水貂阿留申病毒、腸炎病毒與犬瘟熱病毒多 重PCR檢測方法的建立與應用

馬 芹，王元智，閆文卓，趙麗麗，陳洪巖，陸濤峰

(中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所，黑龍江省實驗動物與比較醫學重點實驗室，哈爾濱 100193)

水貂阿留申病毒、腸炎病毒與犬瘟熱病毒多 重PCR檢測方法的建立與應用

馬 芹，王元智，閆文卓，趙麗麗，陳洪巖，陸濤峰*

(中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所，黑龍江省實驗動物與比較醫學重點實驗室，哈爾濱 100193)

研究報告

目的水貂阿留申病、病毒性腸炎與犬瘟熱并稱影響水貂健康的三大疫病，擬建立一種可同時檢測三種病毒的多重PCR檢測方法。方法針對三種病毒基因保守區分別設計了3對特異性引物，對貂阿留申病毒(ADV)和水貂腸炎病毒(MEV)的DNA模板和犬瘟熱病毒(CDV)的RNA模板進行了多重PCR擴增和擴增條件優化。結果PCR可同時擴增出601 bp(ADV)、205 bp(MEV)和451 bp(CDV)的特異性目的條帶，敏感性試驗表明最低核酸檢出量為ADV 每微升2.67×104拷貝、MEV 每微升3.02×104拷貝和CDV每微升1.72×105拷貝。臨床樣品檢測結果表明多重PCR和單一PCR檢測結果一致。結論建立的多重PCR檢測方法可快速地檢測ADV、MEV和CDV單一或混合感染的臨床樣品。

多重PCR；水貂阿留申病毒；水貂腸炎病毒；犬瘟熱病毒

貂作為重要的經濟動物，不僅僅具有經濟價值[1]，同時貂還是流感病毒、SARS、新城疫病毒、貂圓環病毒、阿留申病毒以及腸炎病毒的宿主，其中雪貂對流感病毒十分易感，感染后表現出與人相似的癥狀，還能產生免疫反應，因此雪貂可作為研究流感病毒最佳的實驗動物模型。貂的實驗動物化養殖必須保證背景清晰，并對其攜帶的病原體進行控制，所以需要建立一系列針對貂攜帶的病原體的檢測方法。水貂阿留申病、病毒性腸炎與犬瘟熱并稱影響貂健康的三大疫病[2-4]，給貂養殖造成了極大的影響。水貂阿留申病是由水貂阿留申病毒(Aleutian mink disease parvovirus，ADV，單鏈DNA病毒)引起的一種慢性消耗性疾病，主要特征為漿細胞增多，γ球蛋白增多和免疫復合物堆積[5,6]。水貂病毒性腸炎是由水貂腸炎病毒(mink enteritis parvovirus，MEV，單鏈DNA病毒)引起的急性、高度接觸性傳染病，主要臨床癥狀是強烈腹瀉[7,8]。水貂犬瘟熱是由犬瘟熱病毒(canine distempervirus，CDV，單鏈RNA病毒)引起的急性、熱性、高度接觸性傳染病[9,10]。臨床上這三種病混合感染現象愈發普遍，本試驗擬建立多重PCR檢測方法同時檢測ADV、MEV和CDV，為這三種疫病的單一或混合感染進行快速、準確的診斷。

1 材料和方法

1.1 病毒和樣品

水貂阿留申病毒(ADV)，貂腸炎病毒(MEV)，犬瘟熱病毒(CDV)及犬腺病毒(CAV)由本實驗室保存；臨床病料來自黑龍江省周邊發病貂場。

1.2 主要試劑與儀器

EasyPure Viral DNA/RNA Kit試劑盒、EasyScript One-Step RT-PCR SuperMix購自于TransGene Biological Science & Technology；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 購自于Axygen；pMD18-T載體購自寶生物(大連)工程有限公司；PCR儀購于Bio-Rad；電泳儀購于北京市六一儀器廠；凝膠成像分析系統購于Sagecreation；其他常規試劑為分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 引物的設計

依據GenBank收錄的ADV、MEV、CDV序列，根據各自保守序列應用Primer 5.0軟件設計三對特異性引物，均由哈爾濱博仕生物技術有限公司合成，序列如表1。

1.3.2 病毒DNA/RNA的提取

阿留申病毒的DNA、腸炎病毒的DNA及犬瘟熱病毒的RNA模板，按照EasyPure Viral DNA/RNA Kit試劑盒說明書進行提取。

1.3.3 PCR擴增

利用One-Step RT-PCR試劑盒，以提取的DNA和RNA為模板先進行單一PCR擴增，檢測引物間的特異性。又將三種模板混合，構建三重PCR擴增體系：R-mix 10 μL，E-mix 1 μL，模板1.5 μL，引物F各0.5 μL，引物R各0.5 μL，ddH2O 4.5 μL。擴增條件為：45℃反轉錄30 min；94℃預變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸 45 s，40個循環；72℃再延伸10 min。

1.3.4 多重PCR擴增條件的優化

根據設計的引物，計算Tm=(A+T)×2+(G+C)×4，再根據實際情況，設定溫度梯度PCR反應(梯度為58℃，57℃，56℃，55℃，54℃)，摸索合適的退火溫度。將三對引物等量混合，分別加入2、1.5、1、0.5 μL進行PCR擴增，摸索合適的引物濃度，確定最佳的多重PCR擴增條件。

1.3.5 特異性試驗

利用上述最佳多重PCR擴增體系和擴增條件，對水貂阿留申病毒、貂腸炎病毒、犬瘟熱病毒及犬腺病毒樣品進行擴增，驗證多重PCR擴增的特異性。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

注:A、B和C分別為ADV、CDV和MEV的PCR擴增結果；泳道1為陰性對照； M為DL 2000 marker；泳道2～4分別為MEV、CDV和ADV。圖1 單一PCR擴增結果Note.A,B,C were the amplification products of ADV, CDV and MEV PCR, respectively. Line 1 was negative control. M was DL 2000 marker. Lines 2-4 were MEV, CDV and ADV, respectively.Fig.1 Amplification products of single PCR test

1.3.6 敏感性試驗

將ADV、MEV、CDV擴增產物(片段分別為601 bp、205 bp和451 bp)與pMD18-T載體連接構建陽性質粒，利用紫外分光光度計測定濃度并換算成質粒拷貝數。將三種陽性質粒等量混合，并進行10倍系列稀釋，利用多重PCR進行擴增，檢測方法的靈敏性。

1.3.7 臨床樣品的檢測

利用構建的多重PCR方法，對黑龍江省周邊貂場疑似水貂阿留申病、貂病毒性腸炎和犬瘟熱感染的10份病料進行PCR檢測，并與單一PCR檢測結果比較。

2 結果

2.1 PCR擴增

單一和多重PCR的擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳后，三對引物分別擴增出各自的目的條帶，即ADV為601 bp，MEV為205 bp，CDV為451 bp(圖1)，無擴增交叉現象，多重PCR能同時擴增出三條片段大小差異明顯的條帶，與單一PCR擴增片段大小一致，不存在引物干擾現象(圖2)，測序結果表明擴增產物為三種病毒的特異性片段。

2.2 多重PCR擴增條件的優化

通過設置不同的退火溫度，優化多重PCR擴增條件，結果表明，在58℃、57℃、56℃、55℃和54℃溫度下均能擴增出3條目的條帶，但當退火溫度設為55℃時，擴增條帶最亮。通過加入不同體積的引物，優化多重PCR擴增條件，結果表明，在2 μL和1.5 μL引物下能擴增出3條目的條帶，1 μL的引物不能擴增出MEV目的條帶，0.5 μL的引物不能擴增，當加入1.5 μL體積的引物時，多重PCR擴增結果最佳(圖3)。在1.5%的瓊脂糖凝膠電泳下擴增條帶效果最佳。

注：泳道1～4分別為ADV、CDV、MEV、ADV+CDV+MEV；泳道5為5:陰性對照；M為DL 2000 Marker。圖2 三重PCR擴增結果Note.Line 1-4 was ADV, CDV, MEV, and ADV+CDV+MEV, respectively. Line 5 was the negative control; M was the DL 2000 marker.Fig.2 Amplification products of the multiplex PCR test

2.3 特異性試驗

在最佳的多重PCR擴增條件下，只能對含有ADV、CDV及MEV模板的樣品擴增出601 bp、451 bp、205 bp條帶，CAV樣品未擴增出目的條帶(圖4)。

2.4 敏感性試驗

將ADV、MEV、CDV與pMD18-T載體構建的質粒進行測序和序列比對分析，表明成功構建陽性質粒。利用紫外分光光度計測定質粒濃度并換算成拷貝數，ADV的拷貝數為每微升2.67×1010個，MEV的拷貝數為每微升3.02×1010個，CDV的拷貝數為每微升1.72×1010個。將混合的模板進行10倍系列稀釋，取不同濃度模板1.5 μL進行多重PCR擴增，結果是拷貝數為每微升105個時能同時擴增出三條目的條帶，拷貝數為每微升104個倍時只能擴增出ADV和MEV，不能擴增出CDV，拷貝數為每微升103個時不能擴增出目的條帶(圖4)。多重PCR最低檢測到ADV 每微升2.67×104拷貝、MEV每微升3.02×104拷貝和CDV 每微升1.72×105拷貝。

2.5 臨床樣品的檢測

對來自黑龍江省周邊貂場的10份病貂樣品進行多重PCR和單一PCR檢測，(圖5)，兩種PCR檢測結果均發現ADV感染病例有6例，MEV感染病例有5例，CDV感染病例有4例，表明多重PCR 與單一PCR檢測結果一致，可以用于臨床樣品檢測。另外，多重PCR檢測結果顯示三重感染率為20%，ADV和MEV感染率超過50%，臨床ADV、MEV和CDV混合感染較嚴重。

注：A為特異性分析；B為敏感性分析；泳道2、12為陰性對照；M為DL 2000 marker；泳道1、3分別為ADV+CDV+MEV、CAV；泳道4～11陽性質粒濃度分別為每微升107、106、105、104、103、102、101、100拷貝。圖4 特異性和敏感性分析Note.A,specificity analysis；B, sensitivity analysis；Lines 2 and 12 were negative control. M, DL 2000 marker. Lines 1 and 3 were ADV+CDV+MEV and CAV, respectively. Lines 4-11 were different concentrations of the positive recombinant plasmids at 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101, and 100 copies/μL.Fig.4 Specificity and sensitivity analysis

注：泳道1～10分別為臨床樣品1～10；M為DL 2000 Marker。圖5 臨床樣品檢測Note.Lines 1-10 were clinical samples 1-10. M was DL 2000 marker.Fig.5 Detection of the clinical samples

3 討論

多重PCR反應體系較為特殊，需在同一個反應條件和反應體系下加入多個模板和多對引物，因此擴增條件要求較高，需摸索最佳的擴增條件，以提高擴增反應的效率。影響擴增效率的主要因素有引物和退火溫度[11,12]等。在引物方面，需注意以下幾點：(1)引物間不存在互補結構及發卡結構[13]，排除引物干擾現象，提高引物的特異性擴增；(2)多條擴增產物片段大小差異明顯，在瓊脂糖凝膠電泳中可明顯區分；(3)引物間的Tm值和GC%含量相近，保證在同一退火溫度下能同時擴增出多條產物；(4)多重PCR擴增體系內，引物濃度直接影響擴增的結果，有必要設立引物濃度梯度摸索合適的引物濃度。在擴增溫度方面，退火溫度對擴增結果影響較大，需設立溫度梯度確定最佳的擴增條件。

水貂阿留申病、病毒性腸炎與犬瘟熱并稱影響水貂健康的三大疫病，臨床上多為混合感染[2,14]，其中水貂阿留申病毒和病毒性腸炎為DNA病毒，而犬瘟熱病毒為RNA病毒，由于三種病毒類型不一致，對多重PCR方法的構建要求較高。本試驗采用了DNA/RNA提取試劑盒和一步法擴增試劑盒，將DNA和RNA模板同時在一個擴增體系內擴增，縮短了樣品處理和擴增的時間，可更快地獲取到檢測結果，根據檢測結果及時地采取防控措施。本試驗設計的三對引物在擴增過程中不存在引物干擾現象，可同時擴增出三條目的片段，最佳的退火溫度為55℃；最佳引物體積為1.5 μL；三重PCR敏感性試驗表明可檢測到每微升2.67×104拷貝的阿留申病毒、每微升3.02×104拷貝的水貂腸炎病毒和每微升1.72×105拷貝的犬瘟熱病毒，與杜偉雄[15]的水貂阿留申病毒的敏感性檢測相比，敏感度提高了10倍。

多重PCR和單一PCR都具有相當高的敏感性，可以檢測出痕量的核酸模板。對于實驗動物貂的常規病原檢測，本實驗建立的多重PCR可同時檢測ADV、MEV及CDV三種病原，與單一PCR相比，大大降低了工作量，節約了檢測成本，可更快地給出檢測結果，及時采取相應的防治措施。有研究[16]報道多重PCR的靈敏度有所下降，但足以達到檢測的要求。本實驗所建立的三重PCR可在一次反應中對疑似ADV、MEV及CDV感染的水貂進行分子

生物學診斷，且快速、特異、簡便和靈敏，具有廣闊的應用前景。

[1] 張立垚，周學紅，王惠，等. 哥本哈根、赫爾辛基部分品種水貂皮十年拍賣數據分析 [J]. 野生動物學報，2017，1：110-114.

[2] 張卓. 水貂阿留申病毒分離鑒定及其致病性研究和診斷方法的建立 [D]. 東北農業大學，2015.

[3] 鐘世勛，遲珊珊，王振，等. 山東規模化養殖場毛皮動物多重感染病原學分析 [J]. 中國獸醫學報，2014，11：1770-1777.

[4] 潘德芹. 水貂多重感染的病原學分析及綠膿桿菌松花粉多糖佐劑滅活苗的研制 [D]. 山東農業大學，2014.

[5] Farid AH, Zillig ML, Finley GG, et al. Prevalence of the Aleutian mink disease virus infection in Nova Scotia, Canada [J]. Prev Vet Med, 2012,106: 32-40.

[6] Porter DD, Larsen AE, Porter HG. Aleutian disease of mink [J]. Adv Immunol,1980, 29: 61-86.

[7] 王洋，胡博，馬凡舒，等. 水貂病毒性腸炎研究進展 [J]. 特產研究，2016，8(3)：67-71.

[8] Mao Y, Su J, Wang J. Roles of three amino acids of capsid proteins in mink enteritis parvovirus replication [J]. Virus Res, 2016, 222: 24-28.

[9] 王宇菲，和彥良，孟相秋，等. 水貂犬瘟熱的流行、癥狀及預防 [J]. 山東畜牧獸醫，2016，11(3): 32.

[10] 莊金秋，梅建國，王金良，等. 水貂犬瘟熱病毒LD-1株的分離與鑒定 [J]. 中國畜牧獸醫，2014，9(4): 226-232.

[11] 何亞鵬，張琪，史懷平，等. 綿羊痘病毒、山羊痘病毒及羊口瘡病毒多重PCR檢測方法的建立和應用 [J]. 動物醫學進展，2017，19(3): 11-15.

[12] 王苗苗，張凡慶，王曼，等. 豬五種繁殖障礙性疫病病原體多重PCR的建立及初步應用 [J]. 動物醫學進展，2017，22(3): 27-31.

[13] 尹全，李憶，鄧強，等. 一種可同步檢測3種外源基因的多重PCR方法 [J]. 山西農業科學，2017，17(1): 37-40, 88.

[14] 潘德芹，朱瑞良，李奕芙，等. 水貂主要病原的分子生物學鑒定及多重感染的病原分析 [J]. 中國獸醫學報，2015，16(2): 218-224.

[15] 杜雄偉，李葉，胡傳偉. 檢測動物產品中水貂阿留申病毒和犬細小病毒復合PCR方法的建立和應用 [J]. 中國動物檢疫，2012，12(8): 43-45.

[16] 劉飛，張寶存，張曉華，等. 對蝦6種病毒多重PCR檢測方法的建立 [J]. 漁業科學進展，2014，19(1): 60-67.

EstablishmentandapplicationofamultiplexPCRassayfordetectionofAleutiandiseaseparvovirus,enteritisparvovirusandcaninedistempervirusinthemink

MA Qin， WANG Yuan-zhi， YAN Wen-zhuo， ZHAO Li-li， CHEN Hong-yan， LU Tao-feng*

(Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Laboratory Animal and Comprative Medicine,Harbin 100193, China)

ObjectiveAleutian disease, mink enteritis and canine distemper are the three major diseases affecting health of mink. This study intends to establish a multiplex PCR assay for simultaneously detecting of these three viruses.MethodsAccording to the conservative sequences reported in GenBank, three pairs of specific primers were designed to amplify the DNA templates of Aleutian mink disease parvovirus (ADV), mink enteritis parvovirus (MEV), and RNA templates of canine distemper virus (CDV), and optimized the amplifying conditions.ResultsThe specific objective strips of 601 bp (ADV), 205 bp (MEV) and 451 bp (CDV) were amplified simultaneously. The sensitivity test showed that the lowest nucleic acid detection limits were 2.67×104copies per μL for ADV, 3.02×104copies per μL for MEV, and 1.72×105copies per μL for CDV. The results of test of the clinical samples showed that the multiple PCR and single PCR assay were consistent.ConclusionsThe established multiplex PCR assay in this study can be used to rapidly detect the clinical samples of ADV, MEV and CDV single or mixed infections.

Multiplex PCR; Aleutian mink disease parvovirus; Mink enteritis parvovirus; Canine distemper virus

國家支撐計劃項目(2015BA107B02)。

馬芹(1990-)，女，碩士研究生，專業：預防獸醫學。E-mail： 542446515@qq.com

陸濤峰(1982-)，男，助理研究員，博士，研究方向：實驗動物與比較醫學。E-mail： taofenglu@126.com

R-33

A

1671-7856(2017) 12-0097-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.12.017

2017-04-20