超抗原葡萄球菌腸毒素B誘導IgA 腎病小鼠模型的建立

史麗強，萬 強，吳燕升，劉偉偉，高建東

(上海中醫藥大學附屬曙光醫院腎病科，上海中醫藥大學中醫腎病研究所，肝腎疾病病證教育部重點實驗室， 上海市中醫臨床重點實驗室，上海 201203)

超抗原葡萄球菌腸毒素B誘導IgA 腎病小鼠模型的建立

史麗強，萬 強，吳燕升，劉偉偉，高建東

(上海中醫藥大學附屬曙光醫院腎病科，上海中醫藥大學中醫腎病研究所，肝腎疾病病證教育部重點實驗室， 上海市中醫臨床重點實驗室，上海 201203)

研究報告

目的建立IgA腎病小鼠模型，并觀察模型的生化及病理指標特點。方法12只BALB/c小鼠隨機分為正常組(6只)和模型組(6只)，模型組單次尾靜脈注射葡萄球菌腸毒素B(SEB) 0.8 mg/kg，第二周開始，連續注射三周，第四周結束后檢測小鼠24 h尿蛋白定量，尿微量白蛋白，腎功能BUN、Scr、UA；蛋白指標TP、ALB；肝功能ALT、AST、ALP；血脂TC、TG、LDL的情況，腎臟免疫熒光IgA的沉積，腎臟病理HE、PAS、PASM、Masson染色以及透射電鏡的觀察腎臟超微結構，以及肝臟與小腸HE染色、免疫熒光IgA的沉積變化。結果與正常組比較，模型組小鼠24 h尿蛋白定量與尿微量白蛋白均升高(P< 0.01)；模型組小鼠腎功能指標CREA，UA均高于正常組(P< 0.05)，BUN差異無顯著性；模型組小鼠蛋白指標TP、ALB差異無顯著性；模型組小鼠肝功能指標AST水平高于正常組(P< 0.05)，ALT、ALP差異無顯著性；模型組小鼠血脂TG水平低于正常組(P< 0.05)，LDL水平高于正常組(P< 0.01)，TC差異無顯著性。腎臟免疫熒光檢查可見模型組小鼠腎小球系膜區呈顆粒狀、團塊狀的IgA沉積；模型組小鼠腎臟病理輕中度損傷，系膜區免疫復合物增多；模型組小鼠肝臟HE染色可見少量炎性細胞浸潤伴有部分肝細胞壞死，小腸絨毛缺損，腸絨毛變短變細、間距明顯增寬，有部分分上皮脫落，中央央乳糜管擴張顯著，淋巴細胞增多，明顯可見炎性細胞浸潤。結論使用超抗原SEB尾靜脈注射小鼠可以成功復制IgA腎病動物模型。

IgA腎病；動物模型；SEB；小鼠

IgA腎病 (IgA nephropathy, IgAN) 是目前全球最常見的原發性腎小球疾病之一。是導致終末期腎功能衰竭的一個很重要的原因。在國內，IgA腎病占原發性腎小球疾病的35%～55%，IgA腎病多呈慢性進行性發展，進入終末期腎病的患者，每10年大約有5%～25%[1]。因此采用合適的動物模型來研究其發病機制與疾病的特點是很有必要的。本文主要介紹復制葡萄球菌腸毒素B誘導的IgA腎病動物小鼠模型，該模型最早為劉志紅[2]院士在1989年報道，主要采用大鼠進行制作。目前尚未看到有報道采用此方法在小鼠身上復制的報道，因此本研究在BALB/c小鼠上復制此種動物模型。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級別BALB/c雄性小鼠12只，體重16～18 g，6周齡，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供[SCXK(滬)：2013-0016],飼養在上海中醫藥大學科技實驗中心/醫學實驗動物中心[SYXK(滬)：2014-0008]，自由飲食進水，動物倫理登記編號：SZY201607002。

1.2 主要試劑與儀器

葡萄球菌腸毒素B (staphylococcal enterotoxin B，SEB)(北京軍事醫學科學院)；Goat anti-Mouse IgA Secondary Antibody [FITC](Novus Biologicals，貨號：NB7503)；2%戊巴比妥鈉(德國Merck，批號：20140820)；一次性使用無菌注射針(上海康得萊集團，0.3×13RWLB)；小鼠固定器(北京冀諾泰科技發展有限公司，貨號：JNT-CXQ)；切片石蠟(國藥集團化學試劑有限公司，貨號：69019361)；二甲苯(江蘇彤晟化學試劑有限公司，貨號：1330-20-7)；無水乙醇(江蘇彤晟化學試劑有限公司，貨號：64-17-5)；蘇木素-伊紅染液(賽維爾生物科技有限公司貨號：G1005)；PAS染色試劑盒(賽維爾生物科技有限公司貨號：G1008)；六銨銀染液試劑盒(賽維爾生物科技有限公司貨號：G1059)；Masson染色試劑盒(賽維爾生物科技有限公司貨號：G1006)；粘附載玻片(江蘇世泰實驗器材有限公司，貨號：188105)；甘油明膠封片劑(賽維爾生物科技有限公司貨號：G1402)；甲醛溶液(國藥集團化學試劑有限公司，貨號：10010018)。

自動組織脫水機(浙江省金華市科迪儀器設備有限公司，KD-TS3A)；生物組織冷凍包埋機(浙江省金華市科迪儀器設備有限公司，KD-BM)；攤片機(浙江省金華市科迪儀器設備有限公司，KD-P)；烘片機(浙江省金華市科迪儀器設備有限公司，KD-H)；低溫冷凍切片機(德國Leica，CM3050S)；熒光光學顯微鏡(尼康，Nikon Eclips E80i)；全自動生化分析儀美國(Beckman Coulter, Inc, AV5800)。

1.3 實驗方法

1.3.1 造模方法

動物適應性喂養一周后按體重分為兩組，A為正常組，B為模型組。模型組第二周開始注射SEB，SEB使用無菌PBS稀釋，劑量為0.8 mg/kg，每只小鼠尾靜脈注射0.2 mL，每周一次，連續三周；第四周結束后留取尿液；小鼠處死前禁食12 h， 2%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉小鼠后摘眼球處死取血清做腎功能、、蛋白、血脂的檢測；取小鼠腎臟、肝臟及小腸做免疫熒光和病理染色檢測。

1.3.2 腎臟透射電鏡標本的留取

取材全程在冰塊上低溫進行，左腎下部分用鋒利剪刀剪下一小塊組織，迅速放到滴有預冷固定液的硬紙片或蠟片上，在固定液中用刀片棄去剪過的切面，把組織切成薄片，再改切成體積約1×1×1 mm 5小塊(用牙簽將5～6小塊組織轉移至含有2～3 mL預冷固定液的干凈青霉素小瓶內，瓶上應貼上標簽，用鉛筆書寫)，實驗結束后標本立即送上海中醫藥大學電鏡室檢測。

1.3.3 小鼠生化指標的檢測

小鼠血尿指標的檢測由上海中醫藥大學附屬曙光醫院檢驗科使用全自動生化儀檢測。

1.3.4 石蠟切片的制作

取材：新鮮組織放置于10倍體積的4%多聚甲醛內一天左右。在通風櫥內將組織從固定液取出用刀片將小鼠腎臟組織修平整，將修好的組織放置于包埋框內，用鉛筆做好標記。

脫水：將包埋框整齊的放進自動脫水機的吊籃里，核對程序的順序與時間，點擊編好的程序，梯度酒精進行脫水。(75%酒精4 h，85%酒精2 h，90%酒精2 h，95%酒精1 h，無水乙醇I 30 min，無水乙醇II 30 min，醇苯5～10 min，二甲苯I 5～10 min，二甲苯II 5～10 min，蠟I 1 h，蠟II 1 h，蠟III 1 h。)

包埋：將脫好水的組織放置于于生物組織包埋機內進行包埋。

切片：將修整好的蠟塊置于輪轉切片機上切片，切片厚度為3 μm。 用毛筆刷將切片漂浮于攤片機37℃ 溫水中將組織展平，用防脫載玻片將組織撈起，并平放于KD-H烤片機上烤片2 h左右。待切片蠟烤化后，常溫保存備用。

1.3.5 病理染色

腎臟病理做HE、PAS、PASM、Masson染色，肝臟與小腸HE染色步驟均按照賽維爾生物科技有限公司染色試劑說明書制作。

1.3.6 冰凍切片免疫熒光直接法染色

冰凍切片固定：冰凍切片從冰箱拿出來復溫半個小時，使用預冷的丙酮固定10 min，用pH 7.4的PBS輕柔的洗滌3次，每次5 min。

加熒光標記的一抗：在切片上滴加稀釋好的熒光一抗，切片平放于加水的濕盒內4℃避光孵育過夜。

封片：玻片使用pH 7.4的PBS輕柔的洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干然后迅速用預熱好的明膠抗熒光淬滅封片劑避光封片。

鏡檢拍照：切片在黑暗房間內使用尼康倒置熒光顯微鏡觀察并拍取合適像素的照片放置于專門的文件夾內做好標記。(FITC綠光激發波長465～495 nm，發射波長515～555 nm)

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 一般情況

實驗結束時，模型組小鼠造模后小鼠精神萎靡不振，倦臥聚集于一起，毛色晦暗，飲食減少；正常小鼠活潑易動，毛色純白有光澤，飲食如常。

2.2 生化指標

與正常組比較，模型組小鼠24小時蛋白定量升高(P< 0.01)，尿白蛋白高于正常組(P< 0.01)(見表1)；與正常組比較，模型組小鼠Scr，UA均高于正常組(P< 0.05)，BUN無統計學差異(見表2)；與正常組比較，模型組小鼠TP，ALB差異無顯著性；與正常組比較，模型組小鼠AST水平高于正常組(P< 0.05)，ALT、ALP差異無顯著性；與正常組比較，模型組小鼠TG低于正常組(P< 0.05)，與正常組比較，模型組小鼠LDL高于正常組(P< 0.01)，與正常組比較TC差異無顯著性。

2.3 小鼠腎臟病理

2.3.1 小鼠腎臟免疫熒光

通過免疫熒光直接法免疫熒光間接法檢測小鼠腎組織冰凍切片IgA在腎小球的沉積，免疫熒光間接法檢測小鼠腎組織石蠟切片IgA在腎小球的沉積，兩種染色方法均看到模型組小鼠腎小球系膜區呈顆粒狀、團塊狀IgA沉積，正常組未見IgA免疫復合物沉積。(見圖1)

表1 小鼠尿蛋白的比較Tab.1 Comparison of the mouse urine proteins

注：與正常組比較，#P< 0.01。

Note.Compared with the control group,#P< 0.01.

表2 小鼠腎功能的比較Tab.2 Comparison of the mouse renal function

注：與正常組比較，*P< 0.05。

Note.Compared with the control group,*P< 0.05.

表3 小鼠血清蛋白的比較Tab.3 Comparison of the mouse serum proteins

表4 小鼠肝功能的比較Tab.4 Comparison of the mouse liver functions

注：與正常組比較，*P< 0.05。

Note.Compared with the control group,*P< 0.05.

表5 小鼠血脂的比較Tab.5 Comparison of the mouse blood lipid

注：與正常組比較，*P< 0.05，#P< 0.01。

Note.Compared with the control group,*P< 0.05，#P< 0.01.

圖1 小鼠腎臟免疫熒光Fig.1 Immunofluorescence in the mouse kidney tissues

2.3.2 小鼠腎臟病理染色

正常對照組小鼠腎臟形態結構未見異常，模型組小鼠腎組織可以看到腎小球毛細血管襻的擴張以及毛細血管腔有部分閉鎖，系膜區系膜細胞及基質明顯增生，Masson染色可見系膜區有嗜紅物沉積說明系膜區免疫復合物增多，部分小管可以看到擴張，部分伴間質小管病變及小血管病變。(見圖2)

圖2 小鼠腎臟病理染色Fig.2 Pathological changes of the mouse kidney tissues with different staining.

2.3.3 腎臟超微結構

正常組腎臟結構未見異常，模型組可見到系膜區系膜細胞與基質輕度增生，系膜少量細顆粒狀電子致密物的沉積，足突有間斷融合，箭頭所指為凋亡的系膜細胞。(見圖3)

注：右圖黑色箭頭示為凋亡的系膜細胞。圖3 腎臟透射電鏡結果(×6000)Note.The black arrow on the right picture indicates an apoptotic mesangial cell.Fig.3 Ultrastructural changes of the kidney tissues

2.4 小鼠肝臟與小腸的病理及免疫熒光

光鏡下正常對照組小鼠肝臟結構完整，肝內內細胞形態正常，未看到炎性細胞浸潤；模型組小鼠肝臟HE染色可見少量炎性細胞浸潤甚至肝細胞壞死，見輕度肝細胞脂肪變性，管區可見少量纖維增生，光鏡下正常對照組大鼠小腸腸絨毛形態正常、未見缺損，上皮細胞排列整齊，見明顯炎性細胞浸潤，模型組小鼠小腸絨毛不完整，腸絨毛變短變細、間距明顯增寬，有部分分上皮脫落，中央央乳糜管擴張顯著，淋巴細胞增多，明顯可見炎性細胞浸潤。正常組肝臟與小腸免疫熒光可見微量IgA沉積，模型組小鼠肝臟免疫熒光可見大量顆粒狀IgA沉積，主要沉積在匯管及血竇區，模型組小鼠小腸IgA沉積較正常組明顯。(見圖4)

圖4 肝臟與小腸病理及免疫熒光染色Fig.4 Pathological changes of the mouse liver and small intestine tissues. immunofluorescence staining.

3 討論

目前診斷IgA腎病，只能通過腎活檢來確診[3]，腎臟免疫熒光診斷為金標準，IgAN的特征是以IgA為主的免疫球蛋白分子在腎小球系膜區沉積。我們采用冰凍與石蠟切片兩種方法做免疫熒光證實使用SEB誘導的造模可以在小鼠上成功復制IgA腎病模型，這種模型的特點是成功率高，周期短，模型較為穩定，不失為一種較為理想的IgA腎病模型，其發病機制可能是由于超抗原導致高水平細胞因子和IgG和IgA的多克隆活化引起[4]，超級抗原(SAgs)是一類導致非特異性免疫的蛋白質；1989年, Choi等[5]首次提出超抗原的概念,并且提出絲裂原是通過大量激活具有相同的T細胞受體復合物(TCR)的β鏈V區結構域的T淋巴細胞來發揮作用。1989年，瑞典科學家White等[6]指出，SE與MHCⅡ類分子結合后，并不能激活所有的T細胞，只有那些受體上有Vβ成分的T細胞才能被激活，SE對T細胞的激活能力是普通抗原的2000～50 000倍，細菌、病毒、寄生蟲等均可能產生這類特殊的蛋白質。

有研究發現超抗原性對內皮細胞的直接毒性作用，將會導致于內皮細胞愈合延遲[7]。SEB可以增加炎癥細胞因子的產生，導致細胞和組織炎癥細胞浸潤、壞死，而腎臟本身作為排毒器官器官，所以毒素會導致腎功能損傷，可能也是導致IgA在腎臟沉積的原因之一。但這種損害對小鼠來說并不是致命性的，Krakauer[8]做了暴露于不同劑量葡萄球菌腸毒素B(SEB)或脂多糖(LPS)及其組合的小鼠的細胞因子反應和致死率發現，使用高劑量的SEB(100微克/小鼠)，所有小鼠都存活。SEB單獨誘導中等水平的IL-2和MCP-1；LPS(80微克/小鼠)造成48%的致死率并誘導高水平的IL-6和MCP-1。我們實驗做的結果于文獻報道一致，實驗結束后小鼠未發現有死亡。

而SEB作為超級抗原，在尾靜脈注射后會損傷小腸毛細血管內皮，破環腸道的屏障，我們在小腸的病理HE染色中也看到模型組小鼠腸絨毛形態的異常，腸絨毛變短變細、間距明顯增寬，有部分分上皮脫落，中央央乳糜管擴張顯著，淋巴細胞增多，明顯可見炎性細胞浸潤。在實驗中我們發現肝臟小泡性(脂肪變性)形式主要見于小葉中央區，小泡性脂肪變性由線粒體功能受損導致，線粒體功能障礙通常由一種遺傳性代謝錯誤或一種藥物或毒素的作用所致，在這種情況下，脂肪酸β氧化減少導致三酰甘油(triacylglycerol)和游離脂肪酸的蓄積。肝臟內的所產生的抗體主要以IgA為主，肝內的樹突狀細胞表面MHC-Ⅱ類分子表達比枯否細胞的表達更強。其主要分布在小鼠與肝臟的門靜脈周圍，肝小葉實質內，近年來有研究表明肝臟實質細胞表達的具有活性的細胞表面分子，MHC-Ⅱ類HLA-DR 抗原、CD44抗原、CDW60抗原等會啟動或調節多種免疫反應。肝實質細胞的免疫調節是在T細胞釋放的細胞因子控制下完成的，因此當超抗原SEB進入體內后會激活肝臟表達MHC-Ⅱ類的細胞釋放前炎癥細胞因子如TNF-a、IL-1、IFN-γ等引起肝臟的損傷，有研究證實在門靜脈區以輔助性T細胞為主，這也可以解釋模型組肝臟病變主要集中在門靜脈周圍。

采用SEB尾靜脈注射的造模方法成模時間短，成本低，重復性較好，不僅如此，它在發病機制上與人類IgA腎病粘膜免疫發病的途徑類似，能夠更好的對于IgA腎病的發病機制進行研究，不失為一種方便廉價的研究IgA腎病的動物模型。

[1] D’Amico G. Natural history of idiopathic IgA nephropathy: role of clinical and histological prognostic factors [J].Am J Kidney Dis, 2000, 36(2): 227-237.

[2] 劉志紅, 黎磊石. 葡萄球菌腸毒素誘發的 IgA 腎病模型 [J]. 中華腎臟病雜志, 1989, 5(1): 6-10.

[3] Gharavi AG, Yan Y, Scolari F, et al. Nephropathy, the most common cause of glomerulonephritis, is linked to 6q22-23 [J]. Nat Genet, 2000, 26(3): 354-357.

[4] Koyama A, Kobayashi M, Yamaguchi N, et al. Glomerulonephritis associated with MRSA infection: a possible role of bacterial superantigen [J]. Kidney Int, 1995, 47(1): 207-216.

[5] Choi YW, Kotzin B, Herron L, et al. Interaction of Staphylococcus aureus toxin “superantigens” with human T cells [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1989, 86(22): 8941-8945.

[6] White J, Herman A, Pullen AM, et al. The Vβ-specific superantigen staphylococcal enterotoxin B: stimulation of mature T cells and clonal deletion in neonatal mice [J]. Cell, 1989, 56(1): 27-35.

[7] Salgado-Pabón W, Breshears L, Spaulding AR, et al. Superantigens are critical for Staphylococcus aureus infective endocarditis, sepsis, and acute kidney injury [J]. MBio, 2013, 4(4): e00494-13.

[8] Krakauer T, Buckley MJ, Fisher D. Proinflammatory mediators of toxic shock and their correlation to lethality [J]. Mediators Inflamm, 2010, 2010: 517594.

EstablishmentofamousemodelofIgAnephropathyinducedbysuperantigenstaphylococcalenterotoxinB

SHI Li-qiang， WAN Qiang， WU Yan-sheng， LIU Wei-wei， GAO Jian-dong*

(Department of Nephrology, Shuguang Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine; TCM Institute of Kidney Diseases, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Liver and Kidney Diseases, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine; Ministry of Education, Shanghai Key Laboratory of Traditional Chinese Clinical Medicine， Shanghai 201203, China)

ObjectiveTo establish a mouse model of IgA nephropathy and to observe its biochemical and pathological characteristics.MethodsTwelve BALB/c mice were randomly divided into the normal group and model group, with 6 mice in each group. Mice in the model group

an intravenous injection of 0.8 mg/kg superantigen staphylococcal enterotoxin B (SEB) into the tail vein once a week for three weeks. At the end of the 4th week, the mice were sacrificed, and the 24 h-urinary protein, urinary microalbumin, the renal function indicators BUN, Scr and UA were measured, levels of liver function indicators ALT, AST, ALP, and the blood lipid levels of TC, TG, and LDL were determined, the renal morphological changes were examined by pathology using HE, PAS, PASM and Masson staining, and by electron microscopy, the IgA deposition in the renal tissue was observed with immunofluorescence, and the liver and small intestine were observed by pathology using HE staining.ResultsCompared with the normal group, the mice of model group showed increased 24-hour urinary protein and urinary microalbumin (P<0.01), increased CREA and UA (P<0.05), but not significantly changed BUN, TP and ALB. The liver function indicator AST was significantly increased (P<0.05), but ALT and ALP were not significantly changed. The blood lipid TG was significantly decreased (P<0.05) and LDL increased (P<0.01), while the TC was not significantly changed. The kidney tissues had moderate histological changes, and immunofluorescence observation showed granular or massive IgA deposition in the renal glomerular mesangium. The liver tissue had some inflammatory cell infiltration and hepatocyte necrosis. The small intestine showed slender and shortened villi with widened inter-villous space and sloughed off epithelial cells, dilated central lacteal, and lymphocyte infiltration.ConclusionsA mouse model of IgA nephropathy can be successfully established by tail vein injection of superantigen staphylococcal entrotoxin B.

IgA nephropathy; Animal model; Staphylococcal enterotoxin B, SEB; Mice

上海市中醫藥事業發展三年行動計劃項目(ZYSNXD-CC-YJXYY)；上海市中醫藥事業發展三年行動計劃項目(ZYSNXD-CC-MZY044)。

史麗強(1990-)男，碩士研究生，研究方向：腎臟疾病。E-mail: shiliqiang16@live.com

高建東(1967-)男，醫學博士，主任醫師，研究方向：中醫藥防治慢性腎臟病。E-mail: gaojiandong@hotmail.com

R-33

A

1671-7856(2017) 12-0102-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.12.018

2017-05-19