高脂飲食對去卵巢大鼠骨微結構、骨IL—6及M—CSF mRNA水平的影響

薛英++++++王永炫

[摘要] 目的 觀察高脂飲食對絕經后雌性SD（sprague-dawiey）大鼠骨微結構、骨組織白介素-6（IL-6）及巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）mRNA的影響，探討高脂對骨微結構的影響及其可能的發病機制。 方法 將40只6月齡雌性SD大鼠隨機分為假手術+普通飼料飼養組（SHAM組）、假手術+高脂飼料飼養組（HFD組）、去卵巢+普通飼料組（OVX組）、去卵巢+高脂飼料飼養組（OVX+HFD組），每組10只。6個月后用微計算機斷層掃描（Micro-CT）等方法檢測大鼠右側脛骨的骨微結構。用實時熒光定量聚合酶鏈反應（Realtime RT-PCR） 測量大鼠左側股骨中IL-6和M-CSF mRNA的表達差異。 結果 6個月后，OVX 組的骨體積（BV/TV）、骨小梁數目（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）低于SHAM組，骨小梁分離度（Tb.Sp）大于SHAM組（P<0.05）；OVX 組BV/TV、Tb.N均大于OVX+HFD組，Tb.Sp小于OVX+HFD組（P<0.05）；SHAM組 BV/TV、Tb.N、Tb.Th高于SHAM+HFD組， SHAM + HFD與OVX組相比，除Tb.N外，其BV/TV、Tb.Th及Tb.Sp均無明顯差異（P>0.05）。OVX組M-CSF和IL-6 mRNA的表達均高于SHAM組（P<0.05）。SHAM的 M-CSF和IL-6 mRNA的表達低于SHAM+HFD組（P<0.05），SHAM+HFD的M-CSF和IL-6 mRNA的表達低于OVX組（P<0.05），但OVX組與OVX+HFD組比較，M-CSF和IL-6 mRNA的表達無顯著差異（P>0.05）。 結論 高脂引起的骨微結構的改變有可能是通過提高IL-6、M-CSF mRNA水平，導致破骨細胞活性增強、骨吸收增加引起的。

[關鍵詞] 高脂飲食；骨質疏松癥；骨微結構；白介素-6；巨噬細胞集落刺激因子

[中圖分類號] R392 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）31-0035-05

[Abstract] Objective To observe the effects of high-fat diet on bone microstructure， bone interleukin-6（IL-6）and macrophage colony-stimulating factor（M-CSF）mRNA in postmenopausal female SD rats（Sprague-dawiey）， and to explore the impact of high fat on bone microstructure and its potential pathogenesis. Methods A total of 40 female SD rats with 6 months old were randomly divided into sham operation+normal feed group（SHAM group）， sham operation+ high-fat feed group（HFD group）， ovariectomized+ normal feed group（OVX group）and ovariectomized+ high-fat feed group（OVX + HFD group）， with 10 rats in each group. After 6 months， microcomputer tomography（Micro-CT） and other methods were used to detect the bone microstructure of the right tibia. Realtime PT-PCR was used to measure the expression difference of IL-6 and M-CSF mRNA in the left femur of the rats. Results After 6 months， the bone volume（BV/TV）， the number of trabecular bone（Tb.N）and trabecular bone thickness（Tb.Th）in the OVX group were significantly lower than those in SHAM group， while the separation of trabecular bone（Tb.Sp）was higher than that in SHAM group（P<0.05）； BV/TV， Tb.N in OVX group were higher than those in OVX + HFD group， and Tb.Sp was lower than that in OVX + HFD（P<0.05）； BV/TV， Tb.N， Tb.Th in SHAM group were all higher than those in SHAM + HFD group. Compared with OVX group， other than Tb.N， BV/TV， Tb.Th and Tb.Sp in SHAM + HFD group were not significantly different（P>0.05）. The expression of M-CSF and IL-6 mRNA in OVX group was higher than that in SHAM group（P<0.05）. The expression of M-CSF and IL-6 mRNA in SHAM group was lower than that in SHAM + HFD group（P<0.05）. The expression of M-CSF and IL-6 mRNA in SHAM + HFD group was lower than that in OVX group（P<0.05）. However， there was no significant difference in the expression of M-CSF and IL-6 mRNA between OVX group and OVX + HFD group（P>0.05）. Conclusion Changes in bone microstructure induced by high fat may be caused by increased IL-6 and M-CSF mRNA levels， resulting in enhanced osteoclast activity and increased bone resorption.endprint

[Key words] High-fat diet；Osteoporosis；Bone microstructure；Interleukin-6（IL-6）； Macrophage colony-stimulating factor（M-CSF）

研究表明，高脂飲食可以導致肥胖、糖尿病、冠心病、動脈粥樣硬化、胰島素抵抗等一系列疾病，近年來越來越多的研究發現，高脂飲食隨后引起的膽固醇（total cholesterol，TC）和低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDLC）及甘油三酯（triglyceride，TG）水平的升高，高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDLC）水平降低，與骨質疏松癥密切相關，高脂引起骨質疏松的機制包括骨髓間充質干細胞向成骨分化減弱、成脂分化增強[1]；高脂血癥時脂質氧化產物能促進活性氧簇（ROS）形成，導致氧化應激增強[2]，且與炎癥因子的激活有關。高脂飲食能引起胰島素抵抗、肝臟IL-6水平升高[3]，但其對骨組織IL-6和M-CSF的影響仍未見報道，是否通過增加IL-6，M-CSF的表達影響破骨活性亟待進一步驗證，本文就高脂飲食喂養后骨微結構及骨組織IL-6、M-CSF mRNA表達做一探討。

1材料與方法

1.1 實驗動物與飼料

實驗動物為福建醫科大學提供的6月齡清潔級雌性SD（sprague-dawiey）大鼠，實驗動物許可證號：SYXK（閩2016-0007），動物飼料購自福建醫科大學，高脂飼料購自江蘇協同生物，配方見表1。

1.2方法

6月齡清潔級雌性SD（sprague-dawiey）大鼠40只，體重（300±20）g，分籠飼養，室溫（20±3）℃，相對濕度40%～60%，給予不同類型的飼料，自由飲水。將40 只SD大鼠隨機分為假手術組（SHAM組，n=20）與去卵巢組（OVX組，n=20），用l0%水合氯醛0.3 mL/l00 g腹腔注射麻醉，后打開腹腔，OVX組摘除雙側卵巢，SHAM組僅切除卵巢附近與卵巢等大的脂肪組織。術后所有大鼠均予肌內注射青霉素5 萬U/d，持續3 d，預防感染。

術后，去卵巢組進一步分為去卵巢后高脂飼料飼養組（OVX+HFD組）和去卵巢后普通飼料飼養組（OVX組），每組各10只。假手術組分為假手術后高脂飼料飼養組（SHAM+HFD組）和假手術后普通飼料飼養組（SHAM），每組10只。

1.3干預措施

高脂飼料喂養6個月后，拖頸處死，用微計算機斷層掃描（micro-CT，型號：SCANCO VIVACT40）檢測大鼠右側脛骨骨微結構；用實時熒光定量聚合酶鏈反應法（Realtime RT-PCR）（TP800， 日本TaKaRa）檢測大鼠左股骨M-CSF和IL-6 mRNA的表達。

1.4 檢測指標

1.4.1 Micro-CT 各組右側脛骨Micro-CT骨組織掃描：參數為：掃描分辨率：50 μm，旋轉角度：360 度，旋轉角度增：0.72 度，電壓：70 kVP，功率：40 W，幀平均數：6，像素組合：1×1。BV/TV：相對骨體積，Tb.N：骨小梁數目，Tb.Sp：骨小梁分離度，Tb.Th.：骨小梁平均厚度。

1.4.2 Realtime PCR 各組大鼠左股骨， 采用Realtime RT-PCR（TP800，日本TaKaRa）檢測左股骨組織。

表達引物設計、骨組織總RNA提取、聚合酶鏈反應及目的基因相對量的計算參照相關文獻[4]。

1.5 統計學方法

采用SPSS 23.0統計學軟件包進行統計分析，所得正態分布的計量資料以均數±標準差表示，采用LSD-t 檢驗，多組間計量單位比較采用方差分析及SNK法。兩組計量資料變量間相關性比較采用線性相關分析。計數資料采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Micro-CT檢測右側脛骨的骨微結構

各組大鼠高脂飼養6個月后，予Micro-CT檢測各組右側脛骨的骨微結構（圖1）及微結構參數（圖2），OVX 組的BV/TV、Tb.N、Tb.Th低于SHAM組，Tb.Sp大于SHAM組，差異有統計學意義（P<0.05或P<0.001），表明造模成功。OVX 組與OVX+HFD組比較，其BV/TV、Tb.N均大于OVX+HFD組，Tb.Sp小于OVX+HFD組，差異有統計學意義（P<0.05或P<0.001），但其Tb.Th，兩組比較差異無統計學意義（P>0.05）。SHAM組與SHAM+HFD組比較，其BV/TV、Tb.N、Tb.Th高于SHAM+HFD組（P<0.01），但Tb.Sp，兩組比較差異無統計學意義（P>0.05）。SHAM + HFD組與OVX組比較，除Tb.N外，其BV/TV、Tb.Th及Tb.Sp均無明顯差異（P>0.05）。見圖2。

2.2 各組大鼠股骨M-CSF和IL-6 mRNA表達的影響

高脂飼養6個月后，檢測左側股骨M-CSF和IL-6 mRNA的表達情況。結果表明，OVX組與SHAM組比較，其M-CSF和IL-6 mRNA的表達均高于SHAM組，差異有統計學意義（P<0.001）。SHAM組與SHAM+HFD組比較，其M-CSF和IL-6 mRNA的表達低于SHAM+HFD組（P<0.001），SHAM+HFD組與OVX組，其M-CSF和IL-6 mRNA的表達低于OVX組（P<0.001），但OVX組與OVX+HFD組比較，M-CSF和IL-6 mRNA的表達無顯著差異（P>0.05）。見圖3、4。

3 討論endprint

構成骨骼健康和力量的重要因素不僅包括骨礦物質密度，而且還包括骨微觀結構的特征[5-6]。Micro-CT是一個常用于評估骨微觀結構的有效測量方法，其提供了量化的結構信息，包括骨區、骨體積分數、骨小梁數量、骨小梁厚度及骨小梁分離度之間具體的參數，并且骨微觀結構的三維重建[7]。

近幾年在肥胖和骨骼健康的相關性中有許多報道。當伴隨著肥胖、血膽固醇、中性脂肪和低密度脂蛋白膽固醇升高，出現骨密度及骨微結構改變，骨折風險增加[8]，在一項小鼠模型中，由于高脂飲食導致的肥胖，出現骨髓脂肪的增加，Micro-CT所檢測的骨密度及骨微結構的改變，即使減重后，對已造成的骨丟失仍無法恢復，表明高脂對骨質量的改變是長期、持續性的損害[9]。研究表明，假手術組SD大鼠分別經高脂飼料及普通飼料飼養6個月后，高脂組骨小梁厚度和數目減少，骨小梁分離度增加，在三維結構中，高脂飼料飼養的大鼠，與普通飼料飼養的大鼠比較，骨小梁較為稀疏，厚度變薄，且小梁與小梁間的連接中斷，這些微結構的變化導致骨小梁總數下降，骨質量下降。且去除卵巢后，高脂飲食能夠進一步加重骨丟失（圖3、4），與目前國內外的報道一致。

引起骨質疏松的主要原因在于骨微環境中成骨與破骨的失衡。高脂飲食后導致的機體脂代謝異常，繼發骨質疏松，可能與以下因素有關：（1） 骨髓間充質干細胞向成脂分化增強，成骨分化減弱，其中包括骨形態發生蛋白-2（BMP-2）活性的抑制，而過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）活性的增強[9]；（2）與骨組織中脂質的持續聚集有關；（3）持續聚集的脂質會導致糖基化和氧化修飾，從而誘發炎癥反應以及氧化應激的發生，炎癥因子增加，如白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等 [10-12]。

IL-6是由T、B細胞和纖維母細胞、單核巨噬細胞以及成骨細胞激活后分泌而成。絕經后，雌激素水平的急劇下降，導致成骨表面的雌激素受體對IL-6的抑制下降，IL-6形成增加。高脂引起的IL-6升高的原因之一與胰島素抵抗有關，合并代謝綜合征患者（如肥胖、糖尿病等），體內一般存在較高水平的IL-6[13]。IL-6能夠促進脂肪前體細胞向脂肪細胞轉化，抑制成骨前體細胞向成骨細胞轉化，成骨細胞形成減少，骨細胞合并骨膠原的能力下降，抑制骨形成。大鼠高脂喂養8周即可產生胰島素抵抗[14]。而脂肪細胞生成增多導致的肥胖進一步促使炎癥因子合成[15]。本課題中，去卵巢6個月后，隨著IL-6的變化，其代表骨質量的Tb.N，Tb.Th，BV/TV等微結構參數下降，且予高脂喂養后，上述參數進一步下降，IL-6 mRNA表達仍有上升趨勢，但無統計學意義。表明高脂喂養后，除IL-6外，可能還有其他的影響因素參與骨丟失。

在骨骼細胞形成分化的過程中，還有其他炎癥因子的參與。破骨細胞的成熟與分化信號之一是通過成骨細胞提供的M-CS與表達于破骨細胞前體細胞表面的同源受體c-fms進行傳遞。M-CSF主要存在于骨髓腔中，它與RANKL同時作用于骨髓中破骨前體細胞的表達。本課題的前期實驗中表明，絕經后可以導致M-CSF水平的升高[4]，但在高脂環境下，其與骨微結構的關系如何未見報道。本實驗表明，絕經后，普通飼料飼養組隨著骨質量下降，M-CSF mRNA的表達升高，但高脂飼養后，IL-6未有進一步變化。而SHAM組予高脂飼料飼養組，骨質量下降，且出現M-CSF的上升。M-CSF調節骨代謝的機制如何？絕經后，雌激素缺乏，可引起脂代謝及骨代謝的障礙。動脈粥樣硬化泡沫細胞與破骨細胞有同源性，均來源于骨髓的單核巨噬細胞系統。雌激素缺乏引起膽固醇及低密度脂蛋白等升高，脂質斑塊沉著，同時對破骨細胞的抑制減弱，破骨細胞活性增強。研究表明，動脈粥樣硬化的脂質沉著處M-CSF水平表達增加[16]，當絕經后，雌激素水平的下降誘使IL-1和TNF等表達增加，增加后又可進一步引起“下游因子”IL-6，M-CSF的表達增加，破骨細胞活性增強，骨吸收增強。故M-CSF的增加可能為脂代謝異常和骨代謝異常的共同機制。

本實驗目前較為粗淺地分析高脂飲食與骨微結構變化及炎癥因子表達的相關性，仍有許多深層次的機制有待進一步的驗證。

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（收稿日期：2017-08-21）endprint