中晚期宮頸鱗狀細(xì)胞癌同步放化療敏感性相關(guān)血清miRNA的臨床研究

錢閱宬++++++張重寅++++++張鵬++++++周釵++++++呂曉娟

[摘要] 目的 探討中晚期宮頸鱗狀細(xì)胞癌同步放化療敏感性相關(guān)的血清miRNA。 方法 收集2014年2～12月在我院婦科接受根治性同步放化療的20例中晚期宮頸癌患者為研究對(duì)象，按照患者治療過(guò)程及隨訪過(guò)程中腫瘤評(píng)估的情況，將研究對(duì)象分為同步放化療抗拒組（n=10）和同步放化療敏感組（n=10），篩選抗拒組和敏感組間具有顯著表達(dá)差異的miRNA，對(duì)比兩組miR-136-5p、miR-152-3p、miR-206的表達(dá)情況。 結(jié)果 在芯片篩選出的miRNA中，抗拒組和敏感組之間具有顯著表達(dá)差異的miRNA有3個(gè)：抗拒組相較敏感組低表達(dá)的為miR-136，抗拒組相較敏感組高表達(dá)的為miR-152和miR-206。標(biāo)本定量驗(yàn)證結(jié)果顯示，敏感組hsa-miR-136-5p的表達(dá)水平高于抗拒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；敏感組hsa-miR-206的表達(dá)水平低于抗拒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；敏感組和抗拒組hsa-miR-152-3p的表達(dá)水平，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論 中晚期宮頸癌患者血清中miRNA-136的表達(dá)下調(diào)、miRNA-206的表達(dá)上調(diào)可能與同步放化療抗拒有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 宮頸鱗狀細(xì)胞癌；miRNA；放療；化療；敏感性

[中圖分類號(hào)] R737.33 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）31-0001-04

[Abstract] Objective To investigate the simultaneous chemoradiotherapy sensitivity related serum miRNAs of middle and advanced cervical squamous cell carcinoma. Methods A total of 20 patients with middle and advanced cervical squamous cell carcinoma who underwent radical concurrent radiotherapy and chemotherapy from February 2014 to December 2014 were enrolled in this study. According to the course of treatment and the evaluation of tumor during follow-up， the subjects were divided into simultaneous chemoradiotherapy resistant group（n=10） and simultaneous chemoradiotherapy sensitive group（n=10）. The miRNAs with significant difference in expression between the resistant group and the sensitive group were screened. The expressions of miR-136-5p， miR-152-3p and miR-206 were compared between the two groups. Results In the miRNA selected by chip， there were three miRNAs with significant difference between the resistant group and the sensitive group. The expression of miR-136 was lower in the resistant group than that in the sensitive group， and the expressions of miR-152 and miR-206 were higher than those of the sensitive group. Specimen quantitative verification results showed that the expression level of hsa-miR-136-5p in sensitive group was higher than that in resistant group， and the difference was significant（P<0.01）. The expression level of hsa-miR-206 in sensitive group was lower than that in resistant group， and the difference was statistically significant（P<0.01）. There was no significant difference in the expression level of hsa-miR-152-3p between sensitive group and resistant group（P>0.05）. Conclusion The downregulation of miRNA-136 and upregulation of miRNA-206 may be related to the resistance of the simultaneous chemoradiotherapy in patients with middle and advanced cervical squamous cell carcinoma.

[Key words] Cervical squamous cell carcinoma； miRNA； Radiotherapy； Chemotherapy； Sensitivityendprint

同步放化療是中晚期宮頸癌常用的治療方案，對(duì)降低中晚期宮頸癌的復(fù)發(fā)和病死風(fēng)險(xiǎn)具有重要價(jià)值[1-2]。部分中晚期宮頸癌患者在接受同步放化療后，病情暫時(shí)得到控制，但不久仍會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[3]。目前中晚期宮頸癌放化療的敏感性已得到足夠重視，但具體機(jī)制目前尚未完全明晰，患者預(yù)后差，生存期明顯縮短[4]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和進(jìn)步及中晚期宮頸癌放化療敏感性相關(guān)的生化因子不斷被發(fā)現(xiàn)，其中與中晚期宮頸癌同步放化療敏感性相關(guān)的血清miRNA也被不斷重視[5-6]。本研究對(duì)此進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料

收集2014年2～12月在我院婦科接受根治性同步放化療的20例中晚期宮頸癌患者為研究對(duì)象，經(jīng)病理活檢結(jié)果，患者腫瘤分期為Ⅱb-Ⅳa期，病理類型為宮頸鱗狀細(xì)胞癌[7]。患者年齡35～80歲，平均（47.66±5.21）歲；病程3～5年，平均（2.32±0.64）年；其中5例患者有宮頸癌家族史。本項(xiàng)研究獲我院倫理委員會(huì)審批通過(guò)。納入標(biāo)準(zhǔn)[7]：（1）FIGO臨床分期為Ⅱb～Ⅳa期；（2）同步放化療前未接受過(guò)盆腔放療與化療；（3）KPS評(píng)分≥70分；（4）患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)[7]：（1）患有其他系統(tǒng)的惡性腫瘤患者；（2）患有不能耐受放化療治療的疾病患者；（3）患有精神疾病、嚴(yán)重肝腎疾病者。

1.2方法

1.2.1 治療方法 對(duì)所有患者進(jìn)行根治性同步放化療。

1.2.2 分組標(biāo)準(zhǔn) 以同步放化療完成后12個(gè)月為界，按照患者治療過(guò)程及隨訪過(guò)程中腫瘤評(píng)估的情況，將研究對(duì)象分為同步放化療抗拒組（n=10）和同步放化療敏感組（n=10），兩組患者基本資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。見表1。

1.3標(biāo)本的收集

采集所有患者清晨空腹血4 mL，3500 rpm轉(zhuǎn)速離心5 min，提取上清液-80 °C保存待測(cè)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

使用miRNA提取試劑盒進(jìn)行miR-214抽提，實(shí)驗(yàn)過(guò)程按照試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行，抽提之后，使用核酸濃度檢測(cè)儀檢測(cè)RNA濃度和純度，最后將其濃度稀釋至50 μg/mL，使用特異性反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行cDNA合成，反應(yīng)條件按照cDNA合成試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行設(shè)置。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min、95 ℃變性15 s、60 ℃退火32 s，循環(huán)50次后檢測(cè)其溶解曲線，檢測(cè)完成后，通過(guò)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)自動(dòng)分析各樣本Ct值，然后采用2-ΔΔCt計(jì)算miRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用Megaplex RT Primers反轉(zhuǎn)錄miRNA靶點(diǎn)及用可選的Megaplex PreAmp Primers預(yù)擴(kuò)增之后，配制PCRMix，TaqMan MiRNA Array（A+B）上樣，行標(biāo)本定量驗(yàn)證，然后在7900HT定量PCR儀上運(yùn)行分析。對(duì)比兩組miR-136-5p、miR-152-3p、miR-206的表達(dá)情況?？咕芙M和敏感組間差異表達(dá)的miRNA采用TaqMan miRNA表達(dá)譜芯片篩選。對(duì)miRNA芯片結(jié)果進(jìn)行分析，以變化倍數(shù)Fold change>2.0或<0.5為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出組間表達(dá)差異顯著的miRNA。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有的統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 16.0軟件包（SPSS，Chicago，IL）進(jìn)行，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，執(zhí)行方差分析或t檢驗(yàn)；應(yīng)用GraphPadPrism5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)圖形制作。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1芯片篩選結(jié)果

共篩選出組間表達(dá)差異顯著的miRNA 212個(gè)，以敏感組為對(duì)照，抗拒組顯著高表達(dá)的miRNA有62個(gè)；抗拒組顯著低表達(dá)的miRNA有150個(gè)。在芯片篩選出的miRNA中，抗拒組和敏感組之間具有顯著表達(dá)差異的miRNA有3個(gè)：抗拒組相較敏感組低表達(dá)的是miR-136，抗拒組相較敏感組高表達(dá)的是miR-152和miR-206。芯片miRNA分布散點(diǎn)圖見圖1（Array A）及圖2（Array B）。

2.2標(biāo)本定量驗(yàn)證結(jié)果

標(biāo)本定量驗(yàn)證結(jié)果顯示，敏感組hsa-miR-136-5p的表達(dá)水平高于抗拒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；敏感組hsa-miR-206的表達(dá)水平低于抗拒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；敏感組和抗拒組hsa-miR-152-3p的表達(dá)水平，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

3 討論

最近很多研究已經(jīng)顯示了miRNA表達(dá)在多種惡性腫瘤中都有相應(yīng)的監(jiān)管機(jī)制，包括肺癌、肝癌、結(jié)腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等[8-9]。其中某些miRNA已經(jīng)被廣泛認(rèn)可是關(guān)鍵的致癌基因或抑癌基因[10]。目前惡性腫瘤的治療方案中，放射治療是常見的治療方案之一，尤其是針對(duì)非小細(xì)胞肺癌，放射治療是出現(xiàn)播散和轉(zhuǎn)移后的有效首選方案，但是其對(duì)放射劑量的耐受和敏感性降低是目前臨床上存在的主要問(wèn)題[11]。曾有學(xué)者研究指出部分miRNA在惡性腫瘤的放射治療過(guò)程中對(duì)腫瘤細(xì)胞的放療敏感反應(yīng)有一定的調(diào)控作用。然而，目前尚沒有關(guān)于miR-214在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)和與放射治療相關(guān)性的研究。因此，我們?cè)诜伟╊愋椭羞x取了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株進(jìn)行miRNA分析和放療敏感性的研究。

目前miRNA表達(dá)譜芯片技術(shù)已被用于臨床miRNA差異化表達(dá)的篩選中，被證明具有高敏感度和特異度[12-14]。我們?cè)谘芯恐?，將病例按照放化療敏感性及是否出現(xiàn)抵抗分為敏感組和抗拒組，兩組間病例基本資料匹配度良好，因此保證了兩組間具有可比性。經(jīng)使用miRNA表達(dá)譜芯片技術(shù)，我們篩選出miRNA-136、miRNA-152、miRNA-206這3組表達(dá)存在顯著差異的miRNA。將miRNA-136、miRNA-152、miRNA-206進(jìn)行擴(kuò)大樣本量行PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示，敏感組和抗拒組間miRNA-152的表達(dá)不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但敏感組和抗拒組間miRNA-136、miRNA-206的表達(dá)仍然存在一定的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。我們發(fā)現(xiàn)，對(duì)同步放化療抗拒的中晚期宮頸癌患者血清miRNA-136呈低表達(dá)，而miRNA-206則呈高表達(dá)。表明miRNA-136、miRNA-206與中晚期宮頸癌同步放化療敏感性具有一定的聯(lián)系[15-16]。因此我們對(duì)miRNA-136、miRNA-206與中晚期宮頸癌同步放化療敏感性的關(guān)系進(jìn)行重點(diǎn)探討。endprint

miRNA-136在不同類型的惡性腫瘤中發(fā)揮的作用不盡相同：在卵巢癌、肝癌等腫瘤組織中，miRNA-136低表達(dá)[17]，而在肺癌、乳腺癌等惡性腫瘤組織中，miRNA-136則呈現(xiàn)高表達(dá)[13]。有國(guó)外研究[12]顯示，對(duì)順鉑耐藥的卵巢上皮癌患者腫瘤組織中，miRNA-136表達(dá)下調(diào)。而在對(duì)替莫唑胺耐藥的神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者組織中，miRNA-136同樣呈現(xiàn)低表達(dá)[18]。我們的研究中，對(duì)同步放化療抗拒的中晚期宮頸癌患者血清miRNA-136呈低表達(dá)，這與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。表明miRNA-136的表達(dá)下調(diào)與中晚期宮頸癌同步放化療抗拒的產(chǎn)生有關(guān)。miRNA-136誘導(dǎo)患者對(duì)化療抗拒的可能機(jī)制為：miRNA-136可以抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，提高順鉑導(dǎo)致DNA損傷的修復(fù)能力[19]。

miRNA-206被認(rèn)為與肌肉組織相關(guān)。miRNA-206在不同類型的惡性腫瘤中情況相同，在肺癌、子宮內(nèi)膜癌、橫紋肌肉瘤等腫瘤中均表達(dá)下調(diào)[20]，但miRNA-206在乳腺癌中的表達(dá)與雌激素受體的表達(dá)有關(guān)，在雌激素受體陰性的患者組織中，miRNA-206表達(dá)上調(diào)，而在雌激素受體陽(yáng)性的患者組織中，miRNA-206的表達(dá)下調(diào)[15]。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)miRNA-206的表達(dá)與惡性腫瘤放化療敏感性關(guān)系的研究較少。本研究中，中晚期宮頸癌同步放化療出現(xiàn)抗拒的患者組織中，miRNA-206表達(dá)上調(diào)。這提示miRNA-206的表達(dá)狀況與中晚期宮頸癌同步放化療敏感性密切相關(guān)。本研究為相關(guān)研究提供了一定的依據(jù)。但有關(guān)miRNA-206的表達(dá)導(dǎo)致中晚期宮頸癌同步放化療抗拒的機(jī)制及相關(guān)信號(hào)通路仍然有待進(jìn)一步深入研究。

本研究結(jié)果表明，miRNA作為與惡性腫瘤發(fā)病密切相關(guān)的生化指標(biāo)，其表達(dá)水平與中晚期宮頸癌同步放化療敏感性亦密切相關(guān)。因此臨床上可以通過(guò)對(duì)相關(guān)miRNA進(jìn)行靶向干預(yù)，進(jìn)而提高中晚期宮頸癌患者對(duì)同步放化療的敏感性，并提高治療效果。中晚期宮頸癌患者血清中miRNA-136的表達(dá)下調(diào)、miRNA-206的表達(dá)上調(diào)可能與同步放化療抗拒有關(guān)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 傅祝能，吳榮輝，孫海芳，等.HPV感染、宮頸炎、CIN及宮頸癌患者的宮頸黏膜脫落細(xì)胞端粒酶定量研究[J].中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2014，28（1）：23-25.

[2] 杜紅雁，張海雁，張瑜，等.顆粒細(xì)胞集落刺激因子在宮頸癌組織中的表達(dá)及其意義[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2016， 96（5）：358-360.

[3] 李瑋，呂杰強(qiáng)，魯意，等.人乳頭狀瘤病毒混合感染對(duì)高度鱗狀上皮內(nèi)病變和宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)研究[J].中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2015，29（1）：41-43.

[4] 杜欣欣，賽曉勇，劉愛軍，等.宮頸癌篩查系統(tǒng)在宮頸癌篩查中的診斷價(jià)值[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2015，95（29）：2379-2381.

[5] Cheng X，Xi QY，Wei S，et al. Critical role of miR-125b in lipogenesis by targeting stearoyl-CoA desaturase-1（SCD-1）[J]. J Anim Sci，2016，94（1）：65-76.

[6] Zhao X，He W，Li J，et al. MiRNA-125b inhibits proliferation and migration by targeting SphK1 in bladder cancer[J]. Am J Transl Res，2015，7（11）：2346-2354.

[7] 王靜.標(biāo)準(zhǔn)·方案·指南——2014年美國(guó)癌癥學(xué)會(huì)最新宮頸癌篩查指南及篩查中存在的問(wèn)題[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2014，（27）：3163-3164.

[8] Sozzi G，Boeri M，Rossi M，et al. Clinical utility of a plasma-based miRNA signature classifier within computed tomography lung cancer screening：A correlative MILD trial study[J].Journal of Clinical Oncology，2014， 32（8）：768-773.

[9] Sánchez-Martínez R，Cruz-Gil S，de Cedrón MG，et al. A link between lipid metabolism and epithelial-mesenchymal transition provides a target for colon cancer therapy[J].Oncotarget，2015，6（36）： 38719.

[10] 楊繼學(xué)，孫有樹，楊廷桐. miRNA 與肺癌研究新進(jìn)展[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，（2）：146-149.

[11] 丁金泉，李為之，張群貴，等.三維適形放療聯(lián)合紫杉醇單藥每周化療治療老年非小細(xì)胞肺癌的療效觀察[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生，2016，54（24）：75-77.

[12] Parisi C，Napoli G，Amadio S，et al. MicroRNA-125b regulates microglia activation and motor neuron death in ALS[J]. Cell Death Differ，2016，23（3）：531-541.

[13] 張劍英，劉班，張毅敏，等.宮頸癌患者外周血中調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞的變化及其臨床意義[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2015，35（10）：753-758.endprint

[14] 龐曉?shī)S，張瑤，魏恒，等.高遷移率族蛋白1激活核轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)通路促進(jìn)宮頸癌間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變的機(jī)制[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2015，95（9）：719-720.

[15] 張蔚，劉珍，胡曉霞，等.宮頸癌中異常表達(dá)microRNA與HPV-16 E6/E7基因相關(guān)性分析[J].中華實(shí)用診斷與治療雜志，2016，30（2）：120-123.

[16] 陳瑞萍，麥振聲，徐建平.高危型人乳頭瘤病毒感染與microRNA-155在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織和血清的表達(dá)及意義[J].婦產(chǎn)與遺傳：電子版，2016，6（2）：26-30.

[17] Vega-Pea A，Illades-Aguiar B，F(xiàn)lores-Alfaro E，et al. Risk of progression of early cervical lesions is associated with integration and persistence of HPV-16 and expression of E6，Ki-67，and telomerase[J]. J Cytol，2013，30（4）：226-232.

[18] Zhao L，Wang W. miR-125b suppresses the proliferation of hepatocellular carcinoma cells by targeting Sirtuin7[J]. Int J Clin Exp Med，2015，8（10）：18469-18475.

[19] Sun X，Zhang S，Ma X. Prognostic value of MicroRNA-125 in various human malignant neoplasms： A Meta-analysis[J]. Clin Lab，2015，61（11）：1667-1674.

[20] Zang B，Huang G，Wang X，et al. HPV-16 E6 promotes cell growth of esophageal cancer via downregulation of miR-125b and activation of Wnt/β-catenin signaling pathway[J].Int J Clin Exp Pathol，2015，8（10）：13687-13694.

（收稿日期：2017-08-14）endprint