件為：95℃預變性5 min；94 ℃ 60 s、57 ℃ 60 s、72 ℃ 75 s，共35個循環；72℃延伸5 min。擴增產物經1%(質量分數)瓊脂糖凝膠電泳分離后，在紫外燈下切下約600 bp的凝膠條帶，用DNA小片段膠回收試劑盒回收、純化BPI600的改組片段。

1.4 重組質粒文庫的構建和鑒定

1.4.1 重組質粒文庫的構建

BPI600改組基因片段和質粒載體pYD1分別用HindⅢ/XhoⅠ酶切，產物分別經1%(質量分數)瓊脂糖凝膠電泳分離后，在紫外燈下切下含目的基因片段的凝膠，用DNA小片段膠回收試劑盒回收純化酶切產物并進行連接，反應體系為：質粒載體pYD1的酶切產物0.5 μL，BPI600改組基因的酶切產物7.5 μL，10×連接緩沖液1 μL，T4 DNA連接酶1 μL，總體積10 μL；16 ℃孵育12 h。用預冷槍頭取大腸桿菌XL10-Gold超級感受態細胞100 μL、β-ME 4 μL放入預冷的Falcon聚丙烯離心管中，輕輕混勻后冰浴10 min；再加入1 μL上述連接產物，輕輕旋轉使感受態細胞與連接產物混勻，冰浴30 min；將聚丙烯離心管置于 42 ℃水浴中作用30 s后，立即放入冰浴中作用2 min；再加入預熱的NZY+肉湯900 μL，37 ℃、225 r/min培養1 h后，取100 μL菌液涂布于Amp抗性LB固體培養基上；37 ℃培養12～16 h，獲得Amp抗性陽性克隆菌，計數菌落數。

1.4.2 重組質粒文庫的鑒定

從Amp抗性LB固體培養基上隨機挑取10個單菌落，增菌、提取質粒后進行酶切鑒定；再從經鑒定含有插入片段的陽性轉化菌落所提質粒中隨機選取5個，在pYD1測序引物P3和P4的引導下進行測序分析。測序結果與GenBank中的野生型BPI600序列進行DNA比對，分析pYD1-shuffledBPI600重組質粒中目的基因的突變情況。

2 結果

2.1 易錯PCR結果

1%(質量分數)瓊脂糖凝膠電泳證實兩輪易錯PCR均成功擴增出大小約為600 bp的基因片段(圖1)。

圖1 易錯PCR擴增產物Fig.1 The product of EP-PCR

1：product of the first EP-PCR;2：product of the second EP-PCR;3：DL 2 000 marker;EP: error prone;PCR: polymerase chain reaction

從Amp抗性LB固體培養基篩選出的BPI600的隨機突變基因庫中，隨機挑選經菌落PCR鑒定為陽性的5個菌落進行測序，測序結果與野生型BPI600基因進行比對(圖2)，經過計算，BPI600隨機突變庫的隨機突變率達2.3%(68/3 000)。

2.2 DNA改組結果

對易錯PCR產物進行碎片化處理后，獲得50～100 bp左右的隨機片段，經50個循環的無引物PCR，小片段DNA被拼接成許多大小不一的改組分子，再經過35個循環的有引物PCR，重聚到與原基因分子大小相同的BPI600改組分子(圖3)。

2.3 pYD1-shuffled BPI600重組質粒文庫的構建與鑒定結果

將有引物PCR產物克隆至pYD1載體中，構建重組質粒pYD1-shuffledBPI600，并用其轉化大腸桿菌XL10-Gold，在Amp抗性LB固體培養平板上獲得Amp抗性陽性克隆菌，計數菌落數，獲得了2×105個轉化子。

從上述平板上隨機選取10個單菌落，增菌后提取質粒，用HindⅢ和XhoⅠ酶切，在10個質粒中，6個被酶切為大小約為4 841 bp和600 bp的兩個條帶，表明重組質粒中插入了BPI600片段(圖4)。

將酶切鑒定后的5個陽性克隆進行測序分析，與NCBI GenBank中野生型BPI編碼序列比對，其中第1、2、4、5號質粒分別發生9、14、6、11個堿基突變(圖5)；第3號質粒不僅有10個堿基突變，還存在一個堿基的缺失(圖6)。氨基酸序列比對結果(圖7)表明，在5個克隆中，第2、4號質粒具有正確的讀碼框，能夠翻譯完整的BPI23，且分別存在14和4個氨基酸突變；第1、3、5號質粒因含終止密碼子而不能表達完整的目的蛋白。

圖2 5個易錯PCR陽性克隆的基因序列與野生型的比對結果Fig.2 Genetic comparison of 5 positive clones (after EP-PCR) with wild type

圖3 BPI600 DNA改組結果Fig.3 The product of BPI600 shuffling

1：fragmented fragments;2，3：product of primerless PCR;4：100 bp Ladder marker;5：product of PCR with primers;PCR:polymerase chain reaction.

圖4 pYD1-shuffled BPI600重組質粒的酶切鑒定 Fig.4 Double digestion of recombinant plasmid pYD1-shuffled BPI600 by HindⅢ/XhoⅠ

1，3，4，5，7，8：positive clones;2，6，9，10：negative clones;M：100 bp Ladder marker

圖5 1、2、4、5號克隆的基因序列與野生型的比對結果Fig.5 Genetic comparison of the number 1,2,4,5 clone with wild type

圖6 3號克隆的基因序列與野生型的比對結果Fig.6 Genetic comparison of the number 3 clone with wild type

3 討論

蛋白質的體外定向進化又稱實驗分子進化，因無需事先了解蛋白的空間結構和作用機制，所以幾乎適用于任何蛋白質分子的改造和優選，為研究蛋白質結構與功能之間的關系提供了一種更方便、更快捷的新途徑[2]。定向進化是否成功主要受以下3個方面的影響：①合理的進化策略；②合適的表達系統；③高通量的篩選方法。

在前期的實驗中，研究組已成功構建了BPI23的釀酒酵母細胞表面展示系統，該系統能表達功能性BPI23，并可用流式細胞儀進行快速鑒定和高通量分選[5]，適合于大容量突變體庫的篩選和BPI23的進化研究。但有了合適的表達系統和高通量的篩選方法，還必須在有足夠大的突變體庫構建成功的基礎上才能發揮作用。

易錯PCR是一種簡便易行的蛋白質定向進化策略，已廣泛應用于蛋白質的體外進化，如酶活性的提高[6-8]、酶熱穩定性的改良[9]等。在本實驗中，通過控制Mg2+或Mn2+的濃度進行連續易錯PCR的方法[10]，成功進行了BPI600的隨機突變，突變率在2.3%，較為適于后續優勢株的篩選[11]。到目前為止，尚未見到BPI亞型的報道，因此選擇易錯PCR產生的隨機突變庫作為進化的出發點，可能是避免異源基因導入的一個有效的方法。DNA改組是用DNaseI消化或超聲處理多條具有同源序列的基因(一般同源性>70%)或基因家族[12]。

圖7 2、4號改組克隆的氨基酸序列與野生型的比對結果Fig.7 Amino acid comparison of the number 2,4 clone with wild type

產生基因隨機裂解片段后，先用無引物PCR進行基因重排，然后再進行有引物PCR擴增全長基因可獲得大容量基因突變體庫，目前DNA改組技術廣泛應用于基因突變體庫的構建，大容量的突變庫再結合高通量的篩選方法，便于優勢突變體的篩選[13-15]。本實驗在易錯PCR產生隨機突變的基礎上進行DNA改組，與采用單純的隨機突變或定點突變方法構建的突變庫相比，產生的庫容量大、多樣性好，可有效積累更多的有益突變，同時也可實現同源序列間的大片段交換，從而達到目的蛋白多種特性共進化的目的。實驗結果表明，構建的pYD1-shuffledBPI600重組質粒中含有能夠翻譯為完整BPI23突變體的DNA片段，但文庫中也存在一些突變克隆，因含終止密碼子，最終只能翻譯BPI23的部分氨基酸片段。本實驗成功構建了庫容量達2×105的BPI600突變體庫和pYD1-shuffledBPI600重組質粒文庫，為下一步篩選優勢突變體的研究提供了新途徑。

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ConstructionandidentificationofgenemutationlibraryoftheN-terminalfragmentsofhumanbactericidal/permeabilityincreasingproteins

Li Jingqin1,Kong Qingli2,An Yunqing2*

(1.DepartmentofMedicalLaboratoryScience,YanjingMedicalCollege，CapitalMedicalUniversity，Beijing101300,China;2.DepartmentofImmunology,SchoolofBasicMedicalSciences,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)

ObjectiveTo construct and identify a gene mutation library of the N-terminal fragments of human bactericidal/permeability increasing proteins (BPI23) for enhancing its activity binding lipopolysaccharides (LPS) by error-prone polymerase chain reaction (PCR) and DNA shuffling method.MethodsError-prone PCR was used to obtain random mutant fragments ofBPI600by adding different concentrations of Mg2+and Mn2+.Random mutation rate was calculated by DNA sequencing and genetic comparison with wild-typeBPI600.The product of error-prone PCR was further mutated via DNA shuffling.The reassembled product was cloned into pYD1 vector and transformed intoE.coliXL10-Gold.Ten clones were randomly picked out,digested and identified by restriction enzymeHindⅢ andXhoⅠ.The positive clones were identified by DNA sequencing.ResultsDNA sequencing result showed that the random mutation rate was 2.3% by error-prone PCR.After DNA shuffling,6 positive clones includingBPI600were identified in the 10 random clones selected from LB culture medium with ampicillin.Among them,4 had 6,9,11 and 14 mutations,respectively;1 had 10 mutations and 1 deletion determined by DNA sequencing.By amino acid comparison,only 2 DNA mutants were able to encode a full-length mutant BPI23protein,with 4 and 14 amino acid mutations respectively.ConclusionA library of BPI23mutants was constructed with a size of 2×105.The results laid the foundation for the study of its activity binding LPS.

human bactericidal/permeability increasing protein;directed evolution;error-prone polymerase chain reaction(PCR);DNA shuffling

*Corresponding author，E-mail：anyunq@ccmu.edu.cn

時間：2017-12-13 21∶09

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20171213.2109.026.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.06.024]

Q78

2017-10-16)

編輯 陳瑞芳