兒童急性B淋巴細胞白血病（B—ALL）調節性T淋巴細胞變化及調節機制分析

張小薇++++++任建敏++++++傅麗敏++++++周靈玲

[摘要] 目的 分析兒童急性B淋巴細胞白血病（B-ALL）調節性T淋巴細胞變化及調節機制。 方法 在2016年2月23日～2017年2月23日期間選取50例健康體檢者（對照組）、50例急性B淋巴細胞白血病患兒（觀察組）為實驗對象，對兩組受檢者均進行分離外周血CD4+T細胞、熒光定量PCR（RT-PCR、REAL-TIME PCR、總RNA定量和提取、RT-PCR產物鑒定）、酶聯免疫吸附試驗、流式細胞術檢測，隨后對比兩組受檢者各項檢測結果。 結果 觀察組患兒的CD28/CD4+Foxp3+（524.86±28.42）、ICOS/CD4+CD25high Foxp3+（725.69±15.74）、TGF-βRII/CD4+（61.75±10.08）、Mtge-β（58.44±10.85）、IL-35p35（326.84±35.46）、IL-35EB13（128.56±12.74）、TGF-β（81.46±5.43）、IL-10（135.75±12.75）、ICOS+/CD4+CD25high Foxp3（3.86±1.75）%、 Foxp3（812.43±56.32）、CD4+CD25high Foxp3（9.85±2.45）%均高于對照組健康體檢者的CD28/CD4+Foxp3+（158.33±21.06）、ICOS/CD4+CD25high Foxp3+（352.12±10.03）、TGF-βRII/CD4+（28.42±5.89）、Mtge-β（23.17±5.33）、IL-35p35（154.28±26.31）、IL-35EB13（48.31±6.52）、TGF-β（29.51±6.38）、IL-10（24.91±5.22）、ICOS+/CD4+CD25high Foxp3（2.45±0.85）%、 Foxp3（322.41±18.75）、CD4+CD25high Foxp3（4.12±1.75）%（P<0.05）。 結論 導致急性B淋巴細胞白血病患兒出現亞群比例失調的主要原因為轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、分化群28（Cluster of Differentiation 28）、ICOS過度活化。

[關鍵詞] 急性B淋巴細胞白血病；T淋巴細胞；調節機制；酶聯免疫吸附試驗

[中圖分類號] R73 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）31-0005-04

[Abstract] Objective To analyze the changes and regulatory mechanism of regulatory T lymphocytes in children with acute B lymphocytic leukemia（B-ALL）. Methods A total of 50 children of healthy subjects （control group） and 50 children with acute B lymphocytic leukemia （observation group） who were selected from February 23rd， 2016 to February 23rd， 2017 were selected as the study subjects. CD4+ T cells were isolated from peripheral blood in both groups， and quantitative PCR（RT-PCR， REAL-TIME PCR， total RNA quantification and extraction， RT-PCR product identification）， enzyme-linked immunosorbent assay， and flow cytometry were carried out， and then the results of each test were compared between the two groups. Results CD28/CD4+Foxp3+（524.86±28.42）， ICOS/CD4+CD25high Foxp3+（725.69±15.74）， TGF-βRII/CD4+（61.75±10.08）， Mtge-β （58.44±10.85）， IL-35p35 （326.84±35.46）， IL-35EB13（128.56±12.74）， TGF-β（81.46±5.43）， IL-10（135.75±12.75）， ICOS+/CD4+CD25high Foxp3（3.86±1.75）%， Foxp3（812.43±56.32）， CD4+CD25high Foxp3（9.85±2.45）% in the observation group were all higher than CD28/CD4+Foxp3+（158.33±21.06）， ICOS/CD4+CD25high Foxp3+（352.12±10.03）， TGF-βRII/CD4+（28.42±5.89）， Mtge-β（23.17±5.33）， IL-35p35（154.28±26.31）， IL-35EB13（48.31±6.52）， TGF-β （29.51±6.38）， IL-10 （24.91±5.22）， ICOS+/CD4+CD25high Foxp3（2.45±0.85）%， Foxp3（322.41±18.75）， CD4+CD25high Foxp3（4.12±1.75）% in the healthy subjects in the control group（P<0.05）. Conclusion The main reason for subgroup ratio imbalance in children with acute B lymphocytic leukemia is the over-activation of transforming growth factor-β（TGF-β）， cluster of differentiation 28 and ICOS.endprint

[Key words] Acute B lymphocytic leukemia（B-ALL）； T lymphocyte； Regulatory mechanism； Enzyme-linked immunosorbent assay

急性B淋巴細胞白血病屬于臨床常見疾病，發病機制尚未明確；隨著相關報道的增多，部分學者認為其與免疫水平低下和白血病細胞惡性克隆有關，但具體的抗腫瘤免疫功能異常機制尚不明確[1-3]。調節性T細胞屬于細胞亞群，是一種具有調節、免疫功能的細胞，能夠參與細胞調節和抑制腫瘤[4]。隨著對急性B淋巴細胞白血病的深入探索，可發現CD4+CD25high Foxp3細胞可通過分泌細胞因子和細胞間接觸，促使腫瘤細胞活化、發育的抑制，控制腫瘤組織的生長、發育[16]。根據腫瘤功能方式和表面標記分值表達的差異，可將其分為ICOS-Foxp3+TREG和ICOS-Foxp3+兩種完全不同的細胞亞群，其中前者主要依賴結合型接到細胞間接觸抑制，后者能夠發揮免疫抑制功能。而本文旨在探索急性B淋巴細胞白血病調節性T淋巴細胞變化的臨床意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次研究對象為2016年2月23日～2017年2月23日期間收治的50例急性B淋巴細胞白血病患兒、50例健康體檢者，其中對照組為健康體檢者，觀察組為急性B淋巴細胞白血病患兒。入選標準：（1）本次實驗對象患兒家長均了解、知情、同意本次實驗；（2）受檢者均能夠配合實驗人員完成本次操作；（3）受檢者均無嚴重心功能、肝腎功能等實質性臟器功能受損；（4）受檢者均能夠完成正常交流；（5）受檢者均無本次實驗制劑過敏；（6）受檢者均無精神家族史[5]。觀察組平均體質量（22.42±0.72）kg，平均年齡為（10.74±0.85）歲，男20例，女30例。對照組平均體質量（22.51±0.79）kg，平均年齡為（10.33±0.71）歲，男21例，女29例。兩組受檢者基本資料比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

分離外周血CD4+ T細胞：抽取受檢者靜脈血3 mL后，進行離心法分離（使用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度法），檢測外周血單個核細胞，且使用美國INVITROGEN公司提供的試劑盒，檢測外周血CD4+T細胞（實施免疫磁珠分離法），流式細胞術檢測細胞純度>97%；錐蟲藍染色判定細胞活力>95%[6-7]。

熒光定量PCR：（1）RT-PCR：選用立陶宛MBI公司提供的試劑盒，進行逆轉錄合成CDNA，且需其中1 μL作為模板，實施擴大循環，再參照GENBANK中基因MRNA序列設計相關引物；（2）總RNA定量和提取：選用美國AMBION公司提供的AM1912試劑盒，檢測外周細胞因子，且收集樣本后，進行分離處理，再按照步驟進行紫外分光光度測定RNA含量；（3）REAL-TIME PCR：選用大連寶生物提供的SYBGREEN試劑盒，進行熒光量測定，具體方式如試劑說明書；（4）RT-PCR產物鑒定：取10 μL β-actin擴增產物、Itch、TGF-β誘導早期基因1、SMAD4、SMAD3在2%瓊脂糖凝膠中，且進行回收純化，進行30 min的90 V電泳，并交由上海技術有限公司測定。將其結果與基因mRNA序列比較，Itch、TGF-β誘導早期基因1、β-actin擴增產物、SMAD4、SMAD3與GENBANK中目的基因序列完全一致[8-11]。

酶聯免疫吸附試驗：抽取兩組受檢者空腹外周靜脈血2 mL，且實施分離血清處理，離心操作維持10 min，每分鐘800 r速度進行，將上層血漿分離后，可使用美國EBIOSCIENCE公司提供的BMS249/3型號的雙抗體夾心法檢測血漿中TGF-β濃度，具體方式如說明書。

流式細胞術檢測：首先將CD4-EFLURO450設門使用全血直接計數法檢測，且進行破膜、固定處理，經可誘導性T細胞共刺激分值、CD25-PECy7、TGF-β-PE、Foxp3-APC等抗體染色30 min，再檢測CD4+ CD25high ICOS Foxp3+細胞比例和其表明膜結合型蛋白表達水平。同時另外抽取外周血1 mL，經體外刺激，實施蛋白轉運抑制劑，且在5% CO2，37 ℃溫度下，孵育6 h后，再次檢測各項指標[12-13]。

1.3 觀察指標

對比兩組受檢者的CD28/CD4+Foxp3+、ICOS/CD4+CD25high Foxp3+、TGF-βRII/CD4+、Mtge-β、IL-35p35、IL-35EB13、TGF-β、IL-10、ICOS+/CD4+CD25high Foxp3、 Foxp3、CD4+CD25high Foxp3。

1.4 統計學方法

使用SPSS17.0統計學軟件處理數據，計數資料比較采用χ2檢驗，計量資料比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義

2 結果

2.1兩組受檢者的各項檢查結果比較

分析表格，可發現觀察組患兒各項檢查結果均高于對照組健康體檢者（P<0.05），由此說明急性B淋巴細胞白血病患兒可出現細胞異常活化和亞群比例失調，且與調節性T淋巴細胞變化有關。見表1。

2.2兩組受檢者的炎性因子水平比較

觀察組IL-35p35、IL-35EB13、IL-10高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），見表2。

2.3兩組受檢者的Mtge-β、TGF-β比較

觀察組Mtge-β、TGF-β均高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），見表3。

3 討論

急性B淋巴細胞白血病以幼稚、原始淋巴細胞亞型克隆為主，屬于臨床好發的惡性腫瘤，細胞可表現為廣泛性浸潤和大量繁殖，目前其腫瘤免疫發病機制和病因尚未明確，若干預不及時，可影響機體正常造血功能，促使病情惡化，甚至危及患兒生命安全，對此類患兒，治療的關鍵在于腫瘤細胞清除和免疫監視過程[14-15]。endprint

隨著對急性B淋巴細胞白血病的深入探索，可發現CD4+CD25high Foxp3細胞可通過分泌細胞因子和細胞間接觸，促使腫瘤細胞活化、發育的抑制，控制腫瘤組織的生長、發育[16]。根據腫瘤功能方式和表面標記分值表達的差異，可將其分為ICOS-Foxp3+TREG和ICOS-Foxp3+兩種完全不同的細胞亞群，其中前者主要依賴結合型接到細胞間接觸抑制，后者能夠發揮免疫抑制功能。在早期報道中，可發現血液惡性腫瘤和實體瘤容易出現功能異常現象，主要表現為腫瘤發生、發展與TREG細胞存在密切關系，而本次實驗中，可發現患有急性B淋巴細胞疾病的兒童，外周血CD4+CD25high Foxp3明顯高于正常兒童，且水平值與機體免疫活性狀態呈正比，由此證實，此項指標能夠反映機體活化狀態，而其升高的主要原因與腫瘤組織增大有關。隨著研究的進一步探索[17-20]，可發現TREG細胞抑制功能狀態和細胞轉錄因子表達存在一定關系，當兒童合并急性B淋巴細胞白血病時，可發現ICOS+Foxp3抑制性細胞因子IL-35、IL-10和細胞轉錄因子Foxp3表達均呈上調趨勢，能夠反映機體細胞亞群功能異常和過度活化，引起病情加重，而本次實驗，也證實IL-10、ICOS+/CD4+CD25high Foxp3均高于正常兒童。

誘導TREG細胞的分子機制尚未明確，而TREG細胞能夠促使轉錄因子Foxp3的表達，且在TREG功能維持、成熟、分化過程中發揮重要作用，被學者標志為TREG的特異性標志分子。當初始CD4+T細胞表面受體TGT-βRI/II和TGF-β結合時，可觸發TIEGI和SMAD型號，前者能夠在ITCH的協助下，增強Foxp3的表達因子，后者能夠誘導Foxp3基因啟動，同時初始去甲基化的表達，從而將CD4+T細胞分化為TREG細胞。而本次研究中，可發現急性B淋巴細胞白血病患兒TGT-βRI/II、CD4+T細胞、TGF-β濃度以及ITCH表達均呈現為上升趨勢，其可能與患兒機體TGT-β信號過度活化或細胞數量異常有關，提示急性B淋巴細胞白血病患兒的TREG細胞功能和數量。

除了TGT-β信號外，ICOS+Foxp3細胞亞群分化也存在不同調節機制，ICOS可誘導ICOS+Foxp3細胞活化、增殖，與細胞表面配體ICOS結合，促進抑制性細胞因子的產生，強烈誘導ICOS+Foxp3細胞活化，而分析本次實驗，可發現急性B淋巴細胞白血病患兒存在CD28和ICOS表達增高，其提示著細胞亞群異常活化，同時機體內多種亞群比例失調或細胞異常活化均與調節性細胞因子信號有關，其中CD28、ICOS、TGT-β信號過度活化具有重要作用，但其具體分子機制還有待進一步探索、研究。

總而言之，急性B淋巴細胞白血病患兒的亞群比例失調、細胞異常活化與多種調節性細胞因子信號有關，其中以TGF-β、CD28、ICOS過度活化最為常見，但由于本次實驗樣本有限，因此其分子機制還有待探索。

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（收稿日期：2017-08-04）endprint