子宮內膜異位癥盆腔粘連大鼠模型的建立與評價

李田田，孫偉偉，趙瑞華*

(1.中國中醫科學院廣安門醫院，北京 100053； 2.北京市回民醫院，北京 100054)

子宮內膜異位癥盆腔粘連大鼠模型的建立與評價

李田田1,2，孫偉偉1，趙瑞華1*

(1.中國中醫科學院廣安門醫院，北京 100053； 2.北京市回民醫院，北京 100054)

研究報告

目的探索子宮內膜異位癥盆腔粘連大鼠模型的建立方法及評價指標。方法采用自體移植法將子宮內膜移植于大鼠腸系膜間，術后1、3、5、7、14、21、28 d分別隨機抽取8只大鼠開腹觀察病灶生長情況，采用美國生殖學會粘連分級(AFS)分級、Haber粘連評分兩種方法同時對盆腔粘連程度進行評分；同時采取各組病灶及周圍粘連腹膜組織行HE染色；術后5、7、14、21、28 d組分別采取病灶周圍粘連組織，對其組織型纖溶酶原激活劑(tPA)含量進行動態檢測。結果兩種粘連評分方法均顯示造模后5 d已形成典型的盆腔粘連；與空白對照組及假手術相比，造模5 d后各模型組大鼠盆腔粘連腹膜組織中tPA含量極度降低(P< 0.01)，造模28 d后tPA含量有上升趨勢，但仍顯著低于空白對照組及假手術組(P< 0.01)。結論采用自體移植法將子宮內膜移植于腸系膜間建立EMs盆腔粘連模型，造模術后5 d即為成熟模型，tPA與EMs盆腔粘連的發生具有相關性。

子宮內膜異位癥；盆腔粘連；大鼠；組織型纖溶酶原激活劑

子宮內膜異位癥(endometriosis，EMs)是指子宮內膜組織生長于子宮腔以外的部位，主要發生在育齡期婦女，近年來發病率呈逐年上升趨勢。盆腔粘連是內異癥的重要特征,有研究表明，80%以上的患者在初次手術時即發現有盆腔粘連[1],且術后再粘連發生率高。EMs相關痛經、不孕、慢性盆腔痛及其復發等均與盆腔粘連有關。另外，盆腔粘連越嚴重，術程越長、術中出血也愈多[2]。因此，許多學者將內異癥相關盆腔粘連治療提上議程[3]。受倫理限制，EMs盆腔粘連動物模型的建立是闡明機制、觀察療效的重要研究方法，但目前并無公認的EMs盆腔粘連動物模型，其建立與評價方法仍有待研究。研究表明，上調內異癥患者腹膜纖溶系統中組織型纖溶酶原激活劑(tissue-type plasminogen activator, tPA)表達可減輕腹膜粘連的程度[1],這提示tPA與EMs盆腔粘連有極大關系。本實驗從EMs盆腔粘連產生發展過程出發，確定模型成立時間，并對造模后不同時間點大鼠盆腔粘連組織中tPA含量經行測定，初步探討其與EMs盆腔粘連發生的關系。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級性成熟未孕雌性SD大鼠116只，8周齡，體重220±20 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供[SCXK(京)2006-0009]。飼養于中國中醫科學院廣安門醫院SPF級動物實驗室[SYXK(京)2012-0001]，燈光(12 L：12 D)，室溫 22℃。飼養動物所需的籠具及飲水瓶均由專業飼養人員高壓滅菌后提供。

1.2 主要試劑與儀器

常規手術器械包2套，超凈工作臺等。

水合氯醛(批號：20140304，國藥集團化學試劑有限公司，中國)；苯甲酸雌二醇(批號：B131204，規格4 mg: 2 mL，寧波市三生藥業有限公司，中國)；青霉素鈉(國藥準字：H13020657，規格：80萬單位/支，華北制藥股份有限公司，中國)。

大鼠酶聯免疫吸附測定(Elisa)試劑盒,由武漢華美生物工程有限公司提供；倒置顯微鏡：IX～70，日本Olympus公司產品；離心機：CT15 RE型，日本Hitachi公司產品；酶標儀：Stat Fax 2100, Awareness公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 藥物配制方法

10%水合氯醛：用100 mL無菌蒸餾水溶化10 g水合氯醛晶體；苯甲酸雌二醇：2 mL苯甲酸雌二醇與植物油18 mL混合均勻，配成1:10的苯甲酸雌二醇溶液。

1.3.2 造模方法

術前準備：術前2 d肌注4 mg/2 mL的苯甲酸雌二醇0.1 mg/(kg·d)，使其處于同一動情周期，造模前禁食12 h。

分組：造模前將72只雌性SD大鼠按照體重隨機分為空白組8只(B組)、假手術組8只(S組)、模型組(56只)。

模型制作：參考Haber造模方法[4]，模型組大鼠禁食12 h后，采用自體移植法在無菌條件下進行造模。大鼠稱重，10%水合氯醛(0.38 mL/100 g)腹腔麻醉，置于超凈臺，腹部備皮，在尿道口上約1 cm處靠左側做平行于正中線長約1.5 cm的縱切口進腹，進腹后在膀胱背側找到子宮，游離左側子宮，近端離左子宮角 1 cm 處結扎，遠端離卵巢 2 cm 處結扎，并結扎兩端間的子宮系膜血管，切除約 1.0 cm 長子宮段，立即放入盛有無菌生理鹽水的培養皿中，用眼科剪沿系膜部剪開管狀子宮，切割成3 mm × 3 mm大小的碎片，共4片，注意區分肌層與內膜面，內膜面朝向腸系膜，用5-0線縫合于右側腸系膜血管豐富處，檢查腹腔無出血后，腹腔留置青霉素鈉0.25 mL，5-0線縫合腹壁，2-0線縫合皮膚進行逐層關腹。分籠喂養，待其自然蘇醒。術后連續3 d肌注青霉素鈉0.25 mL，每天1次，以預防術后感染，術后第二天開始肌注苯甲酸雌二醇0.1 mg/kg·d，以促進異位灶的生長。

假手術組制作：術前準備、麻醉、子宮的切除方法同模型組，緊貼腸系膜縫4針5/0尼龍線。

1.3.3 觀察指標及測定方法

模型組分別于造模術后第1天(M1組)、3天(M2組)、5天(M3組)、7天(M4組)、14天(M5組)、21天(M6組)、28天(M7組)隨機抽取8只大鼠，其中第28天同時將假手術組開腹，開腹后觀察盆腔粘連情況及異位灶生長情況。

1.3.4 盆腔粘連評分

每只大鼠均采用兩種粘連評分方法：①美國生殖醫學會粘連分級(AFS)分級方法[5]：粘連范圍：0分：無，1分：≤25%，2分：≤50%，3分：≤75%，4分：≤100%；粘連類型：0分：無，1分：膜狀、透明、無血管，2分：不透明或半透明，無血管，3分：不透明，有毛細血管，4分：不透明，有更大的血管；粘連韌性：0分：無，1分：自動分離，2分：需要牽拉才能分離，3分：需要銳性分離；分別從粘連范圍、粘連類型及粘連強度三個方面進行評價，總粘連評分為三者總和。②Haber粘連評分方法[4]：0分：無粘連，無粘連帶；1～2分：輕微粘連，有少許粘連帶，幾乎難以辨認；3～4分：輕中度粘連，移植物周圍可見一些粘連帶，不需要分解；5分：中度粘連，移植物周圍有一些粘連帶，相對容易分解；6～7分：中重度粘連，粘連帶較多，大部分圍繞移植物，在腸管間也可見粘連帶，難以分解；8～9分：重度粘連，腸管間有很多粘連帶，粘連分解困難；10分：嚴重粘連，大量的粘連帶使腸管、腸系膜、腹膜嚴重粘連，在不損傷臟器的情況下無法分解粘連。以上兩種粘連評分方法均有相同的兩位實驗人員獨立進行，每種評分方法均取兩位實驗人員所評分數的平均值作為最終粘連評分。

1.3.5 粘連組織tPA活性檢測

造模術后第5天、第7天、14天、第21天、第28天組均采取粘連處腹膜組織，假手術組及空白組采取正常腹膜組織，進行組織勻漿、離心、蛋白定量, ELISA方法檢測tPA含量。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 肉眼觀察

造模術后第1天：異位灶腫脹，緊貼腸系膜，未見有透亮異位囊泡生成，異位灶周圍腸管相互接觸，稍松動即可分離，松動過程中可見有極薄的透明彈性組織斷裂，分離過程中無出血。(圖1-A)

造模術后第3天：可見直徑3 mm左右大小的異位灶，內含透亮液體，異位灶周圍及腸管間有輕度粘連，稍提拉即可分離，分離過程中可見有較薄的透明組織斷裂，分離過程中無出血。(圖1-B)

造模術后第5天：囊泡直徑增大至4～8 mm左右，內含清亮液體，表面覆蓋有新生血管；盆腔廣泛粘連，多見于異位灶附近腸管與腸管、腸管與腸系膜、異位灶與側盆壁或遠部臟器粘連，粘連部位脂肪組織輕度增生，呈半透明活不透明狀，粘連韌性增強，有小的新生血管生成，易鈍性分離，分離后可見有少量出血，可壓迫止血。(圖1-C)

造模術后第7天：病灶處可見移植物體積增大至5～10 mm左右，呈透明囊泡狀，內含清亮液體，表面覆蓋有新生血管及脂肪組織；盆腔廣泛粘連，粘連部位脂肪組織增生增厚，不透明，有小的新生血管生成，鈍性分離后，分離面廣泛滲血，壓迫止血時間長，易傷及正常組織。(圖1-D)

造模術后第14天：移植物體積增大，呈透明囊泡狀，內有液體積聚，表面覆蓋有豐富的新生血管及脂肪組織；盆腔粘連致密，脂肪組織進一步增生增厚，鈍性分離易撕破腸管，造成大鼠死亡。(圖1-E)

造模術后第21天、28天：移植物體積縮小，呈半透明囊泡狀，內有稍渾濁液體積聚，常包埋在粘連組織內；盆腔廣泛粘連，更加致密，粘連部位新生血管豐富，需小心銳性分離，分離面出血量多，壓迫止血困難，常傷及周圍正常組織，造成大鼠死亡。(圖1-F、G)

假手術后28天：縫合線周圍基本無粘連，脂肪組織稍增厚，正常解剖結構未破壞，無需分離。

2.2 美國生殖醫學會粘連分級(AFS)評分

結果顯示，造模術后1～5 d內各組大鼠盆腔粘連范圍、粘連類型、粘連韌性評分均不斷提高，各組間評分比較，差異有顯著性(P< 0.05)；造模術后5～7 d粘連范圍基本固定，約75%的病灶周圍均形成粘連，新生毛細血管已形成，粘連類型基本固定，粘連韌性增強變慢，造模術后第5天與第7天組在粘連范圍、粘連類型及粘連韌評分方面差異無顯著性(P> 0.05)。造模術后第14天、21天、28天組在粘連范圍、粘連類型及粘連韌性評分方面差異無顯著性(P> 0.05)。(見表1)

注：A：M1組；B：M2組；C：M3組；D：M4組；E：M5組；F：M6組；G：M7組；H：S組；I：B組。圖1 造模術后不同時間大鼠盆腔粘連情況比較Note.A: M1 group. B: M2 group. C: M3 group. D: M4 group. E: M5 group. F: M6 group. G: M7 group. H: S group. I: B group.Fig.1 Pelvic adhesions of the model rats at different stages表1 造模術后不同時期EMs大鼠盆腔粘連AFS評分比較Tab.1 Comparison of AFS scores of pelvic adhesions in the EM rats at different stages

分組Groups粘連范圍Adhesionrange粘連類型Adhesiontype粘連韌性AdhesiontoughnessM1組M1group0(0～1)0(0～1)0(0～1) 013±035? 012±035?# 012±035?#M2組M2group1(0～1)1(0～1)1(0～1) 075±046? 075±046?# 075±046?#M3組M3group35(1～4) 15(1～3) 2(1～2)312±112175±088 187±035M4組M4group4(2～4)3(2～3)2(2～3)350±075275±046212±035M5組M5group3(1～4)3(3～4)2(2～3)300±107 325±046? 237±052?M6組M6group3(1～4)3(2～4)25(2～3) 300±107 300±053? 250±053?M7組M7group3(2～4)3(3～4)3(2～3)312±083 338±052?# 262±052?#

注：A(B～C)：A表示AFS評分中最小值B與最大值C之間的中位數；與造模術后第5天相比，*P<0.05；與造模術后第7天相比，#P< 0.05。

Note.A represents the median of the minimum B and the maximum C in AFS scores. Compared with the group of five days after modeling,*P< 0.05. Compared with the group of one week after modeling，#P< 0.05.

2.3 Haber粘連評分

結果顯示，造模術后第1～5天內粘連發生率不斷增長，造模術后第5天粘連發生率即可達到峰值100%，粘連評分為6.15±1.28，已達到中重度粘連，頓性分離相對困難，且造模術后5 d粘連組織中新生毛細血管生成，其后將形成不可逆粘連。(見表2、圖2)

表2 造模術后不同時期EMs大鼠盆腔粘連Haber評分比較Tab.2 Comparison of Haber scores of pelvic adhesions in the EM rats at different stages

注：與造模術后第5天相比，*P< 0.05；與造模術后第7天相比，#P< 0.05。

Note.Compared with the group of five days after modeling，*P< 0.05. Compared with the group of one week after modeling，#P< 0.05.

注：與造模術后第5天相比，* P< 0.05；與造模術后第7天相比，#P< 0.05。圖2 造模術后不同時期EMs大鼠盆腔粘連Haber評分比較Note.Compared with the group of five days after modeling，* P< 0.05. Compared with the group of one week after modeling，#P< 0.05.Fig.2 Comparison of Haber scores of pelvic adhesions in the EMs rats at different stages

2.4 造模術后不同時期病灶周圍組織HE染色

結果顯示，造模術后第1天：纖維脂肪組織表層多量纖維素附著，形成紅染的粘附帶，較多炎細胞和吞噬細胞浸潤，血管擴張充血不明顯，線頭和內膜周圍多量炎細胞浸潤，伴有纖維組織增生(圖3-A)。

造模術后第3天：纖維脂肪組織表層可見纖維蛋白滲出，部分表面襯覆紅染粘附帶，呈纖維修復性改變，表面可見間皮細胞增生，細胞呈立方或低柱狀，伴有大量炎細胞浸潤(圖3-B)。

造模術后第5天：纖維脂肪組織內多量炎細胞浸潤，可見大量新生小血管，大量炎性肉芽生長，伴有血栓形成(圖3-C)。

造模術后7～28 d：纖維增生，漿膜面纖維組織增生主要以膠原纖維及平滑肌樣細胞為主，粘連逐漸致密。可見炎細胞浸潤，新生血管逐漸增多形成血管網(圖3-D)。

假手術后28 d：未見明顯纖維組織增生，偶可見炎性細胞浸潤，未見明顯血管增生(圖3-E)。

正常對照：無纖維組織增生，未見明顯炎性細胞浸潤，無增生血管(圖3-F)。

2.5 tPA含量檢測

與正常組或假手術比較，各個時期模型組tPA含量均大幅度降低，差異有顯著性(P< 0.01)。造模術后5 d tPA含量低水平表達維持到造模術后21 d，各組間差異無顯著性(P> 0.05)，造模術后28 d tPA含量有回升趨勢，與模組型比較，差異有顯著性(P< 0.01)，但仍顯著低于空白對照組及假手術組，差異有顯著性(P< 0.01)。(見表3、圖4)。

表3 造模術后各組大鼠盆腔tPA含量比較Tab.3 Comparison of the relative expression of tPA in EMs rat peritoneum at different stages

注：與假手術、空白組相比，*P< 0.01；不同時期模型組與造模術后28 d組相比較，#P< 0.01。

Note.Compared with the sham operation group and blank group,*P< 0.01. Models of different periods compared with the group at 28 days after modeling,#P< 0.01.

3 討論

3.1 動物的選擇

相關研究指出，靈長類動物月經周期與人類接近，是建立EMs模型的最佳動物，但因動物稀有、價格昂貴，且自發性EMs的比例低(4.8%)[6]，這很大程度上限制了其在實際科研中的應用。裸鼠是一種免疫缺陷型小鼠，是建立內異癥模型的理想動物，但因免疫缺陷，它在體現自身免疫學改變方面存在不足[7]。小鼠體積較小，臟器柔弱，開腹及分離粘操作困難，且更易傷及臟器造成死亡。大鼠作為實驗動物，具有性成熟早、動情周期短、個體較大、生命力強、實驗重復性好、價格適宜等優點，是復制EMs盆腔粘連模型的最佳選擇。

3.2 盆腔粘連的時間選擇

在異位灶的刺激下，兩塊接觸的腹膜被覆纖維蛋白膠原而形成粘連條帶，隨著時間的推移，粘連范圍逐漸擴大，粘連組織逐漸增厚，韌性不斷增強，直至在不損傷正常臟器的情況下無法分離。本實驗研究發現，造模術后粘連程度不斷增強，術后5～7 d后粘連范圍基本固定，14～28 d粘連類型及致密程度處于平穩期，這與Uguralp相關研究中“粘連形成于術后5～7 d”相吻合[8]。

3.3 盆腔粘連的評價

EMs盆腔粘連的發病機制尚不明確。郎景和團隊在EM發病機制中提出“在位內膜決定論”，認為EM相關盆腔粘連是腹膜對逆流入腹腔經血刺激的一種保護性機制的過度反應[9]。異物、組織缺氧、感染、機械損傷等均可導致腹膜的損害，引起一系列多系統、多細胞及多因子參與復雜的網絡反應，其中，纖維蛋白的沉淀和降解是腹膜粘連中重要的因素[10]。纖溶系統的作用是降解損傷腹膜修復過程中所形成的纖維，其中血管內皮細胞、腹膜間皮細胞、巨噬細胞等產生的tPA將纖溶酶原轉變成纖溶酶，后者主要的功能就是降解纖維素。漿膜腔tPA主要來源于腹膜間皮細胞，其纖溶活性決定了漿膜腔局部纖維蛋白的沉積和清除[8]。若tPA含量降低，纖溶活性受到抑制，纖維膠原組織無法降解，最終形成粘連[11]，因此tPA在粘連形成過程中起重要的抑制作用。通過本實驗研究發現，造模5 d后，不同時間點模型大鼠粘連組織中tPA含量均顯著降低，造模術后5～21 d粘連組織中tPA活性持續喪失，纖維蛋白酶缺少，沉積的纖維蛋白不能及時溶解而機化，最終成為永久性纖維粘連。

注：A：M1組；B：M2組；C：M3組；D：M4-M7組；E：S組；F：B組。圖3 造模術后不同時期EMs大鼠病灶周圍組織比較(HE×200)Note.A: M1 group. B: M2 group. C: M3 group. D: M4-M7 group. E: S group. F: B group.Fig.3 Peritoneal adhesions of the model rats at different stages. HE staining

本實驗采用自體移植法將子宮內膜移植于腸系膜間建立EMs盆腔粘連模型，從盆腔粘連評分及含量檢測等方面進行比較，發現本實驗造模成功率高達100%，造模后5～21 d纖溶活性一直處在抑制狀態；造模術后5 d模型作為成熟模型，造模術后5～7 d是預防粘連的關鍵時期；提高tPA表達水平可作為防治EMs盆腔粘連的方法之一。

注：與假手術、空白組相比，* P< 0.01；不同時期模型組與造模術后28 d組相比較，#P< 0.01。圖4 造模術后各組大鼠盆腔tPA含量比較Note.Compared with the sham operation group and blank group,* P< 0.01. Model groups of different periods compared with the group at four weeks after modeling,#P< 0.01.Fig.4 Comparison of the relative expression of tPA in EM rat peritoneum at different stages

[1] 李孟慧, 冷金花, 李成龍, 等. GnRH-α對EMs腹膜纖溶相關因子tPA/PAI表達影響的研究[J]. 現代婦產科進展, 2012, 21:20-23.

[2] 陳萍. 子宮內膜異位周圍組織粘連程度與患者的臨床特點、手術情況及術后復發的相關性分析 [J]. 中國婦幼保健，2014，29(5): 253-254.

[3] 劉媛媛，趙任峰. EMs盆腔粘連和疼痛的相關性研究 [J]. 廣西醫學，2013，35(5): 588-590.

[4] Haber E, Danenberg HD, Koroukhov N, et al. Peritoneal macrophage depletion by liposomal bisphosphonate attenuates endometriosis in the rat model [J]. Hum Reprod，2009，24(2): 398-407.

[5] The Surgical Membrane Study Group. Prophylaxis of pelvic sidewall adhesions with Gore-Tex surgical membrane: a multicenter clinical investigation [J]. Fertil Steril, 1992, 57(4): 921-923.

[6] Dehoux JP，Defrere S，Squifflet J. Is the baboon model appropriate for endometriosis studies? [J]. Fertil Steril, 2011, 96(3): 728-733.

[7] 馮雪，黃薇.子宮內膜異位癥動物模型研究進展 [J]. 中國比較醫學雜志，2014, 24(12): 67-70.

[8] Uguralp S, Akin M, Karabulut AB, et al. Reduction of peritoneal adhesions by sustained and local administration of epidermal growth factor [J]. Pediatr Surg Int, 2008, 24(2): 191-197.

[9] 李孟慧. 腹膜間皮細胞及轉化生長因子在EMs粘連中作用研究 [D]. 北京，北京協和醫學院，2012.

[10] Esposito AJ, Heydrick SJ, Cassidy MR, et al. Substance P is an early mediator of peritoneal fibrinolytic pathway genes and promotes intra-abdominal adhesion formation [J]. J Surg Res, 2013, 181(1): 25-31.

[11] Shimomura M, Hinoi T, Ikeda S, et al. Preservation of peritoneal fibrinolysis owing to decreased transcription of plasminogen activator inhibitor-1 in peritoneal mesothelial cells suppresses postoperative adhesion formation in laparoscopic surgery [J]. Surgery, 2013, 153(3): 344-356.

Establishmentandevaluationofaratmodelofendometriosiswithpelvicadhesions

LI Tian-tian1,2， SUN Wei-wei1， ZHAO Rui-hua1*

(1.Guang’anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100053, China； 2.The Beijing Muslem People’ s Hospital, Beijing 100054)

ObjectiveTo establish and evaluate a rat model of endometriosis with pelvic adhesions.MethodsTo establish a rat model of endometriosis and pelvic adhesions by autologous transplantation of endometrial tissue to the mesenterium. After modeled, eight rats were randomly selected for examination at 1, 3, 5, 7, 14, 21 and 28 days after operation. The American Society for Reproductive Medicine Classification of Endometriosis and Haber Adhesion Score were used to evaluate the pelvic adhesions. At the same time, the lesions and surrounding peritoneal adhesions were taken for pathological examination using HE staining. The tissue-type plasminogen activator (tPA) content was detected at 5, 7, 14, 21 and 28 days after operation.ResultsThe two adhesion scoring methods showed that typical pelvic adhesions were formed 5 days after modeling. Compared with the blank control group and the sham operation group, the tPA content in the pelvic adhesions of the model group was significantly decreased after 5 days (P< 0.01), and increased at 28 days after model establishment, but still significantly lower than that of the blank control group and sham operation group (P< 0.01).ConclusionsThe autologous transplantation method is successfully used to establish a rat model of pelvic adhesions of endometriosis in the mesenterium. The model is matured at 5 days after surgery. The tPA is correlated with the formation of pelvic adhesions of endometriosis.

Endomeitriosis; Pelvic adhesions; Rat; Tissue-type plasminogen activator, tPA

國家自然科學基金資助項目(81373678)。

李田田(1989-)，女，住院醫師，碩士研究生，研究方向：中醫婦科。E-mail： 836859326@qq.com

趙瑞華(1959-)，女，主任醫師，博士，研究方向：中醫婦科。E-mail： Rhz801@sohu.com

A

1671-7856(2017) 12-0008-08

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.12.002