羅格列酮對HT29、HCT116結腸癌細胞凋亡影響 及機制探究

張 琪，楊光華，葛志鵬，丁家杉，黃志強，鄭 陽，張國志，王長友*

(1.華北理工大學附屬醫院，河北 唐山 063000； 2.華北理工大學臨床醫學院，河北 唐山 063000)

羅格列酮對HT29、HCT116結腸癌細胞凋亡影響 及機制探究

張 琪1，楊光華1，葛志鵬1，丁家杉2，黃志強1，鄭 陽1，張國志1，王長友1*

(1.華北理工大學附屬醫院，河北 唐山 063000； 2.華北理工大學臨床醫學院，河北 唐山 063000)

研究報告

目的探討羅格列酮對結腸癌HT29、HCT116細胞增殖、凋亡情況的影響以及AKT/GSK3β信號通路的變化。方法HT29、HCT116結腸癌細胞經不同濃度羅格列酮(20.0 μmol/L，40.0 μmol/L，80.0 μmol/L)處理后，采用MTT法檢測細胞增殖能力的變化，annexin-V FITC/PI試劑盒檢測細胞凋亡情況，Western blot檢測Bcl2、Bax以及Akt、GSK3β表達情況。結果與空白對照組相比，不同濃度的羅格列酮對HT29、HCT116結腸癌細胞的增殖均有影響(P< 0.01)，并且影響呈劑量依賴關系；不同濃度的羅格列酮對HT29、HCT116細胞均有誘導凋亡的作用(P< 0.01)，且誘導HT29、HCT116細胞凋亡呈劑量依賴性；羅格列酮處理細胞48 h后，與空白對照組相比Bcl2/Bax表達水平、P-GSK3β、P-Akt表達水平明顯下降(P< 0.01)，Akt、GSK3β表達水平較空白對照組差異無顯著性(P> 0.05)。結論羅格列酮可能通過抑制Akt/GSK3β通路的激活，改變Bcl2/Bax 情況，發揮抑制細胞增殖、誘導凋亡的作用。

羅格列酮；結腸癌；凋亡；Bcl2；Bax；Akt；GSK3β

由于人口結構和飲食習慣的改變，結腸癌在我國的發病率呈逐年上升趨勢[1]。在世界范圍內，結腸癌的發病率分別位列女性和男性腫瘤的第二位和第三位[2]，因此對于結腸癌的防治研究尤為重要。噻唑烷二酮類藥物羅格列酮(rosiglitazone, ROZ)是一種PPARγ特異性配體。作為胰島素增敏劑，本身具備較少、較輕的藥物毒副作用，同時已有許多研究證實在肝癌、乳腺癌、結腸癌等多種腫瘤細胞的生物學行為有明顯的抑制作用，但是對于結腸癌細胞的抑制作用研究甚少，具體發揮作用的信號通路尚不可知[3]。因此，我們進行體外研究，采用HT29、HCT116人結腸癌細胞系，予以不同濃度的羅格列酮，探討結腸癌細胞的凋亡情況以及AKT/GSK3β信號通路的變化。

1 材料和方法

1.1 細胞系及試劑儀器

人結腸癌細胞株HT29、HCT116，購買于中國科學院干細胞庫；DMEM培養基 (Gibco公司)；四季青胎牛血清(浙江天杭生物公司)；抗體Bcl-2、Bax、P-Akt、Akt、P-GSK3β、GSK3β、annexin-V FITC/PI染料試劑盒(Sigma公司)；HR標記山羊抗兔IgG二抗、β-actin抗體、MTT試劑盒、DAB顯影液(上海碧云天生物技術研究所)；BCA 蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液、PMSF、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；酶標儀、濕轉系統(上海Bio-Rad公司)；流式細胞儀(FACS Calibur，BD公司)；羅格列酮(上海三維制藥有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養

HT29、HCT116、細胞用含10% FBS的DMEM培養基，37.0℃，5% CO2條件下培養,每2 d傳代1次。

1.2.2 細胞增殖能力檢測

采用MTT法，取對數生長期的細胞，制備成單細胞懸液，按 5×103/孔接種于3個96孔板中，細胞貼壁后以不含FBS的培養基培養12 h同步化細胞。棄去培養基，配置ROZ終濃度為20.0 μmol/L、40.0 μmol/L、80.0 μmol/L的含10% FBS的完全培養基處理各組細胞，空白對照組為不含ROZ的完全培養基。每組設9個復孔，培養24 h、48 h。各孔加入 5 mg/mL MTT 溶液 10 μL，繼續培養箱中反應 4 h，棄培養基，每孔加入DMSO 100 μL，置于培養箱中反應15 min。用酶標儀在波長570 nm處測定各孔吸光度值(OD值)。因OD值與孔內存活細胞數呈正比，故用OD值表示細胞增殖能力。

1.2.3 Anneixin-V/ PI染色檢測羅格列酮對細胞凋亡影響

取對數生長期細胞，制備成單細胞懸液，接種于6孔板中，同步化細胞。按空白對照組，以及不同濃度的ROZ分組，每孔加入2 mL培養基。37℃，5% CO2條件下培養48 h，胰酶消化，1000 r/min離心5 min，棄上清，PBS重懸細胞，1000 r/min離心5 min，棄上清，加入185 μL annexin V-FITC 結合液重懸細胞后，加入 5 μL annexin V-FITC、10 μL PI染色液混勻。室溫避光孵育10 min，1 h內上機進行流式細胞儀檢測分析，以早期凋亡和晚期凋亡細胞的含量合計為凋亡細胞，3次獨立的重復實驗獲得以下數據。

1.2.4 Western blot檢測相關蛋白表達

兩株細胞經濃度為40.0 μm/L ROZ處理48 h后，RIPA裂解液充分裂解細胞，離心收集蛋白。BCA法定量總蛋白，加入等體積2×蛋白上樣緩沖液后100℃變性5 min，-80℃保存備用。進行SDS-PAGE蛋白電泳，再分別進行轉膜(90 V，90 min)，10%脫脂奶封閉，一抗孵育過夜(1∶1000)，二抗(1∶100)37℃ 孵育2 h，熒光顯色。Image J軟件分析灰度值。相關蛋白表達量計算=(所測蛋白灰度值/內參灰度值)×100%。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 不同濃度ROZ對結腸癌細胞增殖的影響

MTT結果顯示，培養24 h、48 h、72 h后不同濃度的ROZ對兩株結腸癌細胞的增殖均有影響，并且影響呈劑量依賴關系。ROZ濃度越高，對細胞增殖影響越大，20.0 μmol/L、40.0 μmol/L、80.0 μmol/L組與空白對照組相比差異有顯著性(P< 0.01)。(見表1)

2.2 不同濃度ROZ對HT29、HCT116結腸癌細胞凋亡促進作用

通過annexin-V/ PI染色檢測細胞凋亡，結果顯示，濃度為20.0 μmol/L、40.0 μmol/L、80.0 μmol/L的ROZ對HT29、HCT116細胞均有誘導凋亡的作用，各組凋亡率均高于空白對照組，差異有顯著性(P< 0.01)。且ROZ誘導HT29、HCT116細胞凋亡呈劑量依賴性，兩兩比較LSD檢驗組間差異有顯著性(P< 0.01)。(見圖1，表2)

表1 各組不同時間OD值檢測Tab.1 OD values of different cells at different time points

注：與空白對照組比，*P< 0.01。

Note.Compared with the control group,*P< 0.01.

圖1 羅格列酮對HT29、HCT116細胞凋亡率的影響Fig.1 Effect of ROZ on the apoptosis rate of HT29 and HCT116 cells表2 羅格列酮對HT29、HCT116細胞凋亡率的影響Tab.2 Effect of ROZ on the apoptosis rate ofHT29 and HCT116 cells

組別Groups凋亡率/%ApoptosisrateHT29HCT116對照組Controlgroup257±036350±036ROZ200μmol/L487±038▲596±052▲ROZ400μmol/L737±112▲954±105▲ROZ800μmol/L1356±101▲1593±055▲

注：與空白對照組比，▲P< 0.01。

Note.Compared with the control group,▲P< 0.01.

2.3 ROZ誘導HT29、HCT116結腸癌凋亡相關蛋白的檢測

Western blot進行相關凋亡蛋白表達量的檢測，結果顯示(圖3)，與空白對照組相比，抗凋亡蛋白Bcl2表達水平降低，促凋亡蛋白Bax表達水平上升，差異有顯著性(P< 0.01)。這表示，ROZ誘導HT29、HCT116結腸癌細胞凋亡可能與Bcl-2/Bax表達水平下降有關系。(見圖2)

2.4 ROZ對HT29、HCT116細胞Akt/GSK3β蛋白信號通路蛋白的調控

細胞經濃度為40.0 μm/L的ROZ處理48 h后，消化收集細胞提取蛋白。在驗證了細胞發生凋亡了之后，我們驗證了Akt及其下游GSK3β的表達情況。結果顯示，各組總Akt，GSK3β的表達含量不變，與對照組相比差異無顯著性(P> 0.05)，但各組p-Akt和p-GSK3β的表達含量下降明顯，與對照組相比差異有顯著性(P< 0.01)。p-Akt減少可以使GSK3β磷酸化下降，導致GSK3β失活減少，從而促進凋亡。這表明在ROZ誘導細胞凋亡的過程中，Akt/GSK3β信號通路可能起到了重要的作用。(見圖3)

圖2 ROZ對HT29、HCT116細胞凋亡蛋白表達的影響Fig.2 Effect of ROZ on apoptosis protein expression in HT29 cells and HCT116 cells detected by Western blot

圖3 ROZ對HT29、HCT116細胞AKT/GSK3β蛋白表達的影響Fig.3 Effect of ROZ on protein expressions of AKT/GSK3β of HT29 cells and HCT116 cells detected by Western blot

3 討論

結腸癌發病原因及機制尚不清楚，目前研究認為，結腸癌的發生是由環境、飲食、生活習慣以及遺傳因素等共同作用的結果[4, 5]。目前對于結腸癌的治療依然是以手術治療為主并結合放化療，但治療效果并不理想，面對著復發轉移、抗藥性同時以及輔助治療時嚴重的副作用等問題[6, 7]。

既往大量研究發現PPARγ在腫瘤組織中表達均有不同程度的上調，PPARγ配體可以抑制腫瘤細胞生長從而達到腫瘤的化學預防和治療的作用[8-11]。Chen等[12]研究證明PPARγ配體抑制HT29細胞生長和誘導其凋亡是通過下調bcl-2的表達來實現的。許多研究證實Bcl-2家族不僅調節細胞凋亡而且能改變化療藥物對腫瘤的敏感性[13, 14]。誘導細胞凋亡是目前大多數抗癌藥物的主要作用位點，這也成為評價抗癌藥物能力的指標[15]。本次實驗通過MTT，流式細胞儀檢測細胞凋亡，Western blot檢測相關凋亡蛋白表達證實了ROZ可以通過凋亡途徑抑制HT29和HCT116細胞，并且呈劑量依賴性。Western blot 結果顯示抗凋亡蛋白Bcl-2表達下調，促凋亡蛋白Bax表達上調，我們推測ROZ促進HT29、HCT116細胞凋亡可能是通過Bcl-2/Bax表達水平下降來實現的。

Akt/GSK3β信號通路是一個重要的抗凋亡、促增殖的信號通路，在多種人類腫瘤中都可檢測到該信號通路的異常[16-18]， GSK3β的磷酸化可以抑制Bax線粒體轉位和Bcl-2的降解，從而抑制凋亡，故干擾Akt/GSK3β的表達可誘導腫瘤細胞凋亡的發生[19-21]。因此本實驗探究了ROZ對Akt/GSK3β信號通路的影響。

本次實驗結果顯示ROZ處理HT29、HCT116細胞48 h后，GSK3β、Akt的活化產物P-GSK3β、P-Akt表達水平明顯降低，因此推測ROZ可能通過抑制Akt/GSK3β通路的激活，破壞Bcl-2/Bax 比例，發揮抑制細胞增殖、誘導凋亡的作用。但Akt/GSK3β可能不是ROZ誘導HT29、HCT116細胞凋亡的唯一通路，其對凋亡的影響及其中具體的作用機制需后續實驗進一步深入研究。

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RosiglitazonepromotesapoptosisincoloncancerHT29andHCT116cellsthroughAKT/GSK3βsignallingpathway

ZHANG Qi1， YANG Guang-hua1， GE Zhi-peng1， DING Jia-shan2， HUANG Zhi-qiang1， ZHEN Yang1， ZHANG Guo-zhi1， WANG Chang-you1*

(1.Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology,Tangshan 063000, China； 2.Clinical Medical School of North China University of Science and Technology, Tangshan 063000)

ObjectiveTo investigate the effect of rosiglitazone on the proliferation and apoptosis of colon cancer cells and the changes in the AKT/GSK3β signaling pathway.MethodsDifferent concentrations of rosiglitazone (20.0 μmol/L, 40.0 μmol/L, 80.0 μmol/L) were used to treat colon cancer HT29 cells and HCT116 cells. Cell proliferation was detected by MTT assay. Annexin V FITC/PI cell death detection kit was used to test the cell apoptosis rate. The expression of apoptotic protein Bcl-2, Bax and Akt, GSK3β were detected by Western blot.ResultsDifferent concentrations of rosiglitazone had different effect on the proliferation of colon cancer cells compared with the blank control group, and showed a dose dependence (P< 0.01). With the increase of rosiglitazone dose, the apoptosis-inducing effect was increased dose-dependently (P< 0.01). When the cells were treated with rosiglitazone for 48 h, the expressions of Bcl-2/Bax, p-GSK3β, and p-Akt were significantly decreased compared with the blank control group (P< 0.01), but the expression level of Akt and GSK3β was not significantly different compared with the blank control group (P> 0.05).ConclusionsRosiglitazone significantly induces apoptosis and inhibits the proliferation of HT29 cells. It may be via inhibiting Akt/GSK3β signaling pathway and change the ratio of Bcl-2/Bax.

Rosiglitazone; Colon cancer; Apoptosis; Bcl-2; Bax; Akt; GSK3β

2017年政府資助省級臨床醫學優秀人才項目;中國煤炭工業協會2017年度科學技術研究指導性計劃項目(MTKJ2017-331)。

張琪(1992-)，男，碩士研究生，研究方向：胃腸道腫瘤。E-mail： izhangqi1004@163.com

王長友(1971-)，男，教授，碩士生，研究方向：胃腸道腫瘤。E-mail： fhbj-2004@163.com

R-33

A

1671-7856(2017) 12-0056-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.12.010